Effects of growing leafy daikon (Raphanus sativus) on populations of Plasmodiophora brassicae (clubroot)

---

Effects of growing leafy daikon (Raphanus sativus) on
populations of Plasmodiophora brassicae (clubroot)
H. Murakami
a
*², S. Tsushima
a
, T. Akimoto
a
, K. Murakami
b
, I. Goto
b
and Y. Shishido
a
a
Department of Integrated Research for Agriculture, Tohoku National Agricultural Experiment Station, Harajuku-minami 50, Arai,
Fukushima 960-2156, and
b
Faculty of Applied Bio Science, Tokyo University of Agriculture, Sakuraoka 1-1-1, Setagaya-ku,
Tokyo 156-8502, Japan
Control of some soilborne pathogens may be achieved by use of decoy or catch crops. These stimulate the
germination of resting spores, resulting in limited expression of disease symptoms. Results achieved using this
approach are reported here using leafy daikon (radish, Raphanus sativus var. longipinnatus) for control of
Plasmodiophora brassicae, the cause of clubroot disease of Brassicaceae. Disease indices of Chinese cabbage plants
grown in pots that had previously contained leafy daikon were lower compared with pots where no plants had been
grown before (control pots). Numbers of resting spores of P. brassicae in soil in pots after cultivation with leafy
daikon were reduced by 71% compared with control pots when resting spores were recovered and counted directly.
In a field experiment, numbers of resting spores were reduced by 94% compared with the start of the experiment
when leafy daikon was grown in advance of Chinese cabbage, but there was no reduction in disease severity in the
Chinese cabbage. Plasmodiophora brassicae infected the root hairs of leafy daikon and those of Chinese cabbage, but
no clubs were found on leafy daikon roots. The results from pot trials indicate that leafy daikon may be useful as a
decoy crop for the control of clubroot disease in field crops.
Keywords: decoy plant, disease severity, fluorescence microscopy, spore germination
Introduction
Brassica crops such as Chinese cabbage (B. rapa var.
pekinensis) and cabbage (B. oleracea var. capitata) are
cropped continuously in Japan to exploit the limited
land available and their high financial returns. Clubroot
(Plasmodiophora brassicae) causes serious losses in
yield, especially in continuous monocultures. Currently,
disease control is achieved by the use of fungicides.
Concern regarding environmental pollution resulting
from agrochemicals requires that alternative control
strategies, possibly integrating chemical control with
husbandry techniques, are developed.
Planting nonhost or resistant crops such as lettuce
(Lactuca sativa), radish (a root type of daikon,
Raphanus sativus var. longipinnatus) and carrot (Dau-
cus carota), in advance of susceptible ones reportedly
reduced clubroot disease (Macfarlane, 1952; Kroll et al.,
1984; Ikegami, 1985). The satisfactory association of
such strategies with reductions of resting spore popula-
tions in soil has not been achieved. Yamagishi et al.
(1986), suggested that resistant crucifers might reduce
numbers of resting spores of P. brassicae, but this
resulted from an indirect estimation of resting spore
numbers using a dose±response curve obtained from
artificial inoculation tests.
Edible radish (daikon) is grown in Japan either as a
root type with thickened tap roots, or as a leafy type
with fibrous roots. The objective of the research
reported here was to determine the effects of leafy
daikon on the numbers of resting spores when
cultivated in advance of susceptible brassicas such as
Chinese cabbage, and on their resultant disease indices.
Materials and methods
Soil
Haplic Andosol soil (Anonymous, 1995) was collected
from land known to be free from infestation by P.
brassicae at Tohoku National Agricultural Experiment
Station (TNAES), Fukushima, Japan. Before use all soil
samples were passed through 5 mm mesh sieves.
Physical and chemical characteristics of the soil were
analysed using standard methods (Anonymous, 1986)
(Table 1).
Plant Pathology (2000) 49, 584±589
584
Q2000 BSPP
*To whom correspondence should be addressed.
²E-mail: [e-mail]
Accepted 30 May 2000.

---

Extraction and inoculation with resting spores of P.
brassicae
Resting spores of P. brassicae were extracted from
clubbed roots of Chinese cabbage grown in infested
fields at TNAES. Resting spores were extracted using the
method of Takahashi & Yamaguchi (1987), sprayed onto
the soil surface, and blended thoroughly using a mixer.
Plant husbandry
Thirteen seeds of leafy daikon (R. sativus var. long-
ipinnatus, breeding line CR-1) or Chinese cabbage (B.
rapa var. pekinensis, cv. Shin-Azuma) were sown into pots
(115 mm diameter, 110 mm high) for the first plantings.
Chinese cabbage (cv. Shin-Azuma) was used as the second
planting. All plants were grown in the greenhouse,
average temperature 238C, min. 158C, max. 358C; natural
light without additional lighting; photoperiod 10±14 h.
Four replicate pots constituted a treatment plot and
were placed into a container (330 £ 330 mm, 99 mm
high) ensuring that cross-contamination was avoided
between plots. Water or nutrients (N, 20%; P, 12%;
K, 16%) were applied through the base of each pot
from the container as required. The soil temperature in
pots was maintained at $ 258C by placing them on a
thermostatically controlled mat.
Measurement of disease index
Roots of each Chinese cabbage plant were removed and
disease severity was determined. Disease severity was
classified into categories 0±3 where 0 ˆ not clubbed; 1
ˆ lateral roots only clubbed; 2 ˆ ,50% tap root
clubbed; 3 ˆ $ 50% tap root clubbed.
The disease index of each pot was calculated by a
modification of the method of Dixon & Robinson
(1986) as follows:
Disease index ˆ 1 £ n
1
1 2 £ n
2
1
3 £ n
3
†/…3 £ N† £ 100
where N is the total number of plants, and n
123
the
number of plants classified as categories 1±3, respectively.
Disease indices were examined statistically using
Tukey's multiple range test (Sokal & Rohlf, 1995).
Experiment 1: influence of leafy daikon on disease
development in subsequent plants
Leafy daikon or alternatively Chinese cabbage were
cultivated for 5 weeks in soil that had been spray-
inoculated with 10
4
resting spores of P. brassicae g
21
.
The resultant roots were mixed into the soil and allowed
to decompose for a further 4 weeks. Chinese cabbage
plants were sown as the succeeding plant, grown for
5 weeks, and then assessed for clubroot development.
Experiment 2: influence of leafy daikon on disease
severity using several concentrations of inoculum
Leafy daikon or alternatively Chinese cabbage were
grown for 5 weeks in soil samples which had been
spray-inoculated separately with resting spores at 10
4
,
10
5
or 10
6
g
21
. The resultant roots of leafy daikon were
mixed into the soil and allowed to decompose for
4 weeks, whereas all clubbed roots of Chinese cabbage
were removed from the soil. Chinese cabbage seeds
were then sown and grown in the soil for 5 weeks, and
the disease index determined.
The number of resting spores was determined in those
soil samples artificially infested with 10
6
resting spores
g
21
after initial cultivation with either leafy daikon or
Chinese cabbage.
Determination of resting spore number of P. brassicae
Each soil sample (20 g) was mixed with 400 mL
distilled water containing 0´2% sodium hexametapho-
sphate, and mechanically shaken vigorously for 1 min.
The suspension was adjusted to pH 10´0 with 1 m
sodium hydroxide and sonicated for 5 min (Silent Sonic
UT-205, Sharp Co., Osaka, Japan; 200 W). The pH
after sonication was readjusted to 9´0 by addition of
sodium hydroxide and the sample mechanically shaken
vigorously for 1 min. The resultant suspension (40 mL)
was passed through a 38 mm mesh, resuspended in
distilled water, and made up to 100 mL final volume.
The final soil suspension was mixed with an equal
volume of 0´02% calcofluor white M2R solution for
staining (Takahashi & Yamaguchi, 1987). Numbers of
resting spores were determined using fluorescence
microscopy with differential phase contrast (Fig. 1a).
Experiment 3: root hair infection in leafy daikon
Leafy daikon or Chinese cabbage plants were cultivated
Table 1. Physical and chemical charateristics of Haplic Andosol soil
collected from Fukushima, Japan
Total carbon
4.37 %
Total nitrogen
0.28 %
C/N
15.54 ratio
Organic matter content
7.52 %
Maximum moisture holding capacity 68.1 %
Hydraulic conductivity
2.05 £ 10
23
cm s
21
pH (H
2
O)
6.01
Electric conductivity
0.04 mS cm
21
Cation exchange capacity
26.83 mequiv 100g
21
dry soil
Nitrate-nitrogen
1.70 mg 100g
21
dry soil
Phosphate (Bray No.2)
14.97 mg 100g
21
dry soil
Exchangeable base
(extraction with N KCI)
K
1
0.29 mequiv 100g
21
dry soil
Ca
21
8.09 mequiv 100g
21
dry soil
Mg
21
2.92 mequiv 100g
21
dry soil
Na
1
0.05 mequiv 100g
21
dry soil
Aluminium
1.09 mg 100g
21
dry soil
Phosphate absorption capacity
1821 mg P
2
O
5
100g
21
dry soil
585
Daikon as a decoy for clubroot
Q 2000 BSPP Plant Pathology (2000) 49, 584±589
13653059, 2000, 5, Downloaded from https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-3059.2000.00495.x by Uzbekistan Hinari NPL, Wiley Online Library on [03/04/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License

---

for 1 week at 238C using soil inoculated with 10
7
g
21
resting spores of P. brassicae. Subsequent root-hair
infection was investigated microscopically. Root-hair
infection was estimated as a percentage of root hairs
containing zoosporangia in sections cut 2±3 cm from the
hypocotyl and stained using previously published meth-
ods (Samuel & Garrett, 1944; Channon et al., 1964).
Experiment 4: reduction of resting spore numbers of P.
brassicae in the field
An infested field at TNAES was divided into small plots
(1´6 £ 7´5 m) with triple replication. Each plot received
fertilizers at planting (N, 60; P
2
O
5
, 150; K
2
O,
60 kg ha
21
). Leafy daikon was sown at a rate of
75 mL seeds per plot in April 1996 and grown for
8 weeks. Then plants were ploughed into the soil and
allowed to decompose for 6 weeks. Untreated control
plots were not planted.
Two soil samples were collected from each treatment
plot, and the number of resting spores in the soil was
counted as above. Each soil sample consisted of five
subsamples. The first subsample was collected from a
given point in the plot (depth 0±10 cm), then the other
four subsamples were collected from points 50 cm
distant in four directions (north, south, east, west) from
the first point. The five subsamples were then mixed
thoroughly in a plastic bag and kept at 48C before use.
Subsequently, Chinese cabbage was sown in the field
with an 80 cm row spacing and 30 cm intervals
between plants during August 1996. Fertilizers (N,
200; P
2
O
5
, 250; K
2
O, 200 kg ha
21
) were applied on
sowing, and plants were grown for 8 weeks until disease
severity was measured.
Results
Experiment 1
When leafy daikon was grown as the first plant no
symptoms were present on the roots, whereas the
Chinese cabbage seedlings were clubbed (Table 2).
When Chinese cabbage was grown in infested soil
that had previously contained no plants (control),
disease indices were almost 100, whereas for Chinese
cabbage grown in soil that had previously contained
Fig. 1 (a). Resting spores of Plasmodio-
phora brassicae in soil suspension shown as
fluorescent images with differential phase
contrast. (b). Zoosporangia of P. brassicae
in a root hair of leafy daikon. Bar, 10 mm.
586
H. Murakami et al.
Q 2000 BSPP Plant Pathology (2000) 49, 584±589
13653059, 2000, 5, Downloaded from https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-3059.2000.00495.x by Uzbekistan Hinari NPL, Wiley Online Library on [03/04/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License

---

leafy daikon, the disease index was reduced by <80%
compared with the control.
On the other hand, the second planting of Chinese
cabbage in pots that had previously contained Chinese
cabbage showed a high disease index (81), as clubbed
roots had been mixed into the soil.
Experiment 2
The disease indices calculated for the Chinese cabbage
planted initially increased according to concentration of
inoculum (18, 56 and 69 at 10
4
, 10
5
and 10
6
resting
spores g
21
, respectively). Leafy daikon was not clubbed
even when exposed to high inoculum concentrations,
and hence the disease index was zero.
Disease indices of Chinese cabbage grown after leafy
daikon were reduced by 86, 37 and 21% compared with
control pots at 10
4
, 10
5
and 10
6
sporesg
21
soil, respectively
(Fig. 2). The effect of a first planting with leafy daikon on
disease indices of subsequent Chinese cabbage decreased as
the concentration of resting spores in soil increased.
Disease indices in Chinese cabbage grown in pots
where the clubbed roots had been removed were reduced
by 88, 54 and 11% compared with control pots at 10
4
,
10
5
and 10
6
resting spores g
21
soil, respectively.
The numbers of resting spores g
21
soil after initial
cultivation were 18´8 £ 10
4
in control pots, 5´4 £ 10
4
in
leafy daikon pots and 4´2 £ 10
4
in Chinese cabbage pots
(Fig. 2). A reduction of approximately 71% in the
number of resting spores of P. brassicae in leafy daikon
pots was achieved following cultivation and decomposi-
tion for 5 and 4 weeks, respectively. In Chinese cabbage
pots, resting spore numbers were also reduced by 78%
by the removal of their clubbed roots from pots.
Experiment 3
Root hairs of both leafy daikon and Chinese cabbage
Fig. 2 Effects of leafy daikon as the initial plant on the subsequent disease indices of pot-grown Chinese cabbage grown as a second plant at
several concentrations of inoculum, and on the numbers of resting spores in soil (initial inoculum concentration 10
6
g
21
soil). Bars, SE. Means with
the same superscript were not significantly different (P , 0´05) according to Tukey's multiple range test at each inoculum concentration. Control
treatment, no initial planting.
Table 2. Influence of leafy daikon as a decoy plant on clubroot
development on first and second plantings of Chinese cabbage
Disease index
Treatments
First planting Second planting Chinese cabbage
Control*
93.5 ^ 1.6a**
Leafy daikon
0.0 ^ 0.0
18.7 ^ 5.2b
Chinese cabbage 99.0 ^ 0.9
80.6 ^ 6.1a
Data show mean ^ S.E.
*: Control is the treatment without initial planting
**: Means followed by the same letter are not significantly different
(P , 0.05) according to Tukey's multiple range test.
587
Daikon as a decoy for clubroot
Q 2000 BSPP Plant Pathology (2000) 49, 584±589
13653059, 2000, 5, Downloaded from https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-3059.2000.00495.x by Uzbekistan Hinari NPL, Wiley Online Library on [03/04/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License

---

were infected, and zoosporangia were formed by P.
brassicae (Fig. 1b). The percentage of infected root
hairs was 1´3% (SE 0´2) for leafy daikon and 2´7% (SE
1´1) for Chinese cabbage. Further developmental stages
of P. brassicae and subsequent clubbing on the roots of
leafy daikon were not observed.
Experiment 4
The number of resting spores was reduced by 94%
compared to the start of the experiment (7´4 £ 10
5
)
following cultivation of leafy daikon (0´4 £ 10
5)
. In
control plots the number of resting spores in soil was
slightly reduced to 3´4 £ 10
5
(Fig. 3), but this was not
significant.
There was no reduction in disease index of Chinese
cabbage grown after initial plantings of leafy daikon in
this field experiment.
Discussion
Macfarlane (1952) investigated decoy plants using
counts of root-hair infection in secondary crops of
cabbage. He showed that root-hair infections in
cabbage seedlings were lower where crucifers or
ryegrass had been previously grown, compared with
the effects of other noncrucifers. Kroll et al. (1984)
reported that colonization and club formation were
significantly reduced when susceptible and resistant
radish cultivars were grown together, in comparison
with treatments using only susceptible plants. Subse-
quently, Ikegami (1985) showed that fallowing soil and
use of the root type of daikon were most effective in
reducing clubroot. Sowing of green soybean (Glycine
max), lettuce (Lactuca sativa), spinach (Spinacia oler-
acea), Italian ryegrass (Lolium multiflorum) and carrot
(Daucus carota) were also associated with decreased
clubroot disease indices of succeeding plantings of
susceptible brassicas. In soil heavily infested with P.
brassicae, however, repeated cropping with daikon was
necessary to achieve a decreased disease index. Yamagishi
et al. (1986) suggested that resistant cruciferous plants
reduced the numbers of residual resting spores after
continuous cultivation for 4 years. However, the
satisfactory association of such strategies with a
reduction of resting spore populations in soil has not
been achieved.
In the research reported here, the reduction of resting
spore numbers associated with soil planted with leafy
daikon was determined by direct counting using
fluorescence microscopy. Planting leafy daikon reduced
the numbers of resting spores in soil by 71% compared
to uncropped control pots. Root hairs of leafy daikon
became infected but without further symptom develop-
ment, confirming previous work (Ikegami, 1992),
resulting in fewer resting spores being returned to the
Fig. 3 Effects of leafy daikon as the initial plant on the subsequent disease indices of Chinese cabbage grown as a second plant in the field, and
on the numbers of resting spores in soil. Bars, SE. Means with the same superscript were not significantly different (P , 0´05) according to
Tukey's multiple range test. Control treatment, no initial planting.
588
H. Murakami et al.
Q 2000 BSPP Plant Pathology (2000) 49, 584±589
13653059, 2000, 5, Downloaded from https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-3059.2000.00495.x by Uzbekistan Hinari NPL, Wiley Online Library on [03/04/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License

---

soil, and subsequently a reduction of disease develop-
ment in susceptible plants. Results showed that leafy
daikon functioned as a decoy plant as defined by
Macfarlane (1952) when used in crop rotations.
Disease reduction by initial cultivation of leafy
daikon was less in soil with a high inoculum concentra-
tion compared with soil having a lower concentration of
resting spores of P. brassicae. Previously Voorrips
(1996) showed that the relationship between resting
spore numbers in soil and disease indices followed a
sigmoid dose±response curve. Such a response in this
study indicates that even if the rate of reduction in
resting spore numbers by planting leafy daikon is
similar at all inoculum concentrations, the decline in
disease index would be less at high inoculum concen-
trations compared with lower ones. The finding that
leafy daikon planted into a heavily infested field
reduced resting spore numbers, but failed to decrease
disease severity of Chinese cabbage, may support this
hypothesis. Thus the assessment of resting spore
concentrations and development of dose±response
curves in field situations are prerequisites for the
effective use of decoy cropping for control of P.
brassicae.
Since leafy daikon does not develop clubs, it can be
ploughed into the soil following use as a decoy crop.
Numbers of resting spores per field may be expected to
decline after use of fibrous-rooted leafy daikon com-
pared with the root-type brassicas, because it is sown at
higher densities.
The results reported here demonstrate that leafy
daikon could be used as an initial decoy plant to reduce
resting spore numbers in soil, and may decrease
subsequent clubroot disease.
Acknowledgements
We thank Dr T. Kanno (National Research Institute of
Vegetables, Ornamental Plants and Tea, Japan) for
valuable suggestions during the work and Dr N.
Matsumoto (National Institute of Agro-Environmental
Science, Japan) for reading the manuscript critically.
References
Anonymous, 1986. Standard Methods for Measurement and
Analysis of Soil. Tokyo: Hakuyusha.
Anonymous, 1995. Classification of Cultivated Soils in Japan.
Third Approximation. Miscellaneous publication No. 17.
Tsukuba Japan: National Institute of Agro-environmental
Sciences.
Channon AG, Flint AE, Hilton RAL, 1964. A quantitative
laboratory method for inoculating cabbage seedlings with
Plasmodiophora brassicae Woron. Annals of Applied Biol-
ogy 54, 71±6.
Dixon GR, Robinson DL, 1986. The susceptibility of Brassica
oleracea cultivars to Plasmodiophora brassicae (clubroot).
Plant Pathology 35, 101±7.
Ikegami H, 1985. Decrease of clubroot fungus by cultivation of
different crops in heavily infested soil. Research Bulletin of
the Faculty of Agriculture, Gifu University 50, 19±32.
Ikegami H, 1992. Ecology of Plasmodiophora brassicae and
control of clubroot disease. Soil Microorganisms 39, 1±10.
Kroll TK, Moore LD, Lacy GH, 1984. Interplanting suscep-
tible and resistant radish cultivars reduces colonization by
Plasmodiophora brassicae. HortScience 19, 403±4.
Macfarlane I, 1952. Factors affecting the survival of Plasmo-
diophora brassicae Wor. in the soil and its assessment by a
host test. Annals of Applied Biology 39, 239±56.
Samuel G, Garrett SD, 1944. The infected root-hair count for
estimating the activity of Plasmodiophora brassicae Woron.
in the soil. Annals of Applied Biology 32, 96±101.
Sokal RR, Rohlf FJ, 1995. Biometry. 3rd edn. New York:
Freeman, 247±52.
Takahashi K, Yamaguchi T, 1987. An improved method for
estimating the number of resting spores of Plasmodiophora
brassicae in soil. Annals of the Phytopathological Society of
Japan 53, 507±15.
Voorrips RE, 1996. A one-hit model for the infection of
clubroot-susceptible cabbage (Brassica oleracea var. capi-
tata) by Plasmodiophora brassicae at various inoculum
densities. European Journal of Plant Pathology 102, 109±
14.
Yamagishi H, Yoshikawa H, Ashizawa M, Hida K, Yui S,
1986. Effects of resistant plants as a catch crop on the
reduction of resting spores of clubroot (Plasmodiophora
brassicae Woron.) in soil. Journal of the Japanese Society for
Horticultural Science 54, 460±6.
589
Daikon as a decoy for clubroot
Q 2000 BSPP Plant Pathology (2000) 49, 584±589
13653059, 2000, 5, Downloaded from https://bsppjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-3059.2000.00495.x by Uzbekistan Hinari NPL, Wiley Online Library on [03/04/2023]. See the Terms and Conditions (https://onlinelibrary.wiley.com/terms-and-conditions) on Wiley Online Library for rules of use; OA articles are governed by the applicable Creative Commons License