No diabéticas Sin problemas cardiovasculares



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OBTENCIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES DE VENA DE CORDÓN UMBILICAL (HUVEC)

Material





  • Cordones umbilicales humanos:

  • Cordones de madres no fumadoras (menos de 15 cigarrillos al día)

  • No diabéticas

  • Sin problemas cardiovasculares

  • Sin infecciones (hepatitis viral, SIDA, etc.)

  • Cordones de 15- 20 cm sin punciones ni nudos.

  • Tienen que ser recogidos en frascos o bolsas estériles y conservados a 4ºC

  • Pueden ser utilizados de hasta una semana de antigüedad




  • Material estéril




  • Tijeras

  • flask T25

  • Placas petri

  • Falcon

  • Pinzas de cordón umbilical

  • Pinzas Kocher (tijeras con dientes)

  • Llave de tres pasos

  • Bisturíes

  • Agujas largas

  • Cánulas (agujas metálicas con la punta roma para evitar desgarrar la vena). Esterilizadas

  • Jeringas de 50 ml

  • Gasas estériles




  • Otro material necesario




  • Pinzas Hoefman

  • Mechero

  • Vaso de precipitados de 1000 ml

  • Vaso de precipitados de 100 ml




  • Reactivos




  • Solución Hanks (HBBS)

  • Suero fisiológico

  • Medio 199, Suero fetal (FCS y antibióticos penicilina /estreptomicina (P/S)

  • Colagenasa 0,03% (actividad 1.7 U/mg si es otra calcular) (15 ml de colagenasa/ 20 cm de cordón umbilical).


Preparación de materiales y reactivos


  • Colagenasa: pesar 0.15?? mg de colagenasa en balanza de precisión y echar en Falcon 20 . Echar 20 ml de HBBS de una botella nueva, agitar para disolver . Filtrar la colagenasa ya disuelta, en la botella de HBBS , asi obtenemos Colagenasa 0.03 % . El resto de colagenasa que no se utilice en el día , se puede congelar a -20 ºC.

  • Medio de cultivo primario : Se descongela 1 falcon de 50 ml de FCS y una alícuota de tubo de 10 ml con P/S y se echan al Medio 199 , filtrándolos. Así obtenemos Medio 199 , 10% FCS.

  • Poner en cabina de cultivos :

    • Vaso precipitados 1000 ml

    • Vaso precipitados 100 ml con etanol 96% (aquí dejaremos metidas los bisturís y tijeras , mientras no se estén utilizando)


*PROCURAR NO TOCAR EL ÉMBOLO DE LAS JERINGAS, NI PARA COGER NI PARA ECHAR LÍQUIDO.

Método


  1. Limpiar los cordones con una gasa para quitar la sangre y mirar si tienen punciones.




  1. Colocarlos sobre una bandeja de estufa cubierta de papel de filtro.




  1. Ya en la cabina de cultivos, colocar el cordón sobre una placa petri y cortar un extremo del cordón. Para ello utilizamos dos bisturís flameados. Con la mano izquierda hacemos un corte limpio en el cordón, apretando fuerte con el bisturí y con la derecha un corte de izquierda a derecha en el mismo sitio del corte anterior. Se desecha el extremo que sobra de cordón cortado. En este extremo se busca la vena, sin tocar con los dedos el centro del cordón, se puede buscar estirando un poco con el dedo que queda libre, y hacer que la vena sea visible. La vena es más ancha y gruesa que las 2 arterias umbilicales, así la podremos identificar.



  1. Poner la cánula en la llave de tres pasos y canular la vena umbilical con cuidado de no dañar la pared del vaso, y en un solo paso, es decir, sin hurgar en la vena, en vertical y de una sola vez. Colocar la aguja en la llave de tres pasos sin tocar ninguno de los extremos.




  1. Fijar la cánula al cordón umbilical con una pinza Hoefman, apretando el tornillo con un pinza Kocher, BIEN FUERTE, esto evitará cualquier líquido que va a entrar por la cánula salga por ese extremo.




  1. Lavar el cordón con 50- 60 ml de suero fisiológico. Es necesario que se haga el lavado con una presión suficiente para arrastrar restos sanguíneos y demás. Para ello , sujetamos con la mano izquierda el extremo del cordón por donde va a salir el líquido en el vaso de precipitados de 1000 ml, donde se irán desechando todos los líquidos ( suero , colagenasa, HBBS….) y con la derecha inyectamos los líquidos, en este caso el suero. Poner el tapón de la llave de tres pasos, en el extremo donde ponemos la jeringa, cuando hayamos terminado de manipular cada cordón.




  1. Preparar 2 jeringas con solución de colagenasa , para ir lo más rápidamente posible . Tratar el cordón con colagenasa 0.03%. Para ello se introduce la colagenasa, con la jeringa, a través de la llave de tres pasos. Se coloca la pinza de cordón umbilical, en el extremo libre y sobre el vaso de precipitados, sujetando el cordón y la pinza de cordón, con la mano izquierda. Con la mano derecha y manteniendo la jeringa a ras de la superficie de la cabina, se inyecta en el cordón la colagenasa, hasta que salga un poco de líquido. Esto se hace para quitar las burbujas de aire y con cuidado de perder la menor cantidad de colagenasa posible se cierra el extremo abierto con una pinza de cordón umbilical. Una vez esté cerrado el cordón se sigue añadiendo colagenasa hasta que el cordón esté más o menos tenso. Se cierra la llave de tres pasos, de modo que no entre se salga la colagenasa por ese extremo y se pone el taponcito blanco.




  1. Incubar 20 minutos exactos a 37ºC, para lo cual es útil haber puesto los cordones con el papel de filtro sobre una bandeja de estufa (el tiempo se cuenta desde que se introduce la solución colagenasa en el primer cordón).




  1. Tras la incubación, masajear suavemente el cordón para soltar bien las células. Este paso hay que hacerlo de manera rápida, porque la colagenasa sigue haciendo efecto. Se abre la llave de tres pasos, de modo que se pueda introducir HBBS con la jeringa. Arrastrarlas las células con 50 ml de Hanks recogiéndolas en un Falcon. Para ello, se coge el extremo del cordón pinzado con el ombliguero con la mano izquierda, se estira un poco y se corta con tijera flameada, desechando la parte pequeña que queda pinzada. El extremo libre, con mucho cuidado se pone encima del Falcon, con cuidado de no tocar el extremo del Falcon con el cordón ni tocar ese extremo con los dedos. En este momento se empieza a inyectar el HBBS. Es muy importante hacerlo con suficiente presión para conseguir una buena densidad de células. Una vez esté lleno, se deja colapsar el resto de solución que quedará en el cordón sobre otro Falcon. Este segundo Falcon tendrá, obviamente, menor densidad de células, por ello se marcará y se dejarán colapsar sobre él los sucesivos cordones hasta que se llene, entonces se marcará otro.




  1. Centrifugar las células 10 minutos a 1200 r.p.m.




  1. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio 199 , 10% de suero suplementado con Fungizona (se resuspende un vial con agua destilada esteril a 5mg/ml y se usa 2000x). Se echan 25 µl por cada 50 ml de medio.




  1. Hacer un pool con las células de los distintos cordones y poner 5 ml de ese pool en flask T25 (el número de flask se calcula según riqueza de pellet, pero generalmente se ponen 1flask/ 1-2 cordón).




  1. Al día siguiente: Mirar por el microscopio para ver el crecimiento de las células . Las células endoteliales estarán en los huecos que quedan entre los eritrocitos. Aspirar el medio del flask o retirar el medio y ponerlo en un nuevo flask mediano (rotulado como “HUVEC RESTOS”) , por si siguen pegándose células endoteliales tras el lavado.




  1. Lavado: En los flask pequeños con HUVEC se ponen 2-3 ml de HBBS , PBS.. , se aspira con pasteur de cristal larga , moviendo el flask , para que se despeguen los eritrocitos que queden pegados.

  2. Añadir 5 ml de Medio 199 complementado con FCS 10% de suero+fungizona. La fungizona se puede retirar pasados 3-4 días. Mirar de nuevo al microscopio y en este caso , al lavar los eritrocitos , sí se verán las HUVEC , adheridas en el flask.

  3. Primer pase 1:3 en flask mediano y con complementos (abajo)



Tras el primer pase crecer:


  • En flask gelatinizados (incubar los flask al menos un par de horas a 37º con una solución autoclavada de gelatina bovina 0.5% en agua y aspirar).

  • Con medio suplementado con factores :

  • ECGF preparar a 5mg/ml en salino, disolver un rato a 37º, filtrar y usar 100x

  • Heparina (a un vial de 5ml se le añaden 10ml de salino esteril y se usa 100x)




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