Dsp toxins in mollusks from Buenos Aires



Yüklə 153.99 Kb.
PDF просмотр
tarix01.08.2017
ölçüsü153.99 Kb.

5

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012

ISSN 0373-580 X

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2): 5-14. 2012

1

 División Ficología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, Argentina; 



2

 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET, Argentina.

3

 Departamento de Toxinas Marinas, Laboratorio Regional Mar del Plata, Centro Regional Buenos Aires Sur, SENASA. 



Argentina.

4

 Dirección de Pesca, Ministerio de Asuntos Agrarios de la Provincia de Buenos Aires. Argentina.



5

 Laboratorio Bioquímica de Membrana, Departamento de Fisiología y Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad de 

Chile. Chile.

* Author to whom correspondence should be addressed: easar@fcnym.unlp.edu.ar



F

irst

 

report

 

oF

 

diarrheic

 

shellFish

 

toxins

 

in

 

mollusks

 

From

 

B

uenos

 a

ires

 p

rovince

 (a

rgentina



associated

 

with

 

d

inophysis

 

spp

.: 

evidence

 

oF

 

okadaic

 

acid



dinophysistoxin

-1 

and

 

their

 a

cyl

-

derivatives

EUGENIA A. SAR

1,2,

*, INÉS SUNESEN



1,2

, ALEJANDRA B. GOYA

3

, ANDREA S. LAVIGNE



1,4

ERIC TAPIA



5

, CARLOS GARCÍA

5

 y NÉSTOR LAGOS



5

Resumen: Primer reporte de toxinas diarreicas de moluscos en bivalvos de la Provincia de Buenos 

Aires (Argentina) asociado con Dinophysis spp.: evidencia de Ácido Okadaico, Dinophysistoxina-1 y 

sus acyl-derivados. En enero de 2010, los dinoflagelados productores de toxinas Dinophysis acuminata 

D. caudata (10

cells·l


-1

) fueron detectados en Mar Azul durante un monitoreo rutinario de fitoplancton 

realizado en aguas costeras de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. Mesodesma mactroides (almeja 

amarilla) y Donax hanleyanus (berberecho) del intermareal de Mar Azul, que son parte de la dieta de los 

habitantes del lugar y de turistas, dieron resultado positivo para toxinas lipofílicas mediante bioensayo 

ratón. Este trabajo está focalizado en la detección de Toxinas Diarreicas de Moluscos (DSP) en muestras 

colectadas durante el evento de toxicidad usando un HPLC-FLD con procedimiento de derivatización 

precolumna.  Los  datos  evidenciaron  contaminación  de  los  moluscos  con  toxinas  DSP  y  un  perfil 

compuesto por Ácido Okadaico (OA), Dinophysistoxina-1 (DTX-1), Acyl-Dinophysistoxina-1 (Acyl-DTX-1) 

y Acyl-Ácido Okadaico (Acyl-OA). Las toxinas DSP encontradas en este estudio producen síntomas de 

diarrea consistentes con los experimentados por los pacientes que habían ingerido moluscos cocinados 

en enero. Este es el primer reporte de Acyl-derivados en muestras de moluscos procedentes del Atlántico 

Sudamericano y de OA en muestras de moluscos procedentes de Argentina. 

Palabras clave: DSP, Ácido Okadaico, Dinophysistoxina-1, Acyl-derivados, Dinophysis spp. 

Summary: In January 2010, the toxin-producing dinoflagellates Dinophysis acuminata and D. caudata 

(10


cells·l


-1

) were detected in Mar Azul during routine plankton monitoring in Buenos Aires Province 

coastal waters, Argentina. Wild clams Mesodesma mactroides and Donax hanleyanus from Mar Azul 

intertidal beach, which are part of the diet for local inhabitants and tourists, tested positive with the official 

lipophilic mouse bioassay. This paper focuses on the detection of Diarrhetic Shellfish Poison (DSP) toxins 

in these samples using a HPLC-FLD pre column derivatization procedure. The data showed that shellfish 

were contaminated with complex DSP toxin profiles composed of Okadaic Acid (OA), Dinophysistoxin-1 

(DTX-1), Acyl-Dinophysistoxin-1 (Acyl-DTX-1) and Acyl-Okadaic Acid (Acyl-OA). The DSP toxins found in 

this study produce diarrhea symptoms consistent with those experienced by patients who had ingested 

cooked shellfish in January. This is the first report of Acyl-derivatives in South American Atlantic shellfish 

samples and of OA in Argentinean shellfish samples. 

Key words: DSP, Okadaic Acid, Dinophysistoxin-1, Acyl-derivatives, Dinophysis spp. 


E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

6

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012



i

ntroduction

The first documented episode of gastrointestinal 

distress  and  diarrhea  in  humans  consistent  with 

Diarrhetic Shellfish Poisoning occurred in Argentina 

was reported from the Gulfs San José and Nuevo, 

Patagonia Argentina in 2001 (Gayoso et al., 2002). 

The Diarrhetic Shellfish Poison (DSP) toxin vectors 

were mussels Aulacomya ater Molina and Mytilus 



edulis platensis  d’Orbigny,  and  the  dinoflagellate 

which  was  present  in  the  plankton,  epiphyte  on 

macroalgae  and  in  the  stomach  contents  of  the 

bivalves,  was  Prorocentrum lima  (Ehrenberg) 

Dodge. The only DSP toxin described in that report 

was Dinophysistoxin-1 (DTX-1). 

Recently,  Sar  et al.  (2010)  reported  another 

episode of human gastrointestinal illness associated 

with consumption of cooked wedge clams Donax 

hanleyanus  Philippi  collected  in  Villa  Gesell 

(Buenos  Aires  Province)  that  gave  positives  for 

DSP by mouse bioassay. In that event, the DSP toxin 

vectors were two bivalve species: wedge clams and 

mussels  Brachydontes rodriguezii d’Orbigny. The 

analyzed  phytoplankton  community  consistently 

contained  the  toxigenic  species  Dinophysis 

acuminata Claparède et Lachmann and D. caudata 

Saville-Kent.



Dinophysis acuminata was originally described 

as  Okadaic Acid  (OA)  producer  based  on  bloom 

samples collected at Le Havre, France and Tokyo 

Bay,  Japan  by  using  High  Performance  Liquid 

Chromatography  with  fluorescence  detection 

(HPLC-FLD) (Lee et al., 1989). In 2001 the toxin 

content  of  D. acuminata from  the  Galician  Rías 

Bajas, showed OA as the major toxin and a very 

small  peak  with  retention  time  corresponding  to 

Dinophysistoxin-2  (DTX-2)  (Fernández  et al., 

2001), then in 2005 D. acuminata collected in New 

Zealand showed a DSP toxin profile including OA, 

DTX-1, Pectenotoxin 2 (PTX-2) and Pectenotoxin 

11  (PTX-11)  (MacKenzie  et al.,  2005).  More 

recently, Hackett et al. (2009) established unialgal 

cultures  of  D. acuminata from  Woods  Hole, 

USA, maintained this culture by using a two step 

feeding  system  described  in  (Park  et al.,  2006). 

Through  chemical  analysis  of  the  cell  culture 

extracts by Liquid Chromatography tandem Mass 

Spectrometry (LC-MS/MS) and Ultra Performance 

Liquid Chromatography (UPLC), they reported the 

detection of OA, diol ester of OA (OA D8), DTX-

1, PTX-2 and hydroxylated PTX-2. 



Dinophysis caudata was early described as OA 

producer, based on picked cells from Johor Strait, 

Singapore  (Holmes  et al.,  1999)  and  similarly 

based  on  picked  cells  from  the  Galician  Rías  of 

Vigo  and  Pontevedra  and  analyzed  by  HPLC-

FLD and LC-MS (Fernández et al., 2003). Picked 

cells from Sapian Bay, Panay Islands, Philippines, 

analyzed by HPLC-FLD determined content of OA 

and DTX-1 (Marasigan et al., 2001) and later cell 

extracts from Galician Rías Bajas analyzed by LC-

MS/MS have shown that the species may have high 

levels of PTX-2 (Fernández et al., 2006).

To  date  DSP  toxins  in  Chile  are  restricted  to 

the  shellfish  of  the  southern  regions  (García  et 



al.,  2010).  Dinophysis acuminata  was  mentioned 

as  the  most  probable  source  of  DTX-1  detected 

in Mytilus chilensis Hupe collected in a Southern 

Chilean  Magellanic  fjord  (Uribe  et al.,  2001) 

and  Dinophysis acuta  Ehrenberg  was  the  species 

commonly  associated  with  DSP  outbreaks  in 

Northern  Chilean  Patagonian  fjords  (Lembeye  et 

al., 1993; Zhao et al., 1993). More recently, there 

are two reports that described strains of Dinophysis 

spp. from Chile that produced only pectenotoxins, 

one corresponding to D. acuminata collected in the 

North of Chile (Blanco et al., 2007) and the other 

to Dinophysis sp. (Fux et al., 2011). 

There is little information about the DSP toxins 

in  the Atlantic  coastal  waters  of  South America. 



Dinophysis acuminata  was  associated  with  the 

detection  of  the  diarrhetic  toxin  OA  in  mussels 

from  Santa  Catarina,  Brazil,  during  the  winter 

of  1995  by  HPLC-FLD  (Proença  et al.,  1999) 

and  Dinophysis acuminata  and  D. caudata were 

associated with the detection of diarrhetic toxins by 

mouse bioassay in clams, wedge clams and mussels 

during the summers-falls of 1992, 1994 and 1996 

from  several  localities  of  Uruguay  (Méndez  & 

Ferrari,  2002).  Extracts  of  D. acuminata  and  D. 



caudata concentrated by net hauls from Uruguayan 

waters, analyzed by HPLC-FLD showed OA as the 

only DSP toxin (Méndez & Ferrari, 2002).

Based on previous results (Sar et al., 2010), we 

carried out the present study with the purposes of 

analyzing  the  phytoplankton  composition  from 

Mar  Azul  between  January  and  April  of  2010, 

checking  lipophilic  shellfish  toxins  in  bivalve 

mollusks by mouse bioassay and determining the 

diarrhetic shellfish toxins profiles by HPLC-FLD.



7

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012

m

aterials

 

and

 m

ethods

Phytoplankton samples

The  phytoplankton  samples  analyzed  in  this 

paper were collected at the Buenos Aires Province 

coastal  waters  between  early  January  and  middle 

April of 2010 from Mar Azul (37º 21’ 25’’ S-57º 

01’ 49’’ W) at about 10 to 20 m from the shoreline, 

from the surface layer of the water column (0 and 5 

meters depth). Qualitative samples were collected 

with 30 µm net hauls and immediately fixed with 

4% formalin; quantitative samples were collected 

with Van Dorn bottle and fixed with 0.4% formalin.

Microscopic  observations  were  made  with  a 

light  microscope  (LM),  Nikon  Microphot  FX, 

using phase contrast and with a scanning electron 

microscope  (SEM)  Jeol  JSM  6360  LV.  The 

microphotographs  were  taken  with  the  Jeol  JSM 

6360  LV  microscope.  The  quantitative  analyses 

of  phytoplankton  were  carried  out  using  the 

Sedgewick-Rafter  chamber  and  the  cell  counts 

were made in triplicate. Data were processed with 

Statistical Software for Windows 7.0. The results 

were expressed as mean ± standard deviation.

Qualitative  and  quantitative  samples  and 

permanent  slides  correlatively  labeled  were 

incorporated into the Herbarium, deposited at the 

División  Ficología  (LPC  index  Herbariorum), 

Facultad  de  Ciencias  Naturales  y  Museo, 

Universidad  Nacional  de  La  Plata  under  the 

numbers  LPC  11182,  01/04/2010;  LPC  11186, 

01/28/2010;  LPC  11286,  02/12/2010;  LPC11190, 

02/26/2010;  LPC11194,  03/09/2010;  LPC  11198, 

03/26/2010 and LPC 11202, 04/12/2010.



Shellfish samples

Shellfish  samples  were  collected  at  low  tide 

in  the  same  time  and  area  as  the  phytoplankton 

samples, along the beach from the intertidal fringe, 

by  digging  in  the  sand.  Collected  species  were 

wedge  clam  (Donax hanleyanus  Philippi)  and/

or  yellow  clam  (Mesodesma mactroides  Reeves), 

depending  on  which  population  was  accessible. 

In  each  sampling,  two  subsamples  of  shellfish 

around 500 g were obtained and frozen at -18 ºC 

for  checking  DSP  toxicity  by  mouse  bioassay  in 

the  Departamento  de  Toxinas  Marinas,  Regional 

Mar  del  Plata  of  the  SENASA  and  by  HPLC-

FLD  analysis  in  the  Laboratorio  Bioquímica  de 

Membrana, Facultad de Medicina, Universidad de 

Chile. The sample corresponding to early January 

was lost. 

A sample of cooked wedge clam from a locality 

neighboring  Mar  Azul  (Villa  Gesell,  37º  16’ 

48’’S-56º  58’  57’’W),  ingested  by  patients  who 

experienced  diarrhea,  nausea  and  abdominal 

cramps,  all  symptoms  consistent  with  DSP 

intoxication, was also checked by mouse bioassay 

and by analytical methods. 



Mouse bioassays

The procedure employed for sample preparation 

prior to mouse bioassay was described in Yasumoto 

et al.  (1984)  and  modified  in  Fernández  et al

(2002). The Japanese mouse assay for DSP toxins 

with modifications is the official method accepted 

by the Argentinean Officials. Extracts for bioassay 

were prepared from whole soft tissues of shellfish 

and mice were intraperitoneal injected with 1 mL 

Tween 60 1% equivalent to 25 g shellfish tissues. 

Experimental animals were albino mice strain CF1 

of  20  ±  1  g  weight.  According  to  the  Decision 

2002/225/CEE  appeared  in  the  Official  Journal 

of  the  European  Communities  and  followed 

by  the  Servicio  Nacional  de  Sanidad  y  Calidad 

Agroalimentaria from Argentina, this method uses 

mouse  survival  time  for  determination  of  DSP 

toxicity and two of three mouse deaths in less than 

24 hours as criterion for a positive test. 



Chemical analyses

High Performance Liquid Chromatography with 

Fluorescence detection (HPLC-FLD)

A portion of 1 g of homogenate prepared from 

ten  individuals  of  each  shellfish  sample  was 

extracted twice with 4 mL of methanol-water (8:2 

v/v)  following  Lee  et al.  (1987). The  methanolic 

phase was centrifugated, 2.5 mL of the supernatant 

diluted with water to a final 26.6% methanol and 

cleaned up by liquid/liquid partitioning according 

to  García  et al.  (2003,  2010).  This  eluate  was 

evaporated  to  dryness  under  reduced  pressure  in 

a  Speed  Vac  Plus  (Savant,  SC  210A).  The  dried 

extraction  was  resuspended  in  100  microliters  of 

methanol. 

The alkaline hydrolysis of Acyl-DSP toxins was 

performed  as  described  in  García  et al.  (2004a). 

Briefly, aliquots of 2.5 mL of 80% methanol extract 

of each shellfish sample were treated with 2.5 mL 

of  0.5  N  NaOH  in  90%  methanol  solution.  The 



E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

8

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012



mixture was kept to 75º for 50 minutes and then the 

methanol was evaporated. The aqueous layer was 

acidified with 2.5 mL of 0.5 N HCl, extracted twice 

with  5  mL  diethyl  ether,  evaporated  to  dryness 

and  dissolved  with  2.5  mL  of  80%  methanol. 

The  methanolic  solution  was  treated  with  1  mL 

of 0.2% acetic acid, extracted twice with 4 mL of 

dichloromethane and evaporated to dryness under 

reduced pressure.

Clean  and  dry  extracts  and  standards  were 

derivatized with 9-anthryl-diazomethane (ADAM, 

Molecular Probe, USA) freshly prepared solution 

of 0.1% ADAM in 100 µl of acetone and 400 µl 

of methanol. The mixture was kept to 25º for 60 

minutes and then evaporated to dryness. Residues 

were diluted in 200 µl of dichloromethane/hexano 

(1:1 v:v).

The derivatized samples were cleaned up on a 

solid-phase  extraction  device,  silica  column  Sep-

Pak  cartridge  (Water  CO.)  (García  et al.,  2003) 

and analyzed by HPLC using isocratic conditions 

with  mobile  phase  of  acetonitrile/methanol/water 

(8:1:1  v/v),  and  column  with  reversed  phase, 

Supelcosil  LC  (C18,  4  ×  250  mm,  5  µm).  The 

chromatographic  separation  was  performed  on  a 

Liquid  Chromatograph  System  equipped  with  a 

pump  (Shimadzu  LC-6A),  a  Rheodyne  injector 

(7725i Rheodyne) and in-line fluorescence detector 

(Jasco  FP-2020  Plus).  The  fluorescence  detector 

was set for 365 nm excitation and 415 nm emissions. 

Peaks  in  the  resulting  chromatograms  were 

identified by comparison with the retention times 

of  toxins  analytical  standards.  Certified  reference 

materials  containing  Dinophysistoxin-1  (CRM-

DSP-Mus-b) and Okadaic acid (NCR-CRM-OA-c) 

were  obtained  from  National  Research  Council 

Canada. The detection limits for the DSP toxins as 

ADAM esters were 0.02 ng of DSP toxins detected 

in the chromatogram meaning a signal that it was 

the double amount of the base signal noise in the 

recorded equipment (García et al., 2010). 

r

esults

 

and

 d

iscussion

 

Temporal distribution and density of the species 

of Dinophysis in Mar Azul

 The  concentration  of  Dinophysis  cells  was 

quite  low  in  Buenos  Aires  coastal  waters  in  the 

years 2008 and 2009 and the occurrence from one 

year to the next varied considerably (unpublished 

data).  Nevertheless,  in  early  January  2010,  there 

occurred  an  unusual  proliferation  of  Dinophysis 

acuminata  (Figure  1A)  that  reached  a  maximum 

number  of  cells  in  Mar  Azul,  26,000  cells·l

-1



with  a  2.41%  relative  contribution  to  the  total 



phytoplankton (Table 1). In later January the cell 

concentrations  of  Dinophysis acuminata declined 

to 9,000 cells·l

-1

Dinophysis caudata (Figure 1B) 



appeared  in  lower  cell  concentrations  than  D. 

acuminata,  1,000  cells·l

-1

,  and  the  phytoplankton 



assemblage  was  dominated  by  the  diatoms 

Asterionellopsis glacialis (Castracane)  Round 

and  Rhizosolenia imbricata Brightwell,  as  well 

as  additional  nanoplanktonic  centric  diatoms  and 

phytoflagellates of indeterminate identity (Table 1).

From  February  to  early  March  the  density 

of  Dinophysis acuminata  tended  to  diminish, 

varying  between  8,675  and  333  cells·l

-1

  (Figure 



2)  and  the  relative  contribution  of  both  species 

into  the  total  phytoplankton  assemblage  also 

decreased (0.43 to 0.01% respectively) (Table 1). 

The opposite situation was found in reference to 

the  cell  concentration  of  the  total  phytoplankton 

population that increased between 2.0·10

6

 cells·l


-1

 

to  5.1·10



6

  cells·l

-1

  and  Dinophysis caudata  was 



only  found  in  qualitative  samples  in  this  period 

(Table  1).  In  later  March  the  abundance  of 



Dinophysis acuminata  increased  again  to  1,330 

cells·l


-1

 and D. caudata appeared at concentration 



Fig. 1. A:  SEM  micrography of Dinophysis 

acuminata. 

B:  SEM  micrography of Dinophysis 

caudata

9

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012

Table 1. Density of the total phytoplankton assemblage and relative density of the potentially toxigenic 

species of dinoflagellates and of the more abundant species, from Mar Azul, in the samplings from 

January to April. 

Date

01/04/10 01/28/10 02/12/10 02/26/10 03/09/10 03/26/10 04/12/10

Dinoflagellates

Dinophysis acuminata

2.60·10


4

9.00·10


3

8.67·10


3

2.33·10


3

3.33·10


2

1.33·10


3

Dinophysis caudata

1.00·10


3

qs

qs



3.33·10

2

qs



Gymnodinium catenatum (cyst)

8.33·10


3

Scrippsiella sp.

1.64·10


4

Undeterminated dinoflagellates 

6.60·10

4

Diatoms 



Asterionellopsis glacialis

2.83·10


5

2.11·10


6

1.32·10


6

4.75·10


6

4.17·10


4

Actinocyclus sp.

1.25·10


4

1.67·10


4

Bacteriastrum sp.

3.30·10


4

Cerataulina pelagica

1.33·10


5

4.17·10


4

Chaetoceros subtilis var. abnormis

1.70·10


5

3.33·10


4

Chaetoceros sp.

1.17·10


5

3.28·10


4

Delphineis sp.

5.00·10


4

Detonula pumila

8.33·10


4

Guinardia delicatula

3.33·10


4

Leptocylindrus danicus

6.67·10


4

1.33·10


5

3.25·10


5

1.25·10


4

Leptocylindrus minimus

1.90·10


5

1.70·10


5

8.33·10


4

Paralia sp.

5.80·10


4

Phaeodactylum tricornutum

3.30·10


4

Rhizosolenia imbricata

7.42·10


5

Skeletonema sp.

5.00·10


4

9.50·10


5

1.67·10


4

Thalassionema sp.

3.33·10


4

5.00·10


4

Thalassiosira gravida

3.75·10


5

Thalassiosira spp. 

3.33·10


5

Undeterminated centric diatoms

5.01·10

5

6.00·10



5

2.10·10


5

2.83·10


5

1.25·10


5

9.57·10


4

5.42·10


5

Undeterminated pennate diatoms

1.67·10

4

Phytoflagellates



Undeterminated phytoflagellates

1.17·10


5

1.00·10


5

1.67·10


4

2.08·10


4

1.00·10


5

Undeterminated silicoflagellates

5.42·10

4

Total phytoplankton



1.08·10

6

4.14·10



6

2.00·10


6

2.78·10


6

5.14·10


6

2.43·10


5

1.26·10


6

Relative contribution D. acuminata

2.41%


0.22%

0.43%


0.10%

0.01%


0.55%

Relative contribution D. caudata

0.02%


0.12%

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

10

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012



Fig. 2. Temporal distribution and density of the species of Dinophysis in Mar Azul. ■Dinophysis acuminata

¿

Dinophysis caudata. 

of 333 cells·l

-1

 (Figure 2). The relative contributions 



of  both  species  to  the  total  phytoplankton  also 

increased  (0.55%  and  0.12%  respectively),  the 

density of the total phytoplankton was the lowest 

of  all  the  sampled  periods,  2.4·10

5

  cells·l



-1 

and 


the  phytoplankton  assemblage  was  dominated  by 

indeterminate phytoflagellates and nanoplanktonic 

centric  diatoms.  In  April  both  toxigenic  species 

disappeared  or  only  scattered  cells  persisted  in 

qualitative samples.

Shellfish extracts toxicity tested by mouse bioassay

From  all  the  shellfish  samples  tested  for  DSP 

toxicity  using  the  mouse  bioassay,  only  one, 

dated  in  12 April  2010,  tested  negative  with  one 

of  three  mice  died.  In  general,  mice  presented 

prostration  and  weakness  as  common  symptoms 

in  most  of  the  samples.  Details  about  survival 

times  post  inoculation  and  death  rate  in  relation 

with cells concentrations of Dinophysis spp. in the 

phytoplankton are shown in Table 2. 



HPLC-FLD analysis

All  shellfish  sample  extracts  including  the 

one  that  tested  negative  by  mouse  bioassay,  were 

analyzed  by  HPLC-FLD  as  described  above. The 

search  of  each  DSP  toxin  was  performed  on  all 

sample extracts derivatized with ADAM. 

The chromatographic runs performed by HPLC-

FLD analysis of the sample yellow clam (03/26/10) 

as  examples  of  fluorescent  chromatograms 

performed in this study, are shown in Figure 3. In 

the top chromatogram (labeled Methanol Sample) 

the peaks displayed correspond to OA and DTX-1 

respectively.  The  second  chromatogram  (labeled 

Hydrolyzed Sample), that corresponds to an extract 

hydrolyzed with NaOH, shows the same peaks (OA 

and DTX-1) but an increase in signal was observed 

due  to  the  hydrolysis  of  the  Acyl-derivatives. 

The  third  chromatogram  (labeled  STD)  shows 



11

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012

the analytical standards of OA and DTX-1. In the 

bottom of Figure 3, the last chromatogram (labeled 

DOCA)  shows  the  run  internal  standard  which 

corresponded  to  Deoxicholic  acid  derivatized 

with ADAM. The alkaline hydrolysis revealed the 

chemical transformation of Acyl-DTX-1 into DTX-

1 and the Acyl-OA into OA. In fact, this is the only 

way  to  detect  the  Acyl  derivatives  (Acyl-DTX-1 

and Acyl-OA) by HPLC-FLD. This procedure was 

repeated with every sample extract and the results 

are shown in Table 3.

The  sample  that  tested  negative  by  mouse 

bioassay showed no peaks corresponding to OA or 

DTX-1 for the extract not hydrolyzed with NaOH 

and showed small peaks corresponding to OA and 

DTX-1 for the hydrolyzed extract. 

During routine phytoplankton monitoring carried 

out in Buenos Aires Province coastal waters, some 

shellfish  samples  tested  positive  with  the  official 

DSP  mouse  bioassay  when  D. acuminata  and  D. 

caudata  were  detected  in  parallel  water  samples 

(Sar et al., 2010). As an extension of this work the 

present study allowed us to determine in shellfish 

sample  extracts  that  the  DSP  toxin  profiles  are 

composed  of  OA,  DTX-1,  Acyl-OA  and  Acyl-

DTX-1. This is the first report of Acyl-derivatives 

compounds in the South American Atlantic Ocean 

and of OA in Argentinean waters. Acyl derivatives 

were previously reported in shellfish extracts from 

the Southern Chile by García et al. (2004b; 2006; 

2010).  The  metabolic  transformation  of  OA  and 

DTX-1  in  their  respective  Acyl-derivatives  is  a 

biochemical way of self protection from these toxic 

compounds that are chemically lipophilic and very 

hard to eliminate as has been recently reviewed by 

Rossignoli et al. (2011).



Table 2. Results obtained by mouse bioassay on whole flesh of shellfish samples collected in 

period 01/25-28/10 – 04/12/10 from Atlantic coast of Buenos Aires Province, Argentina. Yellow clam: 



Mesodesma mactroides, wedge clam:

 Donax hanleyanus. 

Sample date of 

collection / Species

Station

Cells l

-1

 of

Dinophysis spp. 

Bioassay 

result

Death rate

Survival time post 

inoculation

01/28/10 Wedge clam  Mar Azul



D. acuminata

9·10


3

D. caudata

1·10


3

Positive


3:3 (100%)

Between 1h and 1h 15min.

01/25/10 to 01/28/10 

Cooked wedge clam 

Villa 

Gesell


D. acuminata

9·10


3

D. caudata

1·10


3

Positive


3:3 (100%)

Between 1h and 1h 5min.

02/12/10 Wedge clam  Mar Azul

D. acuminata

8.7·10


3

Positive


2:3 (66%)

Between 1h 55min 

and 2h 10min.

02/26/10


a)Yellow clam

b)Wedge clam 

Mar Azul

D. acuminata

2.33·10


3

a and b 


Positive

a) 3:3 (100%)

b) 3:3 (100%)

a) Between 4 h and 12 h

b) Between 8h and 18h

03/09/10 Wedge clam

Mar Azul

D. acuminata

3.33·10


2

Positive


3:3 (100%)

Between 5h 40 

min and 21 h

03/26/10


Yellow clam

Mar Azul


D. acuminata

1.33·10


3

D. caudata

3.3·10


2

Positive


3:3 (100%)

Between 10 and 20 h 

04/12/10

Wedge clam

Mar Azul

Absents


Negative

1:3 (33%)

Less than 24 h


E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

12

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012



Fig. 3. Chromatographic runs performed by HPLC-FLD analysis of the yellow clam sample (03/26/10) 

derivatized with ADAM. OA, Okadaic acid; DTX-1, Dinophysistoxin-1; DOCA, Deoxicholic acid; STD, 

analytical standards. 

Table 3. DSP toxins presence in bivalve samples. Ten individuals of each shellfish sample (whole flesh) 

were used to obtain homogenate. Yellow clam:



 Mesodesma mactroides, wedge clam: Donax hanleyanus. 

Nd: no detectable.



Sample

collection date / Species

Cells l

-1

 of 

Dinophysis spp. 

OA 

DTX-1 

Acyl-DTX-1 

Acyl-OA 


01/28/10

Wedge clam 



D. acuminata

9·10


3

D. caudata

1·10


3

positive


nd

nd

positive 



01/25/10 to

01/28/10


Cooked 

wedge clam 



D. acuminata

9·10


3

D. caudata

1·10


3

nd

nd



positive

positive


02/12/10 

Wedge clam 



D. acuminata

8.7·10


3

positive


nd

nd

positive 



02/26/10

Yellow clam



D. acuminata

2.33·10


3

positive


positive

nd

positive



03/09/10 

Wedge clam



D. acuminata

3.33·10


2

positive


positive

nd

positive



03/26/10

Yellow clam



D. acuminata

1.33·10


3

D. caudata

3.3·10


2

positive


positive

nd

positive



04/12/10

Wedge clam

Absents

nd

nd



positive

positive


13

E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012

a

cknowledgements

We express our gratitude to A. Franetovich, to J. 

D. Novero, of the Ministerio de Asuntos Agrarios of 

the Buenos Aires Province, and to G. Meléndez, of 

the SENASA, for technical and financial assistance, 

and  to  Christian  Maurs  for  his  collaboration  in 

mollusk  sampling.  This  study  was  supported  by 

the  Consejo  Federal  Pesquero  from  Argentina 

Grant  CFP  15/09,  the  CONICET  Grant  PIP  0067 

and FONDECYT Chile Grant 1070706 and Grant 

1090058. 

B

iBliography

BLANCO,  J.,  G.  ALVAREZ  &  E.  URIBE.  2007. 

Identification  of  pectenotoxins  in  plankton,  filter 

feeder, and isolated cells of a Dinophysis acuminata 

with an atypical toxin profile, from Chile. Toxicon 

49: 710-716.

FERNÁNDEZ, M. L., B. REGUERA, I. RAMILO & A. 

MARTÍNEZ. 2001. Toxinología y contenido tóxico 

de  Dinophysis acuminata,  D. acuta  y  D. caudata 

de  las  Rías  Bajas  Gallegas.  VI  Reunión  Ibérica 

sobre  Fitoplancton  Tóxico  y  Biotoxinas,  Junta  de 

Andalucía, Congresos y Jornadas 55/00: 127-137. 

FERNÁNDEZ,  M.  L.,  A.  MÍGUEZ,  E.  CACHO,  A. 

MARTÍNEZ, J. DIOGÈNE & T. YASUMOTO. 2002. 

Bioensayos  con  mamíferos  y  ensayos  bioquímicos 

y  celulares  para  la  detección  de  ficotoxinas.  In

SAR,  E. A.,  M.  E.  FERRARIO  &  B.  REGUERA 

(eds.),  Floraciones algales nocivas en el Cono 



Sur Americano,  pp.77-120.  Instituto  Español  de 

Oceanografía, Madrid. 

FERNÁNDEZ,  M.  L.,  A.  MIGUEZ,  A.  MOROÑO, 

F.  ARÉVALO,  Y.  PAZOS,  C.  SALGADO,  J. 

CORREA,  J.  BLANCO,  S.  GONZÁLEZ-GIL  & 

B. REGUERA. 2003. First report of pectenotoxin-2 

in  phytoplankton  net-hauls  and  mussels  from 

the  Galician  Rías  Baixas  during  proliferations  of 



Dinophysis acuta and D. caudataIn: VILLALBA, 

A.,  B.  REGUERA,  J.  ROMALDE  &  R.  BEIRAS 

(eds.),  Molluscan Shellfish Safety,  pp.75–83. 

Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos da Xunta 

de  Galicia  and  Intergovernmental  Oceanographic 

Commission of UNESCO, Santiago de Compostela. 

FERNÁNDEZ, M. L., B. REGUERA, S. GONZÁLEZ-

GIL & A. MÍGUEZ. 2006. Pectenotoxin-2 in single 

cell isolates of Dinophysis caudata and Dinophysis 

acuta from the Galician Rías (NW Spain). Toxicon 

48: 477-490.

FUX,  E.,  J.  L.  SMITH,  M.  TONG,  L.  GUZMÁN  & 

D.  M.  ANDERSON.  2011.  Toxin  profiles  of  five 

geographical isolates of Dinophysis spp. from North 

and South America. Toxicon 57: 1-13.

GARCÍA,  C.,  P.  PEREIRA,  L.  VALLE  &  N.  LAGOS. 

2003.  Quantitation  of  diarrhetic  shellfish  poisoning 

toxins in Chilean mussel using pyrenyldiazomethane 

as fluorescent labeling reagent. Biol. Res. 36: 171-183.

GARCÍA,  C.,  V.  GONZÁLEZ,  C.  CORNEJO,  H. 

PALMA-FLEMING  &  N.  LAGOS.  2004a. 

First  evidence  of  Dinophysistoxin-1  ester  and 

carcinogenic  polycyclic  aromatic  hydrocarbons  in 

smoked  bivalves  collected  in  the  Patagonia  fjords. 

Toxicon 43: 121-131.

GARCÍA, C., P. MARDONES, A. SFEIR & N. LAGOS. 

2004b.  Simultaneous  presence  of  paralytic  and 

diarrheic  shellfish  poisoning  toxins  in  Mytilus 



chilensis  samples  collected  in  the  Chiloe  Island, 

Austral Chilean fjords. Biol. Res. 37: 721-731.

GARCÍA, C., V. SCHONSTEDT, J. P. SANTELICES & 

N. LAGOS. 2006. High amount of dinophysistoxin-3 

in Mytilus chilensis collected in Seno de Reloncaví, 

Chile, during massive human intoxication associated 

to outbreak of Vibrio parahaemolyticusJ. Toxicol. 

Sci. 31: 305-314.

GARCÍA, C., M. PRUZZO, N. RODRÍGUEZ-UNDA, C. 

CONTRERAS & N. LAGOS. 2010. First evidence of 

Okadaic acid acyl-derivative and Dinophysistoxin-3 

in  mussel  samples  collected  in  Chiloe  Island, 

Southern Chile. J. Toxicol. Sci. 35: 335-344.

GAYOSO,  A.  M.,  S.  DOVER,  S.  L.  MORTON,  M. 

BUSMAN, P. D. R. MOELLER & L. MARANDA. 

2002.  Possibility  of  diarrhetic  shellfish  poisoning 

associated  with  Prorocentrum lima (Dinophyceae) 

in  Patagonian  Gulfs  (Argentina).  J.  Shellfish  Res. 

21: 46-463.

HACKETT, J. D., M. TONG, D. M. KULIS, E. FUX, P. 

HESS, R. BIRE & D.M. ANDERSON. 2009. DSP 

toxin production de novo in cultures of Dinophysis 

acuminata  (Dinophyceae)  from  North  America. 

Harmful Algae 8: 873-879.

HOLMES, M. J., S. LAY MING TEO, F. CHIN LEE & 

H. WOO KOO. 1999. Persistent low concentrations 

of diarrhetic shellfish toxins in green mussels Perna 



viridis from the Johor Strait, Singapore: first record 

of diarrhetic shellfish toxins from South-East Asia. 



Mar. Ecol.-Progr. Ser. 181: 257-268.

LEE, J. S., T. YANAGI, R. KENMA & T.YASUMOTO. 

1987.  Fluorometric  determination  of  diarrhetic 

shellfish  toxins  by  high-performance  liquid 

chromatography. Agr. Biol. Chem. 51: 877-881.

LEE,  J.  S.,  T.  IGARASHI,  S.  FRAGA,  E.  DAHL, 

P.  HOVGAARD  &  T.  YASUMOTO.  1989. 

Determination  of  diarrhetic  shellfish  toxins  in 

various  dinoflagellate  species.  J. Appl. Phycol. 1: 

147-152.


E. A. Sar et. al. - DSP toxins in mollusks from Buenos Aires (Argentina) 

14

Bol. Soc. Argent. Bot. 47 (1-2) 2012



LEMBEYE,  G.,  T.  YASUMOTO,  J.  ZHAO  &  R. 

FERNÁNDEZ.  1993.  DSP  outbreak  in  Chilean 

fiords.  In:  SMAYDA,  T.J.  &  Y.  SHIMIZU  (eds.), 

Toxic Phytoplankton blooms in the sea, pp 525-529. 

Elsevier Science Publishers, New York. 

MACKENZIE,  L.,  V.  BEUZENBERG,  P.  HOLLAND, 

P. MCNABB, T. SUZUKI & A. SELWOOD. 2005. 

Pectenotoxin  and  okadaic  acid-based  toxin  profiles 

in Dinophysis acuta and Dinophysis acuminata from 

New Zealand. Harmful Algae 4: 75–85.

MARASIGAN,  A.  N.,  S.  SATO,  Y.  FUKUYO  &  M. 

KODAMA.  2001.  Accumulation  of  a  high  level  of 

diarrhetic shellfish toxins in the green mussel Perna 



viridis  during  a  bloom  of  Dinophysis caudata  and 

Dinophysis miles  in  Sapian  Bay,  Panay  Island,  the 

Philippines. Fisheries Sci. 67: 994–996.

MÉNDEZ, S. & G. FERRARI. 2002. Floraciones algales 

nocivas  en  Uruguay:  antecedentes,  proyectos  en 

curso y revisión de resultados. In: SAR, E. A., M. E. 

FERRARIO,  &  B.  REGUERA  (eds.),  Floraciones 



Algales Nocivas en el Cono Sur Americano, pp. 271-

288. Instituto Español de Oceanografía, Madrid. 

PARK,  M.  G.,  S.  KIM,  H.  S.  KIM,  G.  MYUNG,  Y.G. 

KANG  &  W.  YIH.  2006.  First  successful  culture 

of  the  marine  dinoflagellate  Dinophysis acuminata

Aquat. Microb. Ecol. 45: 101-106.

PROENÇA, L. A. O., F. SCHMITT, M. S. TAMANAHA, 

S. GUIMARÃES & L. R. RÖRIG. 1999. Produção de 

ácido okadaico, uma toxina diarréica, por Dinophysis 



acuminata em Santa Catarina. Atlântica 21: 121-127.

ROSSIGNOLI, A. E., D. FERNÁNDEZ, J. REGUEIRO, 

C. MARIÑO & J. BLANCO. 2011. Esterification of 

Okadaic acid in the mussel Mytilus galloprovincialis



Toxicon 57: 712-720.

SAR,  E.  A.,  I.  SUNESEN,  A.  S.  LAVIGNE  &  A.  B. 

GOYA. 2010. Dinophysis spp. asociadas a detección 

de  toxinas  diarreicas  en  moluscos  (DSTs)  y  a 

intoxicación  diarreica  en  humanos  (Provincia  de 

Buenos Aires, Argentina). Rev. Biol. Mar. Oceanogr. 

45: 451-460.

URIBE,  J.  C.,  C.  GARCÍA,  M.  RIVAS  &  N.  LAGOS. 

2001.  First  Report  Diarrhetic  Shellfish  Toxins  in 

Magellanic Fiords, Southern Chile. J. Shellfish Res. 

20: 69-74.

YASUMOTO,  T.,  M.  MURATA,  Y.  OSHIMA,  K. 

MATSUMOTO  &  J.  CLARDY.  1984.  Diarrhetic 

shellfish poisoning. In: RAGELIS, E.P. (ed.), Seafood 



toxins. ACS Symposium Series 262,  pp.  207-214. 

American Chemical Society, Washington D. C.

ZHAO,  J.,  G.  LEMBEYE,  G.  CENCI,  B.  WALL  &  T. 

YASUMOTO. 1993. Determination of Okadaic acid 

and  dinophysistoxin-1  in  mussels  from  Chile,  Italy 

and Ireland. In: SMAYDA, J. & Y. SHIMIZU (eds.), 



Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea, pp. 587-592. 

Elsevier Science Publishers, Amsterdam. 

Recibido el 13 de noviembre de 2011, aceptado el 1 de 

febrero de 2012.




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2016
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə