B. 12 Memeli eritrosit mikroçEKİrdekte in vivo (canli organizmada) -mutajenite testi YÖntem

B.12 MEMELİ ERİTROSİT MİKROÇEKİRDEKTE IN VIVO (CANLI ORGANİZMADA) -MUTAJENİTE TESTİ
1. YÖNTEM
Bu yöntem OECD TG 474, Memeli Eritrosit Mikroçekirdek Testi (1997)’nin tekrarıdır.
1.1 Giriş
Memeli in vivo mikroçekirdek testi, eritroblastların (bir alyuvar tipi) mitotik düzeneğinin veya kromozomların test maddesiyle uyarıldığında ortaya çıkacak hasarları hayvanların, genellikle de kemirgenlerin kemik iliği ve/veya çevresindeki kan hücrelerinden alınan örneklerin analiz edilerek tespit edilmesi için kullanılır.
Mikroçekirdekler içeren yalıtkan kromozom parçalarının veya tam kromozomların oluşmasıyla sonuçlanan mikroçekirdek testinin amacı sitogenetik hasara neden olan maddeleri belirlemektir.
Bir kemik iliği eritroblastı polikromatik eritrosit geliştirdiğinde, esas çekirdek çıkarılır, oluşan mikroçekirdek arkada, aksi takdirde çekirdeksiz sitoplazmada kalabilir. Mikroçekirdeklerin gözle görülmesi, bu hücrelerde esas çekirdek olmadığından kolaylaştırılmıştır. Muamele edilen hayvanlardaki mikroçekirdekli polikromatik eritrosit sıklığındaki artış uyarılmış kromozom hasarlarının göstergesidir.
Bu testte kemirgenlerin kemik ilikleri kullanılır çünkü polikromatik eritrositler bu dokuda üretilirler. Periferal kandaki mikroçekirdekli olgunlaşmamış (polikromatik) eritrositlerin ölçümü, dalağın mikroçekirdekli eritrositleri uzaklaştırmadaki yetersizliğinin gösterildiği veya yapısal veya sayısal kromozom aberasyonlarına neden olan ajanları tayin edecek duyarlılığa sahip türlerde aynı şekilde kabul edilir. Mikroçekirdekler bir dizi ölçütle ayrılabilir. Bu ölçütler mikroçekirdekler içindeki kinetokor veya sentromerik DNA’nın varlığının ve yokluğunun belirlenmesini içerir. Mikroçekirdekli olgunlaşmamış (polikromatik) eritrosit sıklığı son noktadır. Hayvanlar 4 veya daha fazla hafta boyunca sürekli olrak muamele edildiklerinde, belli sayıda olgun eritrosit arasından, mikroçekirdekler içeren periferal kanda olgunlaşmış (normokromatik) eritrosit sayısı da yöntemin son noktası olarak kullanılabilir
Bu memeli in vivo mikroçekirdek testi özellikle canlı organizmada (in vivo) metabolizma, farmakokinetik ve DNA-onarım süreci faktörlerinin, her nekadar hepsi türler, dokular ve genetik son noktalar arasında farklılık gösterse de, üzerinde durulmasına olanak sağlayan mutajenik zararların değerlendirilmesiyle ilgilidir. Bir canlı organizmada (in vivo) yöntem, yapay ortamda (in vitro) sistemde tespit edilen mutajenik etkilerin daha ileri araştırmaları için de ayrıca yararlıdır. Eğer test maddesinin veya reaktif metabolitinin hedef dokuya ulaşmayacağına dair kanıt varsa bu testin kullanımı uygun.değildir.
Ayrıca bakınız Genel Giriş Kısım B.
1.2 Tanımlar ve birimler
Sentromer (Kinetokor): Hücre bölünmesi sırasında iğ iplikçiklerin tutuntuğu kromozom bölgesidir, kardeş kromozomların, kardeş hücre kutuplarına doğru düzenli hareket etmesini sağlar.
Mikroçekirdekler:, Asıl çekirdekten ayrı ve aynı zamanda asıl çekirdeğe eklenmiş olan küçük çekirdeklerdir, mitozun telofaz safhasında yalıtkan kromozom parçalarından veya tüm kromozomdan üretilirler.
Normokromatik eritrosit: Olgunlaşmış eritrositin, ribozomu yoktur ve olgunlaşmamış, polikromatik eritrositten ribozom seçici boyalarla ayrılabilir.
Polikromatik eritrosit: Olgunlaşmamış eritrosittir, gelişmenin ara safhasıdır, hala ribozomu olduğundan olgunlaşmış, normokromatik eritrositten ribozom seçici boyalarla ayrılabilir.
1.3 Test yönteminin ilkesi
Hayvanlar test maddesine uygun bir yolla maruz kalırlar. Eğer kemik iliği kullanılmışsa hayvanlar muameleden sonraki uygun zamanlarda feda edilirler, kemik iliği alınır, örnekler hazırlanır ve boyanır (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Periferal kan kullanılmışsa, kan muameleden sonraki uygun zamanlarda toplanır, lam üzerine yayılmış örnekleri hazırlanır ve boyanır.(4)(8)(9)(10). Periferal kandaki çalışmalar için, son maruz kalma ve hücre toplanması arasında olabildiğince kısa bir süre geçmelidir. Örnekler mikroçekirdek varlığı için analiz edilirler.
1.4 Test yönteminin tanımlanması
1.4.1 Hazırlıklar
1.4.1.1 Hayvan türlerinin seçimi
Her ne kadar uygun herhangi bir memeli türü kullanılabilirse de, eğer kemik iliği kullanılmışsa, fareler veya sıçanlar tavsiye edilir. Periferal kan kullanıldığında fare tavsiye edilir. Ancak, herhangi bir uygun memeli türü, yani dalağın mikroçekirdekli eritrositleri çıkarmadığı bir tür veya yapısal veya sayısal kromozom aberasyonlarına neden olan maddeleri tespit etmek için yeterli duyarlılığı gösteren bir tür, kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan genç, sağlıklı hayvanların laboratuvar ırkları kullanılmalıdır. Çalışmanın başında, hayvanlardaki ağırlık değişkenliği aralığı her iki cinsiyet için de, uygun ortalama değerin % 20’sini geçmemelidir.
1.4.1.2 Barınma ve beslenme koşulları
Genel koşullar, Genel Giriş Kısım B’de belirtildiği şekilde uygulanır, nem % 50–60 arasında olmalıdır.
1.4.1.3 Hayvanların hazırlanması
Sağlıklı genç erişkin hayvanlar rasgele kontrol ve muamele gruplarına ayrılırlar. Kafesler yerleştirilmelerinden kaynaklanacak olası etkileri en az indirecek şekilde yerleştirilirler. Hayvanlar eşsiz olarak kimliklendirilirler. Hayvanlar en az beş gün öncesinden laboratuar koşullarına alıştırılırlar.
1.4.1.4 Dozların hazırlanması
Eğer uygunsa hücreler muamele edilmeden önce, katı test maddeleri uygun çözüler veya taşıyıcılar içinde çözülmeli veya askıda kalmalı ve seyreltilmelidir. Sıvı test maddeleri muameleden önce test sistemine doğrudan eklenebilirler veya seyreltilebilirler. Kararlılığıyla ilgili veriler saklanmasının kabul edilebilirliğini göstermedikçe test maddesinin taze hazırlanmış olanları uygulanmalıdır.
1.4.2 Test koşulları
1.4.2.1 Çözücü/taşıyıcı
Çözücü/taşıyıcı kullanılan doz seviyelerinde toksik etki meydana getirmemelidir ve test maddesiyle kimyasal reaksiyona gireceğinden şüphe duyulmamalıdır. Eğer çok iyi bilinen çözücüler/taşıyıcılar dışındakiler kullanılırsa içerikleri uyumlu olduklarını gösteren verilerle desteklenmelidir. Uygun olan her yerde önce sulu çözelti/taşıyıcı kullanılmasının düşünülmesi tavsiye edilir.
1.4.2.2 Kontroller
Eş zamanlı pozitif ve negatif (çözücü / taşıyıcı) kontroller, her bir cinsiyet için her bir deneyde de yer almalıdır. Test maddesiyle muamele haricinde, kontrol grubundaki hayvanlar muamele grubundaki hayvanlarla eşit şartlarda tutulmalıdır.
Pozitif kontroller arka planda tespit edilebilir artışlar göstermesi beklenen maruz kalma seviyelerinde canlı organizma içinde (in vivo) mikroçekirdekler meydana getirmelidir. Pozitif kontrol dozları, etkilerin açıkça görülebileceği şekilde seçilmelidir, fakat işaretli lamların özdeşliği okuyucu tarafından hemen ortaya çıkarılmaz. Test maddesinin uygulandığından daha farklı şekilde uygulanan pozitif kontrol kabul edilebilirdir ve sadece tek seferde örnekleme yapılır. Mevcut olduğu durumlarda, kimyasal sınıfla ilişkili pozitif kontrol kimyasallarının kullanımı üzerinde durulmalıdır.
Pozitif kontrol madde örnekleri :

Madde	CAS No.	EINECS No.
Etil metil sülfonat	62-50-0	200-536-7
N-Etil-N-nitrozo üre	759-73-9	212-072-2
Mitomisin C	50-07-7	200-008-6
Siklofosfamid Siklofosfamid monohidrat	50-18-0 6055-19-2	200-015-4
Trietilenmelamin	51-18-3	200-083-5

Çözücüyle muamele edilmiş veya sadece taşıyıcı olan ve bunun dışında uygulama gruplarıyla aynı şekilde muamele edilen negatif kontroller, hayvanlar arasındaki kabul edilebilir çeşitlilik ve kromozom aberasyonlu hücrelerin sıklıkları geçmişe yönelik kontrol verilerinden elde edilemediği sürece, her örnek alma zamanı için dahil edilmelidir. Eğer negatif kontroller için tek örnek alımı uygulanırsa, en uygun zaman ilk örnek alma zamanıdır. Ek olarak, seçilen çözücü/taşıyıcı tarafından uyarılmış hiç bir zararlı veya mutajenik etki olmadığını gösteren tarihsel veya yayınlanmış kontrol verileri yoksa işlenmemiş kontroller dahi kullanılabilir.

Eğer periferal kan kullanılmışsa, daha önceden muamele edilmiş örnek eş zamanlı negatif kontrol olarak da ayrıca kabul edilebilir fakat sonuç verileri geçmişe yönelik kontrol için beklenen aralıkta olduğunda sadece kısa periferal kan çalışmalarında (ör. 1–3 muamele) bu durum söz konusudur.
1.5 İşlem
1.5.1 Hayvanların sayı ve cinsiyetleri

Her bir muamele ve kontrol grubu cinsiyet başına en az 5 analiz edilebilir erkek içermelidir (11). Eğer çalışma sırasında aynı tür için aynı maruz kalma yolu uygulanarak yapılan çalışmalardan elde edilebilir veriler varsa, bu durum cinsiyetler arasında önemli farklılıkların bulunmadığını gösterir, o zaman tek bir cinsiyette test uygulanması yeterli olacaktır.

İnsanlarda kimyasallara maruz kalma cinsiyete özgü olabildiğinden, örneğin bazı farmasötik etkenlerle, test uygun cinsiyetteki hayvanlarla uygulanmalıdır.
1.5.2 Uygulama Planı
Tavsiye edilen standart bir muamele programı yoktur (ör. 24 saatlik aralıklarla 1, 2 veya daha fazla muamele). Uzatılmış doz düzeylerinden alınan örnekler, bu çalışma için pozitif etki gösterdiği sürece, veya negatif çalışmalar için toksisite gösterdiği veya sınır doz kullanıldığı sürece kabul edilebilirdir ve doz uygulamasına örnek alma zamanına kadar devam edilir. Test maddesi ayrıca büyük hacimli maddelerin uygulanmasını kolaylaştırmak için bölünmüş dozlar halinde de (örn. aynı günde verilmeleri arasındaki süre birkaç saati geçmeyen iki muamele şeklinde) uygulanabilir.
Test iki şekilde uygulanabilir:
(a) Hayvanlar test maddesiyle bir kere muamele edilirler. Kemik iliği örnekleri en az iki defa alınır, muameleden en az 24 saat sonra fakat 48 saati geçmeyen sürede, örnekler arası uygun aralıklarla örnek alınmasına başlanır. Örnek alınmasına uygulamadan sonra 24 saat geçmeden başlanması gerekçelendirilmelidir. Periferal kan örnekleri en az iki defa alınır, muameleden en az 36 saat sonra başlanır, ilk örneğin alınmasını takiben uygun aralıklarla fakat 72 saati geçmeyen sürede alınmalıdır. Örnek alma zamanında pozitif cevaba rastlanırsa, ilave örnek alınmasına gerek yoktur.
(b) Eğer 2 veya daha fazla günlük uygulama yapılıyorsa (ör. 24 saat aralıklarla iki veya daha fazla muamele), örnekler kemik iliği için en sonuncu muameleyi takiben 18 ve 24. saatler arasında bir kere ve periferal kan için de en sonuncu muameleyi takiben 36 ve 48. saatler arasında alınmalıdır (12).
Diğer örnek alma zamanları da ilgili yerle de ilave olarak kullanılabilir.
1.5.3 Doz seviyeleri
Eğer elde hiç uygun veri bulunmadığı için bir aralık bulma çalışması yürütülürse, temel çalışmada kullanılanla aynı laboratuvar, aynı ırk, cinsiyet ve muamele düzeyi kullanılarak yürütülmelidir (13). Eğer toksisite varsa, ilk örnek alma zamanı için üç doz seviyesi kullanılır. Bu doz seviyeleri maksimumla çok az toksisitenin olduğu veya hiç toksisitenin olmadığı aralığın içinde olmalıdır. Daha sonraki örnek alma zamanında sadece en yüksek dozun kullanılması gerekir. En yüksek doz, toksik belirtilerinin oluşmaya başladığı doz olarak tanımlanır şöyle ki daha yüksek doz seviyelerinin, aynı doz uygulama düzeyine dayanarak, ölüme neden olması beklenir. Düşük seviyeli toksik olmayan dozlarda özel biyolojik aktiflik gösteren hormonlar ve mitojenler gibi maddeler doz belirleme ölçütlerinde istisna olabilir ve tek başına değerlendirilmelidir. Ayrıca en yüksek doz kemik iliğinde (örneğin, kemik iliği veya periferal kandaki toplam eritrositteki olgunlaşmamış eritrosit sayısı) bazı toksik belirtileri meydana getiren doz olarak da tanımlanabilir.
1.5.4 Sınır testi
Eğer 2000 mg/kg vücut ağırlığı doz seviyeli bir sınır testi tek doz veya aynı günde iki muamele olarak uygulandığında gözlenebilen herhangi bir toksik etki meydana getirmiyorsa ve eğer yapısal olarak benzer maddelerle ilgili genotoksisite beklenmiyorsa bu durumda üç doz seviyesi kullanılarak yapılacak kapsamlı bir çalışmaya gerek olmayabilir. Uzun süreli çalışmalarda, 14 güne kadar olan muameleler için sınır doz 2000 mg/kg/vücut ağırlığı/gün; 14 günden daha uzun süreli muamelelerde 1000 mg/vücut ağırlığı/gün’dür. İnsanda beklenen maruz kalma, sınır testinde daha fazla doz seviyesinin kullanılması gerektiğine işaret edebilir.
1.5.5 Dozların uygulanması
Test maddesi genellikle mide tüpü kullanılarak sonda ile besleme veya mideye uygun bir elastik boru sokulmasıyla veya karın içine enjeksiyonla uygulanır. Diğer işlem yolları gerekçelendirildiklerinde uygun olabilir. Sonda ile besleme veya enjeksiyonla tek seferde uygulanabilecek olan maksimum sıvı hacmi test hayvanının büyüklüğüne bağlıdır. Hacim 2 ml/100g vücut ağırlığını geçmemelidir. Bu değerden daha yüksek hacimler gerekçelendirilmelidir. Normalde daha yüksek konsantrasyonlarda daha kötü etkiler meydana getiren tahriş edici ve aşındırıcı maddeler haricindeki maddeler için konsantrasyonun tüm doz seviyelerinde sabit olacak şekilde ayarlanmasıyla test hacmindeki değişkenlik en aza indirilir.
1.5.6 Kemik iliği/kan hazırlanması
Kemik iliği hücreleri genellikle feda edilmelerden hemen sonra kalça kemiğinden veya kaval kemiğinden elde edilirler. Yaygın olarak hücreler femür veya kaval kemiğinden uzaklaştırılırlar, hazırlanırlar ve bilinen yöntemlerle boyanırlar. Periferal kan toplardamardan veya diğer uygun kan damarından elde edilir. Kan hücreleri hemen supravital boyama ile boyanırlar (8)(9)(10) veya lam üzerine örnekler yayılır, daha sonra boyanırlar. DNA’ya özgü boyanın [örn. akridin turuncusu (14) veya Hoechst 33258 plus pironin-Y (15)] kullanılması DNA’ya özgü olmayan boya kullanımıyla ilgili işlem hatalarının bazılarını ortadan kaldırabilir. Bu avantaj, geleneksel boyaların (ör. Giemsa) kullanılmasına engel olmaz. Laboratuarlarda mikroçekirdek hazırlanmasında uygun şekilde kullanıldığı gösterilen ilave sistemler [ör. çekirdekli hücreleri uzaklaştırmak için selüloz kolonlar (16)] kullanılabilir.
1.5.7 Analiz
Olgunlaşmamış eritrosit sayısının toplam eritrosit (olgunlaşmamış + olgun) sayısına oranı her bir hayvan için, kemik iliğinde toplamda en az 200, periferal kanda ise 1000 eritrosit sayılarak belirlenir (17). Pozitif ve negatif kontroller de dahil tüm lamlar mikroskobik analizden önce ayrı ayrı işaretlenmelidir. Hayvan başına en az 2000 olgunlaşmamış eritrosit mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit oluş sıklığı için sayılırlar. İlave bilgi mikroçekirdekler için olgunlaşmış eritrosit sayılarak elde edilebilir. Lamlar analiz edilirken, olgunlaşmamış eritrositin toplam eritrosite oranı kontrol değerinin %20’sinden az olmamalıdır. Hayvanlar 4 hafta veya daha fazla bir süre sürekli olarak muamele edildiklerinde hayvan başına en az 2000 eritrosit de ayrıca mikroçekirdeklerin oluş sıklığı için sayılabilir. Uygun şekilde düzenlenmiş ve geçerli hale getirilmiş otomatik analiz sistemleri (görüntü analizi ve hücre süspansiyon akış sitometri) elle yapılan değerlendirmelere seçenek olarak kabul edilebilir.
2. VERİLER
2.1 Sonuçların uygulanması
Hayvanlarla ilgili veriler ayrı ayrı çizelge halinde sunulmalıdır. Deneysel birim hayvandır. Sayılan olgunlaşmamış eritrosit sayısı, mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayısı, ve toplam eritrositler arasından olgunlaşmamış olanların sayısı analiz edilen her bir hayvan için ayrı olarak listelenmelidir. Hayvanlar 4 hafta veya daha uzun süre süreki olarak muamele edildiklerinde eğer toplanmışsa, olgunlaşmış eritrosit verileri de ayrıca verilmelidir.Olgunlaşmamış eritrositlerin toplam eritrositlere oranı ve eğer uygulanabilir olduğu düşünülürse mikroçekirdekli eritrosit yüzdesi her bir hayvan için verilir. Eğer cinsiyetler arasında farklı cevaplar olduğuna dair hiç kanıt yoksa istatiksel analiz için her iki cinsiyetten elde edilen veriler birleştirilebilir.
2.2 Sonuçların değerlendirilmesi ve yorumlanması
Pozitif sonuç tayin etmek için artış mikroçekirdekli hücrelerin sayısındaki doza bağlı artış veya tek bir doz grubunda, tek bir örnek alma zamanında mikroçekirdekli hücrelerin sayısındaki net artış gibi bazı ölçütler vardır. Sonuçlar ilk önce biyolojik açıdan değerlendirilmelidir. İstatistiksel yöntemler, test sonuçlarını değerlendirirken yardımcı olarak kullanılabilir (8)(19). İstatiksel anlamlılık pozitif bir cevap için tek belirleyici etken olmamalıdır. Şüpheli sonuçlar ilave testlerle, tercihen deney koşullarının düzeltilmesiyle netleştirilmelidir.
Sonuçları yukarıdaki ölçütleri karşılamayan bir test maddesinin bu sistemde mutajenik olmadığı düşünülür.
Her ne kadar pek çok deney açıkça pozitif ya da negatif sonuçlar verecekse de, nadir durumlarda veri kümeleri test maddesinin aktifliği hakkında net bir karar verilmesine engel olacaktır. Sonuçlar deneyin tekrarlanma sayısından bağımsız olarak şüpheli ve belirsiz olabilir.
Mikroçekirdek testindeki pozitif sonuçlar maddenin kromozomal hasar veya test türünün eritroblastlarındaki mitotik aygıttaki hasarlar sonucu meydana gelen mikroçekirdekleri uyardığına işaret eder. Negatif sonuçlar, test koşulları içinde, test maddesinin test türünün olgunlaşmamış eritrositlerindeki mikroçekirdekler oluşturmadığına işaret eder. Test maddesinin veya metabolitinin genel dolaşıma veya belirli biçimde hedef dokuya (örneğin, sistemik toksisite) ulaşma olasılığı tartışılmalıdır.
3. RAPORLAMA
3.1 Test raporu
Test raporu aşağıdaki bilgileri içermelidir:
Çözücü/Taşıyıcı

— taşıyıcı seçimi için gerekçe;

— eğer biliniyorsa, test maddesinin çözücü/taşıyıcı içindeki çözünürlüğü ve kararlılığı;
Test hayvanları:

— kullanılan tür/ırk;

— hayvanların sayısı, yaşı ve cinsiyeti;

— kaynak, barınma koşulları, diyet. vs.;

— testin başında her bir hayvanın ayrı ayrı ağırlığı, her bir grup için vücut ağırlığı aralığı, ortalama ve standart sapma dahildir;
Test koşulları:

— pozitif ve negatif (taşıyıcı/çözücü) kontrolleri;

— eğer yapıldıysa, aralık-bulma çalışmaları verileri;

— doz seçimi için gerekçe;

— test maddesi hazırlanmasıyla ilgili detaylar;

— test maddesi uygulanmasıyla ilgili detaylar;

— uygulama yolu için gerekçe;

—eğer uygulanabiliyorsa, genel dolaşıma veya hedef dokuya ulaşan maddelerin doğruluğunu kanıtlamak için kullanılan yöntemler;

— eğer uygulanabiliyorsa, diyet/içme suyu test maddesi konsantrasyonun (ppm) mevcut doza (mg/kg vücut ağırlığı/gün) çevrilmesi;

— gıda ve su kalitesiyle ilgili detaylar;

— muamele ve örnek alma planıyla ilgili detaylı tanım;

— lam hazırlama yöntemleri;

— toksisite ölçümü yöntemleri;

— mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayma ölçütleri;

— hayvan başına analiz edilen hücre sayısı;

— çalışmaları pozitif, negatif ve belirsiz olarak ayırma ölçütleri.

Sonuçlar:

— toksisite belirtileri;

—olgunlaşmamış eritrositlerin toplam eritrosit sayısına oranı;

— her bir hayvan için ayrı ayrı verilen mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit sayısı;

— grup başına düşen mikroçekirdekli olgunlaşmamış eritrosit ortalama standart sapması;

— uygun yerlerde, doz cevap ilişkisi;

— istatistiksel analizler ve uygulanan yöntemler;

— eş zamanlı ve geçmişe yönelik negatif kontrol verileri,

— eş zamanlı pozitif kontrol verileri.
Sonuçların tartışılması
Sonuçlar
4. KAYNAKLAR
1. Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, 187-190.
2. Schmid, W. (1975). The Mikroçekirdek Test, Mutation Res., 31, 9-15.
3. Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123: 61-118.
4. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Mikroçekirdek Assay in Memeli Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, 29-80.
5. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Eritrosit: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. in: “Developments in Science and Practice of Toxicology“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, 555-558.
6. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Mikroçekirdek Assays in Memeli Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103-112.
7. MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Eritrosit Mikroçekirdek Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14: 513-522.
8. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Mikroçekirdek Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, 245-249.
9. The Collaborative Study Group for the Mikroçekirdek Test (1992). Mikroçekirdek Test with Mouse Peripheral Blood Eritrosit by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, 83-98.
10. The Collaborative Study Group for the Mikroçekirdek Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Memeli Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood mikroçekirdek test. Mutagenesis, 10, 153-159.
11. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Eritrosit Mikroçekirdek Assay. Mutation Res., 312, 293-304.
12. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood mikroçekirdek test. Mutagenesis, 10, 313-319.
13. Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson- Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
14. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Mikroçekirdek Test. Mutation Res., 120, 241-247.

15. MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Eritrosit Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, 269-275.

16. Romagna, F. and Staniforth, C.D. (1989). The automated bone marrow mikroçekirdek test. Mutation Res., 213, 91-104.
17. Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polikromatik to normochromatic eritrosit ratio in the bone marrow mikroçekirdek test. Mutation Res., 347, 97-99.
18. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
19. Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.