Medicina veterinária – Aluno (a): informaçÕes gerais 1



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Instituto de Biociências – IBB
Departamento de Microbiologia e Imunologia


Disciplina de Microbiologia Veterinária

ROTEIROS PARA AS AULAS PRÁTICAS CICLO DE BACTERIOLOGIA

MEDICINA VETERINÁRIA –




Aluno (a): _____________________________________

INFORMAÇÕES GERAIS


1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do ambiente fora do laboratório.

2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados.

3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.).

4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.

5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.

6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que deixe os pés expostos.

EQUIPAMENTOS E MATERIAIS COMUMENTE UTILIZADOS EM LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA
1. Alça e agulha de platina

2. Bico de Bunsen

3. Placas de Petri e tubos de ensaio

4. Meios de cultura

5. Solução salina estéril

6. Pipetas e pipetas Pasteur, zaragatoas (“swabs”)

7. Lâminas e lamínulas para microscopia

8. Corantes

9. Microscópio

10. Estufa

11. Banho-maria

12. Autoclave

13. Forno Pasteur
Cuidados para se evitar contaminação de culturas
1) A alça e agulha de platina devem ser flambadas, isto é, aquecidas na chama do bico de Bunsen até se tornarem vermelhas, antes e depois de qualquer procedimento de semeadura. A flambagem é mais facilmente e eficientemente conseguida mantendo-se a agulha ou alça num ângulo de 45º em relação à mesa de trabalho. Antes da coleta do material, deve-se resfriar o instrumento, na parede do tubo, no próprio meio estéril, ou simplesmente aguardando o seu desaquecimento natural por alguns segundos.
2) Em relação às semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar a boca dos mesmos após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de algodão deve ser segurado pelo dedo mínimo da mão oposta à que segura o tubo e nunca deixado sobre a bancada.

3) As pipetas são previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua utilização e ao mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a inferior (ponta da pipeta). Depois de utilizada, a pipeta deverá ser colocada dentro de um recipiente apropriado, contendo solução desinfetante.

4) Todo recipiente (placas de Petri ou tubos de ensaio) com cultura ou meio estéril deverá ser manuseado com cuidado de modo a não ficarem abertos e expostos ao ambiente. Com esta medida e mais a exigência de abri-los somente próximo ao bico de Bunsen em tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou simples inspeção, será evitada a sua contaminação por microrganismos do ar. Uma vez semeados, devem ser incubados em estufa. As placas de Petri devem ser envolvidas por filme plástico (tipo Magipack) antes de ser colocadas na estufa e devem permanecer com as tampas voltadas para baixo.
Observação de lâminas ao microscópio
Nos exercícios de:
bacteriologia, as lâminas contendo esfregaços de material fixado e corado sempre serão observadas através de objetiva de imersão;

micologia, em geral as lâminas são inicialmente observadas no menor aumento e a seguir nos aumentos maiores (até 40X), sem necessariamente empregar a objetiva de imersão. As lâminas de esfregaços de levedura são examinadas como em bacteriologia.

Após a observação das lâminas de esfregaços, estas deverão ser colocadas em recipiente com detergente, especificamente destinado a este fim. As lâminas permanentes deverão ser deixadas sobre a bancada.

Depois de utilizados, os microscópios deverão ser limpos e devidamente guardados.
PRÁTICA 1 - MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DAS BACTÉRIAS

I - Morfologia
1. As bactérias de um modo geral, apresentam-se sob a forma de:

a) cocos: células esféricas,

b) bacilos: células cilíndricas, em formas de bastonetes,


  1. espirilos: células espiraladas, d) vibriões

Estas formas básicas estão sujeitas a variações, caso em que são denominadas de formas pleomórficas ou formas de involução.


2. Agrupamentos
Segundo o (s) plano (s) de divisão celular e a disposição das células entre si, as bactérias podem apresentar-se em agrupamentos:

a) diplococos , b) estafilococos, c) estreptococos, d) estreptobacilos


II - Coloração
1. Coloração de Gram
Este método de coloração permite a classificação das bactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas:
Gram positivas: são bactérias que não se deixam descorar quando submetidas à ação de solventes orgânicos (álcool, éter, etc.) e permanecem com a cor do cristal violeta.
 Bactérias Gram positivas  cor azul
Gram negativas: São, portanto, aquelas que se deixam descorar pelo solvente orgânico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina).
 Bactérias Gram negativas  cor vermelha
2. Coloração de Ziehl-Neelsen
Constitui um método específico para a coloração das micobactérias (ex.: bacilo de Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactérias se caracterizam por resistirem à descoloração por uma mistura de álcool-ácido clorídrico, depois de tratadas com fucsina fenicada e azul de metileno, permanecendo com a cor da primeiro corante. Por apresentarem esta propriedade, estas bactérias são denominadas bacilos álcool ácido resistentes (BAAR).
 B.A.A.R  cor vermelha
EXERCÍCIOS
A) Coloração pelo Método de Gram
Material
- Lâmina com esfregaço bacteriano da cultura A

- Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, álcool, fucsina


Técnica
1. Cobrir o esfregaço bacteriano com violeta genciana e aguardar um minuto.

2. Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto.

5. Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.

6. Lavar a lâmina em água corrente.

7. Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto.

8. Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro.

9. Observar ao microscópio e desenhar as lâminas das culturas A, B, C e D.
OBS: o esfregaço da Cultura A foi preparado conforme a seguir:
- Com o auxílio da alça de platina, fazer esfregaços bem finos sobre a lâmina de microscopia. Esperar secar.

- Fixar os esfregaços, passando a lâmina três vezes sobre a chama do bico de Bunsen.

- Deixar a lâmina esfriar para seguir com a coloração de Gram.
D
Lâmina B

Forma e arranjo:_____________________

Gram:_________________
esenhos:


Lâmina A

Forma e arranjo:_____________________

Gram:_________________



Lâmina C

Forma e arranjo:_____________________

Gram:_________________


Lâmina D

Forma e arranjo:_____________________

Gram:_________________




B) Coloração de Bactérias pelo Método de Ziehl-Neelsen

Material
- Lâmina de microscopia contendo esfregaço de escarro

- Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, álcool-ácido e azul de metileno.


Técnica
1. Cobrir a lâmina com fucsina fenicada. Com auxílio do bico de Bunsen, aquecer a preparação até a emissão de vapores. Manter o aquecimento durante 5 minutos. Não deixar a fucsina ferver ou secar.

2. Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo álcool-ácido.

3. Lavar em água corrente.

4. Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno. Esperar entre 30 segundos a 1 minuto.

5. Lavar em água corrente e secar com papel de filtro.


  1. Observar ao microscópio e desenhar.



PRÁTICA 2 – ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA
a) Estruturas externas

  • Flagelos

  • Fímbrias ou pili

  • Cápsula

  • Parede celular

  • Membrana citoplasmática

b) Estruturas internas



  • Esporo

  • Mesossomos

  • Ribossomos

  • Cromossomos

  • Grânulos de reserva

  • Plasmídios


EXERCÍCIO
Demonstração de algumas estruturas da célula bacteriana.
Observar lâminas previamente preparadas das seguintes estruturas da célula bacteriana: cápsula e esporos. Desenhar.

CÁPSULA ESPOROS



PRÁTICA 3 - MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO
A) Meios de Cultura

Para o cultivo e identificação das bactérias são utilizadas soluções e substâncias nutritivas, denominadas meios de cultura que podem ser classificados com base na sua constituição, ou seja, quanto às substâncias nutritivas que os compõem, quanto ao seu estado físico e quanto à capacidade seletiva e diferencial que apresentam.


Quanto às Substâncias Nutritivas:

1. Meios Sintéticos: quando as substâncias que os compõem são químicamente definidas e a concentração e características de cada ingrediente são conhecidas com exatidão.

2. Meios Simples: quando constituídos somente de substâncias essenciais para o crescimento de algumas bactérias.

3. Meios Complexos: quando se adicionam ao meio simples, substâncias orgânicas complexas.


Quanto ao Estado Físico:

1. Meios Líquidos: também denominados caldos.

2. Meios Sólidos: quando se adiciona ao caldo l, 5% a 2% de ágar.

3. Meios Semi-sólidos: quando se adiciona ágar ao caldo, na concentração igual ou menor que 0,5%.


Quanto à capacidade seletiva e diferencial:

1. Meios Enriquecidos: são meios simples adicionados de certas substâncias como soro, sangue, extrato de levedura, etc. Estes meios servem para o cultivo de bactérias que necessitam de substratos complexos. Ex: meios de ágar sangue, de ágar chocolate, de ágar soro, etc.

2. Meios Seletivos: são meios de cultura contendo substâncias que impedem o crescimento de certas bactérias sem inibir o crescimento de outras. Ex: Meios de MacConkey, de Tetrationato, de Verde Brilhante, etc.

3. Meios Diferenciais: são aqueles que contêm substâncias que, quando utilizadas, indicam certas características da bactéria. Ex: a) O sangue quando adicionado ao meio de cultura, indica se uma bactéria é hemolítica ou não. Nesse caso, o meio além de enriquecido é também diferencial. Ex: meio de ágar-sangue. b) A lactose quando adicionada ao meio juntamente com um indicador de pH, permite distinguir as bactérias que fermentam esse açúcar das que não o fermentam. Ex: meio de MacConkey.

4. Meios de Enriquecimento: são aqueles que inibem o crescimento de certas bactérias, porém favorecem o crescimento de outras. Ex: meios de tetrationato e de selenito permitem maior crescimento de bactérias do gênero Salmonella.

5. Além desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo, meios para conservação de bactérias, meios para a contagem do número de bactérias, etc.


B) Condições Físicas de Cultivo

Além do meio de cultura, outros fatores devem ser levados em consideração para o cultivo de bactérias, tais como:

1. pH do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de 7.

2. Temperatura de crescimento: geralmente 37ºC

Quando as bactérias crescem em temperaturas baixas (10 a 20ºC) são denominadas de psicrófilas.

Quando as bactérias crescem em temperaturas médias (20 a 40ºC) são denominadas de mesófilas.

Quando as bactérias crescem em temperaturas mais altas (50 a 60ºC) são denominadas termófilas.

3. Teor de Oxigênio:

a) Bactérias aeróbias estritas: são aquelas que só crescem na presença de oxigênio.

b) Bactérias anaeróbias estritas: crescem somente na ausência de oxigênio.

c) Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência de oxigênio.

d) Bactérias microaerófilas: crescem somente em atmosfera com baixo teor de oxigênio.


EXERCÍCIOS
A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias
Material

- Cultura A

- Cultura B

- Cultura C

- Caldo sintético

- Caldo comum

- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)

- Alça de platina


Técnica

l. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.

2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.

3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).

4. Anotar os resultados.


Cultura

Crescimento em




Caldo sintético

Caldo comum

Caldo glicosado

A










B










C












B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano
Material

- Meio de Tiogel

- Caldo simples

- Culturas A, D e F

- Pipeta Pasteur

- Alça de platina


Técnica
Com a pipeta Pasteur, semear cada uma das culturas em tubos de tiogel. Em seguida, semear a cultura F, com alça de platina, em caldo simples. Colocar todos os tubos na estufa. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do crescimento e, no caldo simples, se houve ou não crescimento.


Culturas

Crescimento

Local de crescimento no meio de tiogel




no caldo simples

Superfície

Toda extensão do Meio

Base do Meio

A













D













F















PRÁTICA 4 - ALGUMAS ATIVIDADES BIOQUÍMICAS DAS BACTÉRIAS e MOVIMENTO BACTERIANO
Depois de estudarmos a forma, coloração, necessidades nutritivas e outras características (temperatura ótima de crescimento, relação com o oxigênio, etc.) de uma bactéria, torna-se necessário conhecer as suas atividades bioquímicas para que possamos determinar a família, gênero ou espécie da bactéria em estudo. Os métodos utilizados para este fim são qualitativos e variam de acordo com o tipo de atividade que se pretende pesquisar. Estudaremos aqui alguns dos métodos de interesse geral, deixando para o momento oportuno aqueles específicos para determinados grupos de bactérias.

De modo geral, quando estudamos as atividades bioquímicas de uma bactéria, procuramos verificar, também, se ela é móvel ou imóvel, o que podemos fazer pela observação do seu tipo de crescimento em ágar semi-sólido. Já vimos que o movimento da maioria das bactérias depende de seus flagelos, e a verificação da presença destas estruturas, indiretamente feita pela prova de motilidade, é bastante importante para a sua identificação.


EXERCÍCIOS
A) Pesquisa da Catalase
Princípio

A catalase é uma enzima produzida por certas bactérias, que desdobra a água oxigenada (H2O2) em água (H2O) e oxigênio (O2). Para pesquisá-la, basta colocar algumas gotas de água oxigenada sobre a cultura. Estando a catalase presente, haverá o desprendimento de bolhas, indicando a presença de oxigênio no meio.


Material
- Cultura A em caldo

- Cultura B em caldo

- Água oxigenada a l0%
Técnica
Colocar na cultura A algumas gotas de água oxigenada e verificar se há ou não aparecimento de bolhas. Anotar os resultados e fazer o mesmo com a cultura B.





Cultura A

Cultura B

Catalase







Gênero








B) Pesquisa de Citocromo-oxidase
Princípio
A citocromo-oxidase é a enzima que oxida o citocromo C. A presença do citocromo C é demonstrada tratando-se a cultura com uma solução de p-fenileno-diamina. Quando presente, a p-fenileno-diamina é oxidada e há o surgimento de cor vermelha que muda gradativamente para azul, pelo contato com a luz. Quando ausente, a cor do crescimento não se altera.
Material
- Cultura C em ágar inclinado

- Cultura D em ágar inclinado

- Papel de filtro

- p-fenileno-diamina (solução aquosa a 1%)

- alça de platina
Técnica
1.Com a alça de platina, retire um pouco do crescimento da cultura C e coloque sobre o papel de filtro. Faça o mesmo com a cultura D, em outro ponto do papel.

2.Coloque uma gota da solução de p-fenileno-diamina em cada uma das culturas

3.Observe a ocorrência de variação de cor nas duas culturas. O aparecimento da cor vermelha indica a presença de citocromo-oxidase.





Cultura C

Cultura D

Oxidase







Gênero









C) Pesquisa do Movimento Bacteriano (prova de motilidade)
Princípio
As bactérias flageladas crescem além do ponto de inóculo (“picada”), quando semeadas em ágar semi-sólido com uma agulha de platina. As bactérias que não possuem flagelos crescem apenas no ponto de inóculo.
Material

- Tubo com ágar semi-sólido

- Cultura C

- Cultura F

- Agulha de platina
Técnica
1. Inocular, por “picada”, as culturas C e F (uma em cada tubo de ágar semi-sólido).

2. Incubar a 37ºC até o dia seguinte.

3. Observar o crescimento.

Resultado positivo - crescimento bacteriano além do ponto de inóculo

negativo - crescimento bacteriano apenas no ponto de inóculo

4. Anote os resultados.







Motilidade

gênero

Cultura C







Cultura F








PRÁTICA 5 - CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS

I - Ação dos agentes físicos sobre as bactérias

O calor e várias formas de radiação, bem como outros processos físicos, são frequentemente utilizados com a finalidade de destruir bactérias e outros microrganismos. Verificaremos a ação do calor úmido sobre duas bactérias, uma esporulada e outra não esporulada.


EXERCÍCIOS
A) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana não esporulada
Material

- Cultura A em salina (bactéria não esporulada)

- Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada

- Placa de Petri contendo ágar nutriente

- Banho-Maria a 60º C

- Alça de Platina


Técnica
1. Divida a placa de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes períodos de tempo em cada um: 0’, 5’, 10’ e 15’.

2. Coletar com a alça de platina, um pouco do crescimento da cultura A e passar para o tubo contendo solução salina. Homogeneizar a suspensão.

3. Inocule (com alça de platina) a suspensão no quadrante correspondente ao tempo 0’.

4. Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15', retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri (proceda exatamente como no item 2).

5. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.


  1. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento)




Tempo de aquecimento

0’

5’

10’

15’














B) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada
Material

- Cultura E em salina (bactéria esporulada)

- Tubo contendo 1 ml de solução salina esterilizada

- Placa de Petri contendo ágar nutriente

- Banho-maria a 60º C

- Alça de platina


Técnica


  • Proceda como no exercício A e anote os resultados.




Tempo de aquecimento

0’

5’

10’

15’














II - Ação dos agentes químicos sobre as bactérias

A ação dos agentes químicos sobre as bactérias é muito importante, do ponto de vista prático e todos devem se familiarizar com estas substâncias, suas ações e limitações. Verificaremos a ação do fenol e do mertiolato sobre algumas bactérias.


C) Ação do fenol a 0,8% de acordo com o tempo.

Material

- Tubo contendo solução aquosa a 0,8% de fenol (10 ml)

- Cultura A em caldo

- Placa de Petri contendo ágar nutriente

- Alça de platina

- Pipeta de 1 ml esterilizada


Técnica

1. Adicione, com a pipeta, 1 ml da cultura A aos 10 ml da solução de fenol e misture bem.

2. Imediatamente e após 5', 10' e 15', retire com a alça de platina, amostra da mistura (fenol mais cultura A) e inocule nos respectivos quadrantes da placa de Petri (0', 5', 10' e 15').

3. Deixe a placa na estufa, a 37oC, até o dia seguinte.

4.Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++) em cada um dos quadrantes da placa, em função do tempo de tratamento da cultura com o fenol.


Tempo de tratamento com o fenol

0’

5’

10’

15’














D) Ação de anti-séptico sobre as bactérias da pele
Material

- Placa de Petri contendo ágar nutriente

- Zaragatoas estéreis

- Mertiolato

- Solução salina estéril
Técnica

1. Divida a placa de ágar nutriente em duas partes.

2. Umedeça uma zaragatoa em solução salina e esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos, numa extensão de aproximadamente 4 cm2. Inocule, a seguir, numa das metades da placa de ágar nutriente.

3. Umedeça uma outra zaragatoa com mertiolato e esfregue-a no dorso da outra mão, em área semelhante.

4. Espere 5 minutos para que haja ação do antisséptico e secagem da superfície. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida com salina, tomando cuidado para não atingir a área não tratada. Inocule a outra metade da placa de ágar.

5. Deixe a placa na estufa, a 37o C, até o dia seguinte.

6. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++), em função da presença do mertiolato.


Tratamento

Sem anti-séptico

Com anti-séptico









PRÁTICA 6 - TRANSFERÊNCIA DE RESISTÊNCIA A DROGAS ENTRE BACTÉRIAS
Os genes que conferem resistência bacteriana a drogas frequentemente localizam-se em partículas de DNA extracromossômico chamadas plasmídios, bastante comuns em microrganismos patogênicos. Os plasmídios podem ser transferidos de uma célula bacteriana para outra e, desta forma, os genes de resistência a drogas podem ser disseminados numa população bacteriana, através dos mesmos, a partir de uma bactéria resistente portadora. A transferência de plasmídios ocorre por conjugação ou por transformação. No primeiro caso, há necessidade de contato físico entre a bactéria portadora do plasmídio (doadora) e a bactéria receptora. A tranformação ocorre quando uma bactéria sensível a um dada droga torna-se resistente, ao incorporar DNA plasmidial presente no meio e que contem o gene para resistência ao antimicrobiano.

A conjugação é um fenômeno relativamente comum de transferência de plasmídios na natureza. Já a transformação é um mecanismo mais raro e normalmente é artificialmente induzida em laboratório em experimentos de tranferência de DNA cromossômico ou plasmidial. O exercício prático desta aula consistirá na transferência de resistência ao antibiótico canamicina, de uma Salmonella, para uma Escherichia coli, através de conjugação.


EXERCÍCIO
Material
- Meio de MacConkey

- Meio de MacConkey contendo Canamicina na concentração de 20 mg/ml

- Cultura em caldo da bactéria A (Salmonella sp, lactose -)

- Cultura em caldo da bacteria B (Escherichia coli, lactose +)

- Tubo de ensaio contendo mistura de cultura A mais cultura B (0,1 ml da cultura A + 0,1 ml da cultura B foram transferidos para 5 ml de caldo nutriente e esta mistura foi previamente incubada a 37º C, durante 18 horas)

- Alça de platina


Técnica

1. Dividir as placas de Mac Conkey (com e sem canamicina) em duas partes.

2. Semear, por esgotamento com a alça de platina, a cultura A numa das metades da placa de MacConkey contendo canamicina e a cultura B na outra metade. Incubar a 37º C até o dia seguinte.

3. Repetir o procedimento do item 2 na placa de Mac Conkey sem canamicina

4. Tomar uma alçada da mistura A + B e semear, por esgotamento, na placa de MacConkey contendo antibiótico. Incubar por 24 horas.

5. Observar ocorrência de crescimento da cultura A e B separadas e da mistura A+B.


Anotar os resultados




Crescimento em Mac Conkey

Lactose




Com Canamicina

Sem

Canamicina






Cultura A










Cultura B










Mistura A+B









Bactéria sensível - ausência de crescimento.

Bactéria resistente - presença de crescimento.

PRÁTICA 7 - DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS
Após o isolamento de uma bactéria de um processo infeccioso, é desejável em alguns casos, conhecer a sua sensibilidade ou resistência a vários antibióticos e quimioterápicos. Isto se consegue com o emprego de vários métodos, sendo que o método do disco de papel de filtro impregnado com solução da droga (Método de Bauer e Kirby) é o mais amplamente utilizado.

EXERCÍCIO
Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby
Material
- Cultura B em caldo BHI (Brain Heart Infusion): cinco colônias da cultura B foram semeadas em caldo BHI e incubadas a 37o C durante 4 horas.

- Placa de Petri contendo meio de Mueller-Hinton

- Discos de papel de filtro impregnado com soluções de drogas antimicrobianas

- Zaragatoa

- Agulha estéril

- Escala 0,5 de MacFarland

- Solução salina estéril

- Pipeta estéril

- Régua
Técnica
1. Transferir, com a pipeta, o crescimento da cultura B para o tubo contendo solução salina, ajustando a concentração de bactérias, conforme a escala 0,5 de MacFarland. O ajuste de concentração é feito por comparação da turbidez da cultura com a do tubo da escala.

2. Umedecer a zaragatoa neste crescimento de concentração padronizada; esgotar o excesso de cultura na parede do tubo e inocular uniformemente em toda a superfície da placa de Petri contendo o meio de Müeller-Hinton.

3. Esperar secar.

4. Colocar, sobre a superfície do ágar, com o auxílio de uma agulha estéril, os discos de papel de filtro impregnados com as drogas. A disposição dos discos deve obedecer o esquema da figura abaixo

5. Colocar a placa de Petri na estufa a 37º C, até o dia seguinte.

6. Com o auxílio de uma régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.

7. Consultar a tabela de referência, fornecida pelo instrutor, para interpretar os resultados e anotar no quadro da página seguinte.



Droga

Concentração (ug/ml)

Diâmetro do halo de inibição do crescimento

Interpretação*

1










2










3










4










5










* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário

PRÁTICA 8 - Gênero Staphylococcus

EXERCÍCIOS

A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever as características das colônias e verificar hemólise.



Cultura

Características das Colônias

Hemólise

A







B










B) Observar lâmina com esfregaços das culturas A e B (ver “Morfologia e coloração da bactérias”, página 1). Observar ao microscópio e desenhar.

Cultura A Cultura B


C) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B algumas gotas de água oxigenada. Observar a reação e anotar os resultados. (Obs., ver técnica na página 10)



Cultura

Prova da Catalase

A




B






D) Prova da Coagulase
Princípio
A coagulase é uma enzima, produzida por certas bactérias, que coagula o plasma sanguíneo.
Técnica
Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura B e anotar os resultados.
Resultado positivo - formação de coágulo.

negativo - suspensão inalterada





Cultura

Prova da Coagulase

A




B





E) Prova da DNAse
Princípio

A DNAse é uma enzima, produzida por certas bactérias, que hidrolisa o DNA. Para pesquisá-la, basta colocar ácido clorídrico (HCl) sobre as colônias a serem testadas. O HCl precipita o DNA contido na cultura, turvando o meio. Se a bactéria produzir DNAse, haverá hidrólise de DNA e conseqüentemente não turvação do meio de cultura, pois o HCl não precipita DNA hidrolisado.


Resultado:
Positivo: aparecimento de halo claro ao redor das colônias.

Negativo: turvação do meio.





Cultura

Prova da DNAse

A




B






F) Identificação das culturas


Cultura A




Cultura B




Esquema de identificação dos gÊneros

Staphylococcus e Micrococcus (família Micrococaceae)

Cocos Gram positivos

Isolados ou agrupados

Catalase +







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