1 academia de știinţe a moldovei secţia de știinţe medicale buletinul academiei de ştiinţe a moldovei

PARTICIPAREA CATEPSINEI L LA BIODEGRADAREA COLAGENULUI 
ÎN PROCESUL DE REGRESIE A CIROZEI HEPATICE EXPERIMENTALE
Victor Rîvneac, dr.h.în medicină, prof. univ., Valentin Gudumac, dr.h. în medicină, prof. 
univ., Nicolae Eşanu, dr. în medicină, prof. univ., Elena Rîvneac, dr. în biologie, conf. 
univ., USMF “Nicolae Testemiţanu”
Tradiţional s-a creat o atitudine pesimistă faţă de fi broza hepatică şi un timp îndelungat a fost 
unanim acceptat că, odată apărută, fi broza devine ireversibilă. Însă pe parcursul ultimilor decenii tot 
mai numeroşi cercetători îşi îndreaptă eforturile spre studierea ţesutul conjunctiv fi bros în ciroză ca 
subiect al degradării şi resorbţiei. 
În prezent posibilitatea regresiei cirozei hepatice şi restabilirii fi catului după afecţiunea supor-
tată este demonstrată experimental şi nu trezeşte îndoieli [12, 3, 16]. Revenirea la structura aparent 
normală a fi catului este, în anumite condiţii experimentale, impresionantă, cu dispariţia totală a exce-
sului de ţesut conjunctiv.
În numeroase investigaţii, aplicând metode histologice, histochimice şi biochimice, a fost de-
monstrat că şi modifi cările sclerotice avansate ale ţesutului hepatic, însoţite de o remodelare severă a 
structurii organului, pot fi  supuse unei regresii cu condiţia înlăturării radicale a cauzei ce a provocat 
maladia.  
În investigaţiile clinice biopsia hepatică a demonstrat că colagenul sporit este, de obicei, în între-
gime lizat în decursul însănătoşirii după hepatitele virale suportate sau după abţinerea de la utilizarea 
alcoolului în hepatitele alcoolice [12, 13]. Posibilitatea reversibilităţii leziunilor de fi broză hepatică 
prezintă un interes deosebit pentru clinică prin implicaţiile sale prognostice şi terapeutice.
Datele experimentale sugerează că reducerea excesului de colagen se realizează printr-un pro-
ces de resorbţie activă şi nu apare doar ca rezultat al sistării neoformaţiei fi brilare. În urma acestor 
investigaţii mecanismele resorbţiei ţesutului fi bros excesiv în fi cat au devenit subiectul principal al 
cercetărilor în problema reversibilităţii cirozei hepatice.
Actualmente este general acceptat conceptul, bazat pe datele experienţelor efectuate in vitro şi 
postulat de către Woessner J. [14], conform căruia etapa iniţială în degradarea matricei extracelulare 
(MEC) este un proces proteolitic extracelular, care se poate solda cu scindarea colagenului insolubil 
sub acţiunea colagenazei şi cu modifi cări fi ne ale glicoproteinelor asociate.  Fragmentele generate 
prin aceste atacuri proteolitice pot fi  fagocitate de către macrofage şi supuse ulterior prelucrării intra-
lizozomale. 
În prezent enzime-cheie în biodegradarea  MEC sunt considerate exo- şi endopeptidazele ma-
triceale (metalo-, serin-, cistein- şi aspartil-proteinazele) [1],  sintetizate de către celulele ţesutului 
conjunctiv, mediul de acţiune al său fi ind atât cel intracelular, cât şi cel extracelular [16, 17, 18].
Se  consideră că  circa 90% ale proteolizei intralizozomale se realizează pe baza activităţii co-
erente a endopeptidazelor cisteinice - catepsinelor B, H şi L. Aceste proteinaze manifestă in vitro o 

42
specifi citate  excepţională faţă de substratele proteice, în general, şi faţă de colagen, în special, efi ca-
citatea proteolizei realizate fi ind maximă la valori slab acide ale pH-ului. In vitro a fost demonstrată 
capacitatea proteinazelor cisteinice (în special, a catepsinelor B şi L) de a degrada atât componenţii 
colagenici, cât şi proteoglicanii şi la un pH neutru. A fost demonstrată capacitatea catepsinelor B şi 
L de a degrada colagenul tip IV, implicându-se, astfel, în liza membranelor bazale. Aceste proteinaze 
supun unei scindări hidrolitice şi aşa componente ale matricei extracelulare cum sunt laminina şi 
fi bronectina.
Catepsina L scindează colagenul insolubil la pH 3,5, de altfel, la acest pH activitatea specifi că 
a enzimei creşte de 5-10 ori peste cota atinsă de catepsina B. Efectul calitativ al catepsinei L asupra 
colagenului se bazează pe dezintegrarea peptidelor terminale, eliminând, de asemenea şi legăturile  
transversale.  
Se presupune că catepsina L în afara degradării intralizozomale a proteinelor şi peptidelor poate 
fi  implicată şi în processingul peptidelor biologic active [6], participă la procesul invaziei tumorilor 
maligne [10], induce creşterea locală a concentraţiei enzimelor ce scindează marticea extracelulară 
în infl amaţie [5]. Fermentul participă nemijlocit în spermatogeneză [7, 15] şi se implică în reglarea 
involuţiei glandei mamare după încetarea lactaţiei [4]. Se presupune, de asemenea, participarea catep-
sinei L în cascada proteolitică în apoptoză [10, 11]. După cum s-a demonstrat, catepsina L participă 
în procesele de osifi care endocondrală în normă şi patologie, precum şi deţine rolul-cheie în procesul 
de resorbţie a osului, fi ind enzima proteolitică principală responsabilă pentru degradarea colagenului 
în os [9].
Totuşi investigaţiile privind participarea diferenţiată şi rolul catepsinelor lizozomice în degra-
darea colagenului în fi cat s-au dovedit a fi   puţin numeroase, fapt ce ne-a determinat să realizăm un 
studiu al particularităţilor de implicare a catepsinei L în resorbţia ţesutului fi bros în fi cat în procesul 
de regresie a cirozei hepatice experimentale. Studierea  activităţii sistemelor enzimatice, implicate 
în liza ţesutului conjunctiv pe parcursul regresiei modifi cărilor patologice din fi cat, va permite elu-
cidarea mecanismelor biochimice, care stau la baza fenomenului reversibilităţii  fi brozei (cirozei) 
hepatice.
Scopul studiului l-au constituit determinarea activităţii proteinazei cisteinice – catepsinei L - în 
tesutul hepatic cirozat şi în procesul de regresie a cirozei hepatice experimentele, relevarea surselor 
celulare ale catepsinei L în fi cat şi studierea implicării catepsinei L în degradarea intra- şi/sau extra-
celulară a colagenului din fi cat în procesul de regresie a cirozei experimentale.
Materiale şi metode. Fibroza hepatică a fost indusă la animale de laborator  (şobolani albi mas-
culi) prin metoda clasică de injectări subcutanante bisăptămânale a soluţiei de 50% de  tetraclorură de 
carbon (CCl
4
) în ulei de măsline în doză de 3,0 ml la kilocorp  în decurs  de 13 săptămâni.
Prelevarea materialului investigaţional s-a efectuat la etapa  dezvoltării maxime a cirozei hepa-
tice şi pe parcursul primei luni a perioadei de regresie a cirozei (la 7, 14, 21, 30 de zile după ultima 
injectare a noxei hepatotrope) şi după 2 luni de regresie. Materialul investigaţional a fost prelevat din 
lobul drept al fi catului.  
Pentru investigaţii s-au utilizat metode histologice, electron-histochimică şi biochimice de ex-
plorare.
Pentru cercetările histologice mostrele de fi cat se fi xau în formalină neutrală de 10% şi se colo-
rau cu hematoxilină-eozină şi după Van-Ghizon. Investigaţiile biochimice s-au produs în omogenat 
de fi cat.
Procedeul de determinare biochimică a activităţii catepsinei L este bazat pe hidroliza enzima-
tică a azocazeinei [2].  Procedeul de determinare a hidroxiprolinei (HYP) – aminoacidului specifi c 
în exclusivitate moleculei de colagen,  este bazat pe proprietatea cloraminei B de a oxida HYP şi pe 
condensarea ulterioară a produselor oxidării cu p-dimetilaminobenzaldehidă. 
Detectarea electron-histochimică a activităţii catepsinei  L s-a realizat în conformitate cu pro-
cedura descrisă de Smith şi van Frank (1975). În calitate de substrat s-a utilizat Z-Phe-Arg-4M
βNA 
(BACHEM). Prin metoda electron-histochimică  s-au examinat prelevatele din fi catul a 25 de anima-
le.
Rezultate şi discuţii. Gradul de fi brozare a fi catului la diferite termene investigaţionale a fost 

43
apreciat prin intermediul examenului histologic, pornind de la  existenţa unei corelaţii strânse între 
vizualizarea histologică a conţinutului de colagen şi gradul de avansare a fi brozei hepatice. Prelevate-
le din fi catul animalelor experimentale, sacrifi cate în decursul primelor patru săptămâni după sistarea 
injectărilor de CCl4,  demonstrează o subţiere marcantă a straturilor de colagen, ceea ce indică deru-
larea în acest interval de timp a unui proces de catabolizare colagenică de o intensitate foarte înaltă. 
Procesul se fi naliza, în principal, după două luni de la încetarea acţiunii factorului cirogen.
 Observaţiile realizate în baza examenului histologic sunt confi rmate şi precizate de rezulta-
tele dererminării biochimice a conţinutului de hidroxiprolină (HYP) în fi cat. Din tabel desprindem 
că intoxicaţia cronică cu CCl4 s-a soldat cu sporirea cantităţii de hidroxiprolină în fi cat şi la etapa 
dezvoltării maxime a cirozei conţinutul aminoacidului a constituit 280% (P<0,001) în comparaţie cu 
valorile specifi cate pentru fi catul neafectat.  Astfel, gradul de avansare a procesului patologic în fi cat, 
atins în experienţele noastre,  a fost caracterizat de acumularea unei cantităti de colagen, care aproape 
de trei ori a depăşit conţinutul macromoleculei în normă.
Concomitent, relevăm sporirea activităţii tisulare a proteinazei cisteinice studiate. Îndicii enzi-
moactivităţii ai catepsinei L în fi cat la dezvoltarea maximă a cirozei, deşi nu manifestă o majorare 
spectaculoasă, se deosebesc statistic concludent de valorile lotului martor (117%, P<0,05) (tab.1). 
În  perioada ce urmează imediat după încetarea injectărilor de CCl
4
 efectul nociv al toxinei se 
menţine, sinteza colagenică prevalând asupra scindării sale. Acest fapt se confi rmă prin determinarea 
unei cantităţi şi mai impresionante de hidroxiprolină, ce depăşeşte nivelul înregistrat în ciroză şi către 
termenul de 7 zile de regresie înregistrează maximumul concentraţiei sale în ţesutul hepatic – 336%, 
P<0,001.
Simultan remarcăm  şi sporirea activităţii catepsinei investigate, care la 7 zile de regresie de 
asemenea atinge primul maxim de activitate. Astfel, nivelul funcţional al catepsinei L ajunge să de-
păşească cu 70% (P<0,001) nivelul de referinţă.  Acestei amplifi cări pregnante a proprietăţilor hidro-
litice ale ţesutului hepatic se datorează, probabil, micşorarea  semnifi cativă a cantităţii de colagen 
hepatic, depistate la următorul termen investigaţional. Astfel, la 14 zile de regresie conţinutul de HYP 
în fi cat pierde 25% (P<0,01) din valorile specifi cate la termenul precedent.  Amploarea proceselor 
hidrolitice, detectată în fi cat la această etapă, este asigurată, probabil, de enzimele provenite din lizo-
zomii celulelor mezenchimale, care există din abundenţă în tesutul conjunctiv dezvoltat excesiv.
 
Tabelul 1
 Conţinutul de hidroxiprolină şi activitatea catepsinei L în ţesutul hepatic la diferite etape de 
regresie a cirozei  hepatice experimentale (M
±m )
Condiţii de experiment
Hidroxiprolina
μmol/g
Catepsina L
nM/s
⋅g
Valorile martor
3,97
±0,28
(100%)
0,385
±0,012
(100%)
Ciroza
11,13
±0,77*
(280%)
0,448
±0,022*
(117%)
7 zile de regresie
13,34
±0,80***
(336%)
0,656
±0,033***
(170%)
14 zile de regresie
10,06
±0,62***
(254%)
0,494
±0,013***
(128%)
21 zile de regresie
10,48
±0,64***
(264%)
0,595
±0,009***
(155%)
30 zile de regresie
8,68
±0,45***
(219%)
0,493
±0,044*
(128%)
60 zile de regresie
7,14
±0,52***
(180%)
0,425
±0,054*
(110%)
 Notă: *   diferenţă statistic semnifi cativă de lotul  martor, P
<0,05
           **  P
<0,01;    *** 
P
<0,001.

44
Catabolizarea intensă a structurilor conjunctive se soldează, pe de o parte, cu reducerea im-
portantă a cantităţii de ţesut fi bros în fi cat, iar, pe de altă parte, se micşorează şi numărul celulelor 
mezenchimale implicate în furnizarea enzimelor fi brolitice. Scăderea temporară a activităţii  catepsi-
nei L după 14  zile de regresie, care la acest termen depăşeşte valorile martor doar cu 28% (P<0,001), 
se datorează, posibil, micşorării numărului de macrofagi, fi broblaste şi altor celule ale ţesutului con-
junctiv, care are loc în acestă perioadă, precum şi sintezei enzimatice insufi ciente în hepatocitele 
neafectate, existente la acestă etapă în tesutul hepatic. 
Cele menţionate explică stagnarea relativă a procesului de resorbţie a matricei extracelulare 
în intervalul dintre 14 - 21 zile de regresie, deduse pe baza determinărilor cantitative ale hidroxi-
prolinei hepatice. Astfel, la termenul de 21 de zile de regresie fi xăm o cantitate a aminoacidului, 
care constitue 264% (P<0,001) din nivelul referenţial  şi nu se deosebeşte concludent de indicii 
termenului anterior.
Finisarea formării sistemului lizozomal în hepatocitele noi, apărute drept rezultat al  proceselor 
proliferative din ţesutul hepatic, are loc numai după circa 3 săptămâni de regresie a cirozei fi catului, 
ceea ce se manifestă prin sporirea activităţii catepsinei L la termenul de 21 de zile după ultima injecta-
re a noxei hepatotrope, când nivelul funcţional al enzimei atinge al doilea maxim de activitate – 155% 
(P<0,001). Astfel,  în ţesutul hepatic se produce o nouă amplifi care a potenţialului hidrolitic, fapt ce 
se manifestă print-o micşorare semnifi cativă a cantităţii de hidroxiprolină în fi cat la 30 de zile de la 
abolirea intoxicaţiilor, iar investigaţia efectuată la 60 de zile de regresie demonstrează reducerea de 
două ori a conţinutului de hidroxiprolină hepatică  comparativ cu indicii maximali, înregistraţi la 7 
zile post-cirotice.
Prezenţa a două maxime în dinamica de activitate a enzimei cercetate este, incontestabil, o 
manifestare a caracrerului fazic al procesului studiat, precum şi a implicării în procesele fi brolitice 
atât a sistemelor enzimatice lizozomice ale elementelor celulare ale ţesutului conjunctiv (mai ales la 
etapele iniţiale), cât şi a hepatocitelor (cu precădere la etapele mai avansate ale procesului de regresie 
a cirozei).
Analiza corelaţională a relevat un grad înalt de corelaţie pozitivă între dinamica de activitate 
a enzimei investigate – catepsina L cu modifi cările nivelului de hidroxiprolină tisulară. Aceste date 
atestă faptul implicării directe a acestei enzime în degradarea ţesutului conjunctiv în fi cat.
Detectarea  electron-histochimică  a  activităţii  catepsinei L în fi cat  în     procesul de regre-
sie a cirozei.  Până în prezent localizarea activităţii catepsinei L în fi cat nu a fost determinată. În unica 
lucrare, consacrată studierii localizării enzimei în fi catul normal, efectuată la nivel de microscopie 
optică (imunomorfologic), enzima a fost detectată în hepatocite şi celulele Kupffer [8].  
În lucrarea dată, cu scopul de a elucida participarea catepsinei L în procesele de resorbţie a ţe-
sutului conjunctiv în fi cat, am  realizat investigarea histochimică la nivel ultrastructural a distribuţiei 
catepsinei L în fi catul normal şi la anumite etape de regresie a cirozei. Am studiat distribuirea enzimei 
în fi cat în normă, precum şi la a 7 şi 21 zi după încetarea intoxicaţiilor cirogene. Termenele indicate 
au fost stabilite în baza investigaţiilor biochimice ale activităţii enzimei. 
În funcţie de gradul de activitate a enzimei produsul reacţiei la catepsina L în fi catul normal 
a fost prezent fi e sub aspectul granulelor mărunte solitare, fi e sub aspectul unor conglomerate 
mai mult sau mai puţin omogene de densitate diferită. O reacţie extrem de intensă s-a remarcat 
în lizozomii celulelor Kupffer. În hepatocite produsul  reacţiei a fost detectat în unii lizozomi 
şi în diverşi corpusculi membranoşi  (myelin-like).  S-a remarcat, de asemenea, o activitate 
extracelulară neînsemnată a catepsinei L. Granule solitare ale produsului de reacţie se detectau 
pe microvilii hepatocitelor în spaţiile Disse. Am revelat activitatea catepsinei L şi în lizozomii 
celulelor endoteliale.
Conform datelor obţinute, catepsina L în fi catul normal se localizează în lizozomii hepatocite-
lor, celulelor Kuppfer şi entodeliocitelor, precum şi extracelular  pe microvilozităţile hepatocitelor 
[19].
Particularitatea pregnantă, pe care am urmărit-o în timpul examenelor electron-histochimi-

45
ce asupra fi catului în procesul de regresie a cirozei, este secreţia catepsinei L din hepatocite şi 
elementele celulare ale ţesutului conjunctiv spre spaţiul intercelular. Despre aceasta mărturisesc 
cumulaţiile de produs al reacţiei în spaţiile intercelulare – pe citolemă şi pe fi brilele de colagen 
adiacente. Reacţia intensă la catepsina L în spaţiile intercelulare s-a putut urmări în ambele termene 
de cercetare. 
De remarcat faptul că termenele investigaţionale (7 şi 21 zile de regresie) se deosebeau esenţial 
prin ponderea elementelor celulare, ce secretau enzima spre spaţiul extracelular. Astfel, la termenul 
de 7 zile de regresie, practic, toată catepsina L extracelulară  era secretată de către celulele septurilor 
fi broase (macrofage şi fi broblaste), prezente în număr mare datorită cantităţii excesive de ţesut con-
junctiv în fi catul afectat de ciroză (fi g.1, 2). Secreţia enzimei de către hepatocite era infi mă.
 
Fig. 1. 7 zile de regresie a cirozei. Produs al 
reacţiei la catepsina L extracelular  pe citolema 
macrofagului  şi pe fi brile de colagen învecinate. 
x20000
   
Fig.2. 7 zile de regresie a cirozei. Spaţiul Disse. 
Produs al reacţiei  la catepsina L  extracelular pe 
citolema fi broblastului şi pe fi brile de colagen  
învecinate. x15000
La termenul de 21 zile de regresie produsul de reacţie la catepsina L, din contra, se evidenţiază 
preponderent în preajma hepatocitelor.  Cantităţi considerabile de produs al reacţiei sub formă de gra-
nule solitare sau de conglomerate granulare mai mult sau mai puţin omogene se detectau dispuse pe 
citolema hepatocitelor, pe fi brilele de colagen adiacente sau în profunzimea stratului fi brotic (fi g.3).  
Elementele celulare conjunctive, numărul cărora s-a redus considerabil odată cu subţierea straturilor 
de ţesut conjunctiv, secretau enzimă activă în cantităţi mult mai mici.  
De remarcat faptul că pe citolema celulelor Kupffer şi pe fi brilele de colagen adiacente lor pro-
dusul de reacţie la catepsina L se detecta atât la a 7 zi, cât şi la a 21 zi de regresie (fi g.4).
La ambele termene de cercetare pe lângă secreţia catepsinei L în spaţiul extracelular are loc 
fagocitarea şi liza intracelulară a colagenului de către macrofage şi fi broblaste. 
În citoplasma majorităţii macrofagelor se disting vacuole, conţinând fi brile fragmentate de co-
lagen. În unele din aceste vacuole se detecta produsul reacţiei la catepsina L, ceea ce indică originea 
lor fagocitară (fi g.5).
Ca şi în macrofage, la ambele termene de cercetare, în citoplasma multor fi broblaste se observă 
diferite cantităţi de vacuole şi fagolizozomi, ce conţin fragmente fagocitate de fi brile de colagen la 
diferite etape de degradare. În  unele din aceste vacuole se detecta produsul reacţiei la catepsina L, 
ceea ce arată originea fagocitară a acestor vacuole (fi g.6).
De subliniat faptul că atât macrofagele, cât şi fi broblastele antrenate în procesul de fagocitoză 
şi liză intracelulară a colagenului manifestau şi o oarecare activitate colagenolitică extracelulară, fapt 
demonstrat de prezenţa produsului de reacţie la catepsina L sub formă de granule solitare pe citolema 
celulelor şi pe fi brilele de colagen adiacente (fi g.5,6).
Mostrele de referinţă nu conţineau produsul reacţiei la catepsina L . 

46
   
Fig.3. 21 de zile de regresie a cirozei. Spaţiul 
Disse. Reacţie intensă  la catepsina L 
extracelular pe fi brile de colagen 
adiacente hepatocitului şi în profunzimea
septului fi bros. x30000
Fig.4. 21 de zile de regresie a cirozei. Produsul
reacţiei la catepsina L pe citolema
celulei Kupffer  şi pe fi brile de collagen
situate între celula Kupffer şi hepatocit.
x30000
Fig.5. 21de zile de regresie a cirozei.  În 
citoplasma macrofagului  vacuole  cu
colagen  conţinând produsul reacţiei la 
catepsina L. De asemenea,  produsul 
reacţiei se depistează extracelular pe 
citolemă şi pe fi brilele adiacente de 
colagen .  x20000
Fig.6. 21de zile de regresie a cirozei
citoplasma fi broblastului  multiple 
vacuole cu colagen conţinând produsul 
reacţiei la catepsina L. Unele vacuole 
se contopesc. De asemenea produsul 
reacţiei se depistează extracelular pe
citolemă şi pe fi brilele adiacente de 
colagen.  x20000
Un aspect, credem, important este distribuţia produsului reacţiei nu doar pe citolema hepatoci-
telor, a macrofagelor, fi broblastelor şi fi brilele de colagen adiacente, dar şi în profunzimea septurilor 
fi broase. Activitatea enzimei se depista atât la nivelul fi brilelor colagenice destrămate, cât şi pe cele 
aparent vizual intacte. S-ar putea presupune că la acţiunea catepsinei L se expune, practic, tot colage-
nul, indiferent de situarea sa, şi că nu doar colagenaza, dar şi alte proteinaze pot iniţia dezintegrarea 
extracelulară a colagenului.
Nouă ne-a reuşit să demonstrăm in vivo antrenarea catepsinei L în procesele de degradare ex-
tracelulară a colagenului din fi cat în procesul de regresie a cirozei.  Putem presupune  că degradarea 
extracelulară a colagenului din fi cat în procesul de regresie a cirozei este mai importantă decât cea 
intracelulară (sau cel puţin, nu este mai puţin semnifi cativă decât ultima) şi că rolul esenţial în acest 
proces ar reveni enzimelor lizozomale ale hepatocitelor.
Este absolut clar că secreţia de hidrolaze lizozomale deţine un rol important în catabolizarea 
ţesuturilor conjunctive, precum şi în relaţiile celulei cu matricea extracelulară, astfel constituind un 
mecanism de asigurare a homeostaziei structurale.
Ar fi  foarte difi cil de apreciat aportul diferitor elemente celulare la degradarea matricei extra-

47
celulare hepatice. În fi catul cirozat celulele ţesutului conjunctiv prevalează esenţial asupra hepato-
citelor. În acest caz contribuţia elementelor celulare mezenchimale în resorbţia ţesutului conjunctiv 
pare a fi  destul de considerabilă, în special pe parcursul primelor  săptămâni ale perioadei de regresie.  
Probabil, la etapele ulterioare, când numărul celulelor mezenchimale se reduce esenţial (iar al hepa-
tocitelor se majorează), se atenuează şi rolul lor în procesul dat, iar degradarea ţesutului conjunctiv se 
realizează în continuare cu implicarea preponderent a hepatocitelor.
Aşadar, posibilitatea reversiunii  modifi cărilor cirotice din fi cat se afl ă în strictă dependenţă de 
activitatea lizozomală a hepatocitelor şi a celulelor mezenchimale şi, în primul rând, de gradul de 
persistenţă a parenchimului, de capacitatea sa de regenerare, precum şi de posibilitarea restabilirii 
sistemului său lizozomal. 
Concluzii
În perioada de regresie a cirozei hepatice experimentale se produce sporirea pregnantă a ac-
1. 
tivităţii proteinazei cisteinice - catepsinei  L în fi cat,  dinamica activităţii enzimei manifestând un 
caracrer fazic şi un grad înalt de corelaţie cu modifi cările nivelului de hidroxiprolină tisulară, ceea ce 
atestă implicarea directă a acestei enzime în degradarea colagenului în fi cat.
Catepsina L în fi cat se localizează în lizozomii hepatocitelor, celulelor Kupffer şi endotelio-
2. 
citelor.
În procesul de regresie a cirozei catepsina L este secretată de către hepatocite, macrofage şi 
3. 
fi broblaste spre spaţiul extracelular pentru a se angaja nemijlocit în procesul de degradare extracelu-
lară a colagenului.
Catabolizarea extracelulară intensă a colagenului din fi cat în procesul de regresie a cirozei 
4. 
prin intermediul catepsinei L are loc cu concursul major al hepatocitelor, pe când liza intracelulară a 
colagenului este realizată de către macrophage şi fi broblaste cu participarea activă a catepsinei L.
Bibliografi e selectivă
Barrett A.J.,  
1. 
Introduction: the classifi cation of proteinases // Protein Degradation in Health and 
Disease, Amsterdam-Oxford-New-York, 1980, p.1-13.  
Barrett A.J., 
2. 
Cathepsin B and other thiol proteinases // Proteinases in Mammalian Cell and Tissu-
es, Amsterdam; New-York; Oxford,  1977, p. 181-208.     
Benyon R.C., Iredale J.P., 
3. 
Is liver fi brosis reversible? // Gut, vol.46,  2000, p. 443-446. 
Burke M., Hutter D., Reshamwala R., Knepper J., 
4. 
Cathepsin L plays an active role in involution 
of the mouse mammary gland// Dev Dyn, vol.227, nr. 3, 2003, p.315-322. 
Fiebiger E., Maehr R., Villadangos J. et al., 
5. 
Invariant chain controls the activity of extracellular ca-
thepsin L. // J.Exp.Med, vol. 196, nr. 9, 2002, p. 1263-1269. 
Furuhashi M., Nakahara A., Fukutomi H. et al., 
6. 
Immunocytochemical localization of cathepsins B, H 
and L in rat gastro-duodenal mucosa. // Histochemistry, vol.95, nr. 3, 1991, p.231-239. 
Gye M., Kim S., 
7. 
Expressin of cathepsin L in human testis under diverse infertility conditions. // Arch. 
Androl, vol.50, nr 3, 2004, p.187-191. 
Ii K., Hizawa K., Kominami E. et al., 
8. 
Different immunolocalizations of cathepsins B, H and L in the 
liver // J.Histochem.Cytochem, vol. 33, nr. 11, 1985, p.1173-1175. 
Kakegawa H., Nikawa T., 
9. 
Patricipation of cathepsin L on bone resorption // FEBS Letters, vol.321, 
nr. 2, 1993, p. 247-250. 
Levicar N., Dewey R., Bates T. et al., 
10. 
Selective suppression of cathepsin L by antisense cDNA impai-
re human brain tumor cell invasion in vitro and promotes apoptosis. // Cancer Gene Ther, vol.10, nr. 2, 2003, 
p.141-151. 
Michallet M., Saltel F., Flachar M. et al., 
11. 
Cathepsin-dependent apoptosis triggered by supraoptimal 
activation of T lymphocytes: a possible mechanism of high dose tolerance. // J.Immunol, vol.172, nr. 9, 2004, 
p. 5405-5414. 
Perez-Tamayo R., 
12. 
Cirrhosis of the liver: a reversible disease? // Pathol. Ann, vol. 14, 1979, 
p.183-213. 
Rojkind M., Dunn M., 
13. 
Hepatic fi brosis // Gastroenterology, vol.76, nr. 4, 1979, p. 849-863. 
Woessner J.F., 
14. 
Biological mechanisms of collagen degradation // Treatise on Collagen, New York, 
vol.2, part B, 1968, p.253-330.

48
Wright W., Smith L., Kerr C., Charron M., 
15. 
Mice that express enzymatically inactive cathepsin L ex-
hibit abnormal spermatogenesis. // Biol. Reprod, vol.68, nr. 2, 2003, p. 680-687. 
Рывняк  В.В., 
16. 
Механизмы  инволюции  экспериментального  цироза  печени:  Автореф.  дис.… 
докт.мед.наук, Москва, 1990.  
Рывняк  В.В., 
17. 
Механизмы  резорбции  коллагена  при  инволюции  цирроза  печени // Архив 
патологии,  № 2, 1987, с.37-44. 
Рывняк В.В. 
18. 
Механизмы резорбции коллагена при послеродовой инволюции матки //  Архив 
патологии,  № 1,  2001, с.32-35. 
Рывняк В.В.,  Рывняк Е.И., Тудос Р.В., 
19. 
Электронно-гистохимическая локализация катепсина  
L в печени  // Бюллетень  экспериментальной биологии и медицины, т.137, № 1, 2004, с.104-105.
Rezumat
Aplicând metode biochimice şi electron-histochimice, a fost studiată activitatea proteinazei cisteinice ca-
tepsinei L în fi catul afectat de ciroză şi în perioada de regresie a cirozei la şobolani.  S-a determinat o activitate 
sporită a catepsinei L în ciroza hepatică, fi ind în scădere pe parcursul perioadei de regresie, precum şi un grad 
înalt de corelaţie între activitatea enzimei şi nivelul hidroxiprolinei în fi cat. Electron-histochimic activitatea ca-
tepsinei L a fost detectată în fagolizozomii celulelor Kupffer şi fi broblastelor, ce conţineau fi brile fragmentate 
de colagen. De asemenea, activitatea enzimei a fost detectată pe plasmalema hepatocitelor, celulelor Kupffer şi 
fi broblastelor, precum şi pe fi brilele de colagen adiacente. Activitatea extracelulară a catepsinei L indică că în 
afară de proteoliza intracelulară, enzima participă şi în degradarea extracelulară a colagenului, fi ind secretată 
în spaţiul extracelular de către hepatocite, macrofage şi fi broblaste.
Summary
The activity of cysteine proteinase cathepsin L was investigated biochemically and electron-histoche-
mically in cirrhotic rat liver and during the recovery from hepatic cirrhosis. It was determined an increase of 
cathepsin L activity in cirrhosis and a decrease during the recovery period, and a high correlation between 
the enzyme activity and hydroxyproline level in liver. Electron-histochemically the activity of cathepsin L 
was revealed in the Kupffer cells and fi broblast phagolysosomes containing fragments of collagen fi brils. We 
also found the enzyme activity on the hepatocyte, Kupffer cell and fi broblast plasmalemma and on adjacent 
collagen fi brils. The detected extracellular activity of cathepsin L suggests that in addition to the intracellular 
proteolysis, cathepsin L is secreted by hepatocytes, macrophages and fi broblasts in the intercellular space and 
can take part in the extracellular collagen degradation.
MODIFICĂRILE INTENSITĂŢII OXIDĂRII PEROXIDICE A LIPIDELOR  
INDUSE DE CARNOZINĂ ŞI COMPLEXUL CARNOZINĂ-ZN 
ÎN ŢESUTUL OSOS ŞI ÎN SERUL ŞOBOLANILOR 
Olga Tagadiuc, dr. în medicină, conf., cercet. ştiinţ. superior,
USMF “Nicolae Testemiţanu”
Implicarea radicalilor liberi ai oxigenului, oxidării peroxidice a lipidelor (POL) şi a sistemului 
antioxidant în mecanismele patogenice ale apariţiei şi dezvoltării maladiilor osteoarticulare (osteo-
porozei, osteoartrozei, a artritei reumatismale etc.) a fost atestată de numeroase studii de ultimă oră 
[1, 5], ce sugerează necesitatea explorării unor remedii antioxidante cu proprietăţi osteotrope şi care 
ar limita efectele nocive ale radicalilor liberi.
Carnozina incontestabil este un antioxidant important, ce neutralizează radicalii liberi prin in-
termediul restului histidinei din componenţa sa [7]. Totodată, compusul în stare nativă şi în complexe 
cu diverşi cationi (zinc, magneziu, mangan, cupru) manifestă efecte osteomodulatoare – infl uenţează 
proliferarea celulelor ţesutului osos, sinteza proteinelor şi a ADNului, activitatea fosfatazelor alcalină 
şi acidă etc. [2, 3, 6].  
Procesele POL sunt activ studiate în ţesuturile articulare - cartilaj, sinovie, lichid sinovial, dar, 
practic, nu există date despre intensitatea POL şi nivelul produşilor POL în ţesutul osos, majoritatea 
cercetărilor în patologiile osteoarticulare fi ind axate pe evaluarea cantităţii lor sangvine [4]. De ase-

49
menea, nu  există studii ce relevă corelaţiile dintre intensitatea POL în ţesutul osos şi serul sangvin, 
ce ar permite a stabili corectitudinea extrapolării evaluării POL în ser asupra intensităţii procesului 
în ţesutul osos. 
Scopul studiulu a fost cercetarea intensităţii POL în ţesutul osos şi  a corelaţiilor ei cu inten-
sitatea POL în serul sangvin al şobolanilor sănătoşi, precum şi elucidarea infl uenţei carnozinei şi a 
complexului carnozină-Zn asupra acestor procese.
Materiale şi metode. Experienţele au fost efectuate pe 26 de şobolani albi fără pedigriu cu masa 
corpului de 200-270g. Animalele au fost divizate în trei grupuri:
Lotul I -  martor, includea 14 şobolani intacţi.
• 
Lotul II – 6 şobolani, cărora li s-a administrat 3 zile consecutiv carnozină în doză de 0,1 
• 
mM/kg masă corporală.
Lotul III – 6 şobolani, cărora li s-a administrat 3 zile consecutiv complexul carnozină-Zn în 
• 
doză de 0,1 mM/kg masă corporală.
Animalele au fost sacrifi cate sub narcoză uşoară cu eter sulfuric, prin decapitare, la 24 ore după 
ultima administrare a biopreparatelor. S-au extras oasele femurale. Măduva osoasă a fost înlăturată 
prin spălări repetate cu soluţie 0,9% NaCl.  Ulterior oasele femurale s-au triturat până la starea de 
pulbere în azot lichid.
Intensitatea POL s-a apreciat după cantitatea hidroperoxizilor iniţiali, intermediari şi  fi nali 
(HPLi, HPLm, HPLf), prin procedeul descris de V.A.Kostiuc şi coaut. (1984). Rezultatele obţinute au 
fost evaluate statistic conform criteriului t-Student, criteriului neparametric z-Sign şi coefi cientului de 
corelaţie r, cu ajutorul programului STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc, 2001).
Rezultate şi discuţii. S-a atestat că procesele POL în ţesutul osos al şobolanilor sănătoşi au o 
intensitate deosebit de mare (tab.1), cu prevalenţa cantitativă a HPL în faza hexanică, comparativ cu 
cea hidroalcoolică. Astfel, cantitatea HPLi în faza hexanică o depăşeşte pe cea din faza hidroalcoolică 
cu 74 % (p<0,01), a HPLm – cu 82 % (p<0,01), iar a celor fi nali cu 72 % (p<0,001). Totodată, rapor-
tul dintre cantităţile HPL în ambele faze este similar, cantitatea cea mai mare revenind HPLi şi cea 
mai mică HPLf. Rezultatele obţinute sugerează că în ţesutul osos procesele POL din compartimentul 
hidrofob sunt mai intense, fi ind infl uenţate mai pronunţat lipidele nepolare. 
Cantităţile HPLi şi HPLm în ambele faze sunt corelate pozitiv cu cantitatea de HPLf (r=0,68, 
p<0.001 şi r=0,52, p<0,01 – pentru faza hexnică;  r=0,86, p<0,0001 şi r=0,55, p<0,001 pentru faza 
hidroalcoolică). Corelaţia relevă caracterul în lanţ al oxidării peroxidice a lipidelor. De asemenea, 
există o corelaţie pozitivă dintre HPLi ai fazei hexanice cu HPLi, HPLm şi HPLf din faza hidro-alco-
olică (r=0,59, p<0,01; r=0,65, p<0,001; r=0,37, p<0,05), ce confi rmă unitatea proceselor peroxidice 
în lipidele ţesutului osos indiferent de caracterul compusului – polar sau nepolar.
Tabelul 1
Cantitatea hidroperoxizilor iniţiali, intermediari şi fi nali, în ţesutul osos şi în serul şobolanilor 
intacţi (un.conv./1 g ţesut osos)
Lotul
martor 
Produşii POL, faza hexanică
Produşii POL, faza hidroalcoolică
HPLi
HPLm
HPLf
HPLi
HPLm
HPLf
Ţesut 
osos 
44,25±10,7
39,42±9,7
7,75±1,4
11,50±4,1**
7,03±3,0**
2,14±0,41***
Ser 
sangvin 2,532±0,1
##
2,094±0,1
###
0,525±0,05
###
2,962±0,07**,
#
1,885±0,05*,