Mavzu: dnk ajratish uchun namunalar yig’ish, eritmalar va asboblarni tayyorlash

Mavzu: DNK ajratish uchun namunalar yig’ish, eritmalar va asboblarni tayyorlash
Genom DNK ajratish uchun eritmalar va asboblarni tayyorlash
Ishning maqsadi: E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam qonidan genom DNK sini hamda DNK namunalarini ajratish printsiplari va usullari bilan tanishish.
Ishning vazifasi:E.coli bakteriyasi hujayralaridan plazmid DNK sini va odam qonidan genom DNK sini ajratib olish koʼnikmalarini shakllantirish.
Nazariy qism. Plazmidalar - hujayraning avtonom ravishda replikatsiya boʼladigan genetik elementlari boʼlib, xalqasimon tuzilishiga ega DNK molekulasidan iborat. Plazmid DNK sini ajratib olish usuli bakteriya plazmidalarining tuzilishi jihatidan genom DNK siga nisbatan kichik oʼlchamda boʼlishi va yopiq halqasimon koʼrinishga ega boʼlganligiga asoslanadi. Bunda dastlabki bosqich bakteriya hujayralariga EDTА va lizotsim (grammanfiy bakteriyalarda) bilan ishlov berib ularni sferoplastlarini hosil qilinadi. EDTА metall ionlari bilan xelat hosil qilib, DNK ni kationga bogʼliq nukleazalar taʼsiridan himoya qiladi. Olinadigan sferoplastlarning tezda lizis boʼlib ketishini oldini olish maqsadida reaktsiyani izotonik eritmalar (saxaroza yoki boshqa moddaning ancha yuqori kontsentratsiyasi) da olib boriladi. Soʼngra sferoplastlarni lizis qilinadi. Buning uchun, detergentlar qoʼshishni tavsiya qilingan. Hujayra qobigʼi bilan bogʼlangan qoldiqlar va bakteriya xromosomasining boʼlaklarini sentrifugalash yoki filьtrlash yoʼli bilan olib tashlash mumkin.
Plazmid DNK sini ajratish usullari orasida bakteriyalar hujayralarini ishqor yordamida lizis qilish usuli ( Birnboym – Doli usuli ) va uning modifikatsiyalari koʼproq ishlatiladi. Bu usuldan mini-preparatlar olishda ham DNK ni yirik hajmda ajratib olishda ham keng qoʼllaniladi. Ushbu usul ishqoriy muhitda (~rN 12,0–12,5) DNK molekulalarining chiziqli strukturasining denaturatsiyasi (qoʼsh xalqaning yozilishi), ayni vaqtda yopiq xalqali molekulalarni esa denaturatsiyaga uchramasligi yoki oz miqdorda va qaytar darajada denaturatsiyaga uchrashiga asoslangan.
Hujayra ekstraktini tuzlarning yuqori kontsentratsiyasida neytrallanganda, oqsillar, genom DNK si va hujayra RNK si choʼkmaga tushadi. Bunga tuzlarning yuqori kontsentratsiyasida bir zanjirli DNK va RNK molekulalarining denaturatsiyasidan keyin tasodifiy va tartibsiz ravishda reassotsiatsiyalanishi sabab boʼladi. Reaktsiyani natriy dodetsilsulfat Na (SDS) ishtirokida olib borilganligi uchun hujayra RNK sining katta qismi oqsillar bilan birga choʼkmaga tushadi. Preparatdagi (ichki molekulyar qoʼsh zanjirli uchastkalari oson hosil boʼlganligi sababli, asosan, transport RNK si nisbatan oson renaturatsiyalanadi va tuzning yuqori kontsentratsiyasida erib ketadi) hujayra RNK si ning qolgan qismini RNKaza А bilan yoʼqotiladi.
Sentrifugalash yoʼli bilan choʼkmadan holi qilingan plazmid DNK sini tiniqlashgan hujayra lizatidan etanol yoki izopropanol yordamida choʼktiriladi. Bunday DNK preparatidan bir qancha maqsadlarda, masalan, restriktsion tahlillar uchun foydalanish mumkin. Koʼplab alohida tadqiqotlar uchun DNK ning bir muncha toza preparativ shakllari zarur boʼladi, masalan, klonlash chun fragmentlar tayyorlashda yoki transfektsiyani amalga oshirishda DNK keyingi tozalash boqichlari oʼtkaziladi.
Deyarli barcha molekulyar biologik tadqiqotlar uchun muvofiq keladigan kichik oʼlchamdagi DNK ning yuqori darajadagi toza preparatlarni olish uchun DNK ni shishadan tayyorlangan filьtrli kolonkalarda (glass), kvarts usulida tozalash (silicaslurries) yoki silikagelь (silica-gelmembrane) bilan tozalash usullari keng qoʼllaniladi. Bunda DNK xaotrop tuzining yuqori kontsentratsiyali eritmasida qaytar ravishda shisha membrana yuzasiga sorbtsiyalanadi va qolgan aralashmalarni xaotrop tuzi va 70% li etanol bilan yuviladi. Soʼngra tozalangan DNK kichik ionli kuchlanishga ega buferda ajratib olinadi (elyuirlanadi). Kam miqdordagi plazmid DNK sini yoki uning fragmentlarini xuddi shunday silikat filьtrli sentrifuga mini-kolonkalarida tozalash usuli ham koʼp qoʼllaniladi. Bunday toʼplamlarni koʼplab firmalar tomonidan ishlab chiqariladi.
Odam genom DNK sini ajratib olishda yadroga ega istalgan hujayradan foydalanish mumkin. Odam materiali sifatida koʼpincha leykotsitlar, bukkal hujayralar (yonoq epiteliysi hujayralari) qoʼllaniladi. Qanday hujayra ishlatilishiga koʼra, toza mahsulotning maksimal miqdorini olishga imkon yaratadigan DNK ajratishning optimal usullarini tanlash kerak boʼladi. Genom DNK sini ajratib olish uchun plazmatik va yadro membranalarini yorib, hujayra oqsillaridan holi qilinadi. Nuklein kislotalardan oqsillarni olib tashlash uchun ularni fenolom va (yoki) xloroform bilan eksraktsiya qilinadi. Hujayra lizatlaridan DNK ajratishda oqsillarni yoʼqotish uchun koʼpincha oqsillarning keng spektriga nisbatan faol boʼlgan proteolitik fermentlar, masalan, proteinaza K bilan gidroliz qilinadi