Tabela 5.22. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do
bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L, após o 26
o
ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.
Onde: H.H.=hidrolisado hemicelulósico; A.A.= Ácido acético.
Adicionalmente, a tabela 5.23 indica as variáveis de resposta calculadas
comparando-se os primeiros e os últimos ciclos, indicando que a técnica de
adaptação metabólica tende a promover melhores resultados de crescimento e
produção de etanol (5,2 g/L a 5,9 g/L), variando de diferentes proporções de
hidrolisado hemicelulósico, de 2,5 a 20% v/v, respectivamente; contudo, a
produtividade volumétrica foi inferior, variando de 0,074 g/L.h e 0,0614 g/L.h.
Ciclos
Tempo
(Dias)
H.H.
(%) v/v
A.A.
(g/L)
HMF
(mg/L)
Furfural
(mg/L)
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1-5
14
2,5
0,28
1,3
13,2
5,2
0,086
6-10
20
5
0,53
16,0
27,6
4,8
0,137
11-15
25
10
0,92
9,4
54,1
5,3
0,139
16-20
20
15
1,2
13,2
83,3
4,7
0,107
21-25
20
20
2,1
15,6
108,7
5,9
0,117
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
160
Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre diferentes
etapas de adaptação metabólica.
Variáveis medidas e calculadas
Ciclo 1-5 Ciclo 20-25
Etanol (g/L)*
5,2
5,9
Células (g/L)*
0,086
0,117
Produtividade (g/L.h)*
0,074
0,061
*Ao final do último ciclo
Observa-se que alguns fatores, como a inibição por compostos
presentes no hidrolisado e o tempo de crescimento foram superados; não
obstante, são necessárias melhorias na fermentação a partir do hidrolisado
ácido, através da continuação dos ciclos adaptativos, visando elevar os níveis
de tolerância dos inibidores, assim como os valores de produtividade
volumétrica.
II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de
aclimatação celular
Segundo Betancur et al. (2010), os microrganismos consomem o
substrato de forma mais eficiente quanto maior o grau de aclimatação, a
exemplo de processos de fermentação por Pichia stipitis a partir de hidrolisado
hemicelulósico. Portanto, mesmo que as células estejam previamente
adaptadas com a presença de inibidores, faz-se necessária a aclimatação
anteriormente ao inóculo. No presente trabalho, foram desenvolvidas 4
diferentes estratégias, conforme descrito no item 4.4.2.2 (Capítulo 4), cujos
resultados são apresentados na tabela 5.24.
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação.
Estratégias
Tempo*
(Dias)
H.H.*
% (v/v)
A.A.*
(mg/L)
HMF*
(g/L)
Furfural*
(mg/L)
Biomassa*
(g/L)
A
5
10
0,85
7,0
52,7
0,058
B
3
10
0,91
9,6
47,2
0,145
C
2
20
1,88
17,8
97,1
0,109
D
2
20
1,96
20,4
101,3
0,129
E
2
20
2,06
17,5
105,6
0,115
Onde: H.H.= hidrolisado hemicelulósico; A.A.= ácido acético; A=sem aclimatação;
B=aclimatação de 5% a 10% v/v de H.H.; C= aclimatação de 5% a 20%v/v de H.H.;
D=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em H.H., 10% v/v e
posterior centrifugação; E=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em
H.H., 20% v/v, e posterior centrifugação. *Valores referentes à última etapa de
propagação.
O processo de aclimatação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado
hemicelulósico adicionado do meio RMG
apresentou o melhor resultado, com
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
161
uma concentração celular de 0,09 g/L, superior aos valores encontrados para
uma única etapa de aclimatação celular (0,03 g/L) ou mesmo através de
centrifugação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de
5% a 20% v/v de hidrolisado (D), promovendo 0,08 e 0,07 g/L. Dessa forma,
pode-se concluir que a inclusão de duas etapas de aclimatação, de 5% v/v a
10% v/v de hidrolisado hemicelulósico (B), apresentaram efeito positivo sobre a
produção de biomassa, sendo a condição escolhida para propagação celular
nos experimentos futuros.
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através
de planejamentos experimentais sequenciais
Foram desenvolvidos dois Planejamentos Sequenciais de Superfície de
Resposta 2
2
, avaliando a concentração de sólidos do bagaço de cana pré-
tratado (g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico no
processo SSCF, atingindo a maior produção de etanol em 25,04 g/L, a partir de
2,21:10 g:mL e 20% v/v, respectivamente, no primeiro Planejamento (Tabela
5.25).
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 2
2
avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-
de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 1 para a produção de etanol
pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25
o
ciclo de
adaptação metabólica em meio sintético.
Ex.
Variáveis independentes
Condições
Resposta
H. H. (%)
S:L (g:mL)
Glicose inicial(g/L) Xilose inicial(g/L) Etanol (g/L)
1
45,00
2,21:10
67,3
24,5
7,5
2
20,00
2,0: 10
57,4
9,6
25,0
3
80,36
1,5: 10
38,9
61,1
0,0
4
70,00
2,0: 10
61,4
53,6
0,0
5
9,64
1,5: 10
36,5
5,3
7,4
6
45,00
1,5: 10
33,8
27,9
11,0
7
45,00
1,5: 10
39,2
30,1
2,2
8
45,00
1,5: 10
36,1
32,0
2,2
9
70,00
1,0: 10
25,0
51,7
1,5
10
45,00
1,5: 10
34,6
33,3
4,3
11
20,00
1,0: 10
23,3
10,1
7,6
12
45,00
0,79: 10
14,9
40,5
3,3
13
45,00
1,5: 10
37,5
35,0
4,0
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.
Cabe ressaltar que no experimento 6 houve a segunda maior produção
de etanol, em 10 g/L, sob a presença do hidrolisado hemicelulósico (variável A)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
162
em seu nível médio. Todavia, nota-se que os outros experimentos que
possuíam proporções deste licor acima de 45% v/v apresentaram baixa
produção de etanol, o que nos remete a uma inibição pela presença de HMF,
furfural e ácido acético.
Posteriormente, foi desenvolvido outro Planejamento Experimental
avaliando os mesmos parâmetros, porém em proporções inferiores para a
variável A (hidrolisado) e superiores para a variável B (relação sólido:líquido).
Observa-se, na tabela 5.26, que a maior concentração de etanol alcançada foi
de 27,32 g/L, nas seguintes condições: 2,99:10 de bagaço de cana pré-tratado
(g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico de 20% v/v.
Quando a concentração de sólidos mantinha-se baixa, associadamente ao
percentual de hidrolisado ácido, as concentrações de etanol eram reduzidas,
como exemplo do experimento 10, contudo, nas condições contrárias
(experimento 6) foram alcançados 24 g/L.
Tabela 5.26. Segundo Planejamento 2
2
avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-
de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 2 para a produção de etanol pela
linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25
o
ciclo de adaptação
metabólica em meio sintético.
Ex.
Variáveis independentes
Condições
Resposta
H. H. (%)
S:L (g:mL)
Glicose inicial (g/L) Xilose inicial (g/L)
Etanol (g/L)
1
20,50
2,0:10
59,3
12,5
18,2
2
6,50
1,3:10
34,0
5,1
1,6
3
20,50
2,99:10
48,9
11,0
27,3
4
34,50
1,3:10
36,1
18,7
5,1
5
20,50
2,0:10
57,8
14,2
15,2
6
0,70
2,0:10
62,6
0,6
24,0
7
40,30
2,0:10
65,2
23,4
5,70
8
20,50
2,0:10
63,7
8,0
15,6
9
6,50
2,7:10
51,3
3,9
23,3
10
20,50
1,0:10
23,5
7,7
4,5
11
34,50
2,7:10
73,0
21,3
5,2
12
20,50
2,0:10
62,1
8,2
17,0
13
20,50
2,0:10
60,4
12,6
8,8
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.
De acordo com a análise de variância do Planejamento SSCF 1 e do
Planejamento SSCF 2 (Tabelas 5.27 e 5.28) nota-se que o modelo linear (2FI:
two-factor interactions) e o modelo quadrático, respectivamente, apresentaram
um ajuste adequado aos resultados experimentais, com um coeficiente de
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
163
correlação R
2
de 0,7 e 0,8; sendo o erro puro e a falta de ajuste insignificantes
para o intervalo de confiança de 90%.
Tabela 5.27. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no
primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1 a partir do bagaço-
de-cana por Z. mobilis recombinante.
SQ
GL
MQ
F-Valor
p-valor
Modelo
366,91
3
122,30
6,76
0,0111
A
217,04
1
217,04
12,00
0,0071
B
60,22
1
60,22
3,33
0,1013
AB
89,66
1
89,66
4,96
0,0530
Resíduo
162,73
9
18,08
Lack of Fit
109,96
5
21,99
1,67
0,3204
Erro Puro
52,77
4
13,19
Cor. Total
529,64
12
Tabela 5.28. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no
segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2 a partir do bagaço-
de-cana por Z. mobilis recombinante.
SQ
GL
MQ
F-Valor
p-valor
Modelo
700,29
5
140,06
5,71
0,0205
A
201,31
1
201,31
8,20
0,0242
B
360,93
1
360,93
14,71
0,0064
AB
114,43
1
114,43
4,66
0,0677
A
2
18,21
1
18,21
0,74
0,4175
B
2
8,19
1
8,19
0,33
0,5817
Resíduo
171,80
7
24,54
Lack of Fit
120,36
3
40,12
3,12
0,1502
Erro Puro
51,43
4
12,86
Cor. Total
872,08
12
Onde: A= hidrolisado hemicelulósico, B= relação sólido:líquido; SQ=
Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática.
Os modelos do processo SSCF1 e SSCF2 são representados pelas
equações (8) e (9), respectivamente:
[Etanol]: +5,84 - 5,21A + 2,74B - 4,73AB
(8)
[Etanol]: +14,96 - 5,06A + 6,75B- 1,70A
2
–
1,17 B
2
–
5,42 AB (9)
Os modelos foram significativos, sendo que para o SSCF 1, o parâmetro
A (hidrolisado hemicelulósico) apresentou maior influência na concentração
final de etanol, seguido da interação AB e do parâmetro B (relação
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
164
sólido:líquido). Segundo o modelo referente ao SSCF 2, o parâmetro B (relação
sólido:líquido) foi o mais influente, seguido do parâmetro A (hidrolisado
hemicelulósico); somado a isso, as combinações que apresentaram maior
influência foram entre AB, seguido de A
2
e B
2
.
Adicionalmente, a figura 5.22 mostra a superfície de contorno, avaliando
o percentual de hidrolisado hemicelulósico (%), bem como a relação
sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do
processo SSCF 1, no que tange à produção de etanol pela linhagem
recombinante de Zymomonas mobilis CP4. Observa-se que o gráfico aponta
para a redução do parâmetro A (hidrolisado hemicelulósico) e ao aumento das
concentrações do parâmetro B (relação sólido:líquido), sendo necessária a
execução de outro planejamento para que os experimentos sejam otimizados.
Figura 5.22. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do primeiro Planejamento
Experimental referente ao processo SSCF 1 pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
165
Desta forma, após execução do segundo Planejamento, a figura 5.23
mostra a superfície de contorno avaliando o hidrolisado hemicelulósico (%) v/v,
bem como a relação sólido:líquido (g:mL); os mesmos parâmetros utilizados no
Planejamento anterior, embora em maiores concentrações de sólidos e
menores proporções de hidrolisado ácido. Segundo o gráfico de contorno, a
região ótima (em vermelho) foi alcançada através destes experimentos,
alcançando a maior produção de etanol em cerca de 25 g/L, valor próximo ao
máximo atingido experimentalmente, que ocorreu em 27 g/L.
Figura 5.23. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do segundo Planejamento
referente ao processo SSCF 2 pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
A reprodução da condição ótima do segundo Planejamento referente ao
processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas por
Zymomonas mobilis recombinante ocorreu em biorreator instrumento, na
temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais;
resultando na máxima concentração de etanol em 25,3 g/L e produtividade
volumétrica de 0,63 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
166
e 2,99:10 (g:mL) da relação sólido:líquido do bagaço de cana de açúcar pré-
tratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada,
seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%, havendo desvio da
via metabólica para a produção de xilitol. Viitanem et al. (2008) também
relataram sobre a problemática da formação deste subproduto, assim como à
lentidão do processo SSCF, constatando que 30 g/L desta pentose foi
consumida durante o período de 50 h. Conforme detalhado na Revisão
Bibliográfica, o xilitol é produzido através de aldose redutases inespecíficas,
presente no citoplasma de Zymomonas mobilis, entretanto pouco se sabe as
causas do desvio da via metabólica. Já segundo Zhang & Chen (2009), a
enzima periplasmática GFOR, responsável pela produção de sorbitol, catalisa
também tal reação juntamente com o cofator NADPH.
Figura 5.24. Processo SSCF 2 a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z.
mobilis geneticamente modificada em biorreator instrumentado, empregando
20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10 (g:mL) de relação
sólido:líquido. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSCF: co-fermentação e
sacarificação simultâneas.
P.H.
SSCF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
167
A tabela 5.29 representa a evolução dos ensaios de fermentação
empregando a linhagem recombinante através de planejamentos sequenciais.
Inicialmente, em meio sintético, a produção de etanol foi 7,5 g/L e produtividade
volumétrica correspondente de 0,180 g/L.h. Nos planejamentos sequenciais
avaliando o processo SSCF foram produzidos 25 g/L e 0,347 g/L.h (primeiro
planejamento), assim como 27 g/L e 0,683 g/L.h (segundo planejamento) de
produção de etanol e produtividade volumétrica, respectivamente.
Tabela 5.29. Evolução dos resultados obtidos pela linhagem recombinante de
Z.mobilis a partir da fermentação em meio sintético e do processo SSCF com
bagaço de cana pré-tratado.
Experimentos
Condições
Valores máximos
S
o
(g/L)
t
f
(h)
X
o
(%) v/v
P (g/L)
Q
P
(g/L.h)
Ensaios prévios
1. RMGX
20 g/L gli
20 g/L xil
70
10
7,5
0,107
Bagaço de cana-de-açúcar
2. SSCF 1
57 g/L gli
9 g/L xil
72
10
25
0,347
3. SSCF 2
22 g/L gli
6,4 g/L xil
40
10
27
0,683
Onde:
S
0
: concentração inicial de glicose; t
f
(h): tempo de fermentação; X
o
:
concentração inicial de células; P: concentração final de etanol; Qp: produtividade
volumétrica; RMG: Meio contendo glicose (20 g/L), xilose (20 g/L), extrato de levedura
(10 g/L), KH
2
PO
4
(2 g/L) e tetraciclina (10 mg/L); SSCF: hidrólise enzimática e co-
fermentação simultâneas; xil: xilose inicial; gli: glicose inicial. 1. Avaliação do consumo
de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada; 2 e 3.
Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos
experimentais sequenciais.
Apesar dos resultados não se mostrarem tão promissores quanto os
alcançados através da fermentação da glicose oriunda da fração celulósica
pelas linhagens naturalmente ocorrentes, atingindo 65 g/L de etanol, a bactéria
recombinante apresenta melhores resultados na medida em que os ciclos de
adaptação metabólica são efetuados. Cabe ressaltar que, conforme descrito na
Revisão Bibliográfica, outros pesquisadores também constataram dificuldades
na fermentação a partir de pentoses, gerando xilose residual e baixas
concentrações de etanol, conforme descrito por Davis et al. (2005), que
atingiram 11 g/L deste biocombustível, frente à 6 g/L de glicose e 16 g/L de
xilose, e posterior adição de 10 g/L de glicose, gerando 12 g/L de xilose
residual, durante 11 horas de processo.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
168
Segundo Kim et al. (2000), as células de Zymomonas mobilis
recombinantes que metabolizam a xilose demonstram lento e incompleto
consumo da mesma. As possíveis causas relacionadas para tal deficiência
remetem ao microrganismo não possui transportador específico para a xilose, o
que prejudica a sua metabolização devido à repressão catabólica pelo
monossacarídeo preferencial, a glicose. Adicionalmente, estudos de
modelagem indicam que a captação de glicose e xilose ocorre em 65% e 35%,
respectivamente, quando estes carboidratos estão presentes na proporção de
1:1 (LEKSAWASDI et al., 2001). Jeon et al. (2005); Zhang & Chen (2009) e
Agrawal et al (2011) também afirmam que a maior problemática da
fermentação de pentoses está relacionada à produção e acumulação de xilitol,
mesmo em concentrações reduzidas, promovendo o desvio da via das
pentoses em linhagens recombinantes de Z. mobilis. Segundo Kim et al.
(2000), apenas 1 g/L de xilitol presente no meio pode provocar redução de 50%
do crescimento de biomassa.
Agrawall et al. (2011) reportaram sobre a importância da adaptação
metabólica frente à produção de etanol por Z. mobilis ZM4 (pZB5), visando à
obtenção de resultados mais promissores. Adicionalmente, tal linhagem tem
sido apontada como uma das mais indicadas para a metabolização da xilose,
além de possuir maior resistência ao etanol, ao ácido acético e furfural. Zhang
(2003) indicaram que a linhagem CP4, a qual produziu 24 g/L de etanol a partir
de 15 g/L de glicose e 35 g/L de xilose, não seria tão eficiente quanto à
linhagem 8b (ZHANG et al., 2010), a qual atingiu 40 g/L de etanol a partir de
resíduo de papel, um dos motivos pelos quais os resultados da presente tese
podem não estar atingindo elevados níveis de etanol.
Neste contexto, as dificuldades de metabolização de xilose pela
linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, desenvolvida neste trabalho, podem
também estar relacionadas à inibição do crescimento microbiano pela produção
de xilitol, uma vez que tal composto foi detectado nos ensaios de fermentação
do presente trabalho. Portanto, conforme indicado por diversos autores e
comprovado neste trabalho, os processos de adaptação metabólica, assim
como otimizações empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis devem
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
169
ser contínuos no que tange à maximização da produção de etanol e de
biomassa microbiana, assim como à redução da produção de xilitol.
5.3. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Através de estudos realizados neste trabalho, assim como o
levantamento bibliográfico de diversas pesquisas científicas sobre a biologia
molecular e bioquímica do microrganismo Zymomonas mobilis, conclui-se que
a engenharia genética e a metabólica ainda apresentam-se como as melhores
e possivelmente as únicas alternativas para tornar esta bactéria capaz de
fermentar a níveis industriais. No entanto, a tecnologia de fermentação a partir
de materiais lignocelulósicos ainda não superou alguns fatores inibitórios
responsáveis pela redução do rendimento do processo; dentre eles,
temperaturas elevadas, estresse osmótico, elevados níveis de etanol, bem
como a limitada gama de substratos fermentáveis, juntamente com a
problemática de metabolização de pentoses.
Contudo, uma vez que a bactéria Zymomonas mobilis desponta como
um dos microrganismos mais promissores para a produção de etanol, diversos
pesquisadores tentam contornar algumas dificuldades relacionadas à
fermentação na presença de compostos inibitórios, dentre outros estresses
fisiológicos. Neste contexto, o grupo de pesquisa NREL (EUA), o qual estuda
há cerca de duas décadas a fermentação por Z. mobilis é um dos pioneiros no
desenvolvimento e aprimoramento de diversas tecnologias utilizando tal
microrganismo. Buscando superar as dificuldades metabólicas citadas
anteriormente, no intuito de que a fermentação por Z. mobilis atinja níveis cada
vez mais elevados, pesquisadores avaliam o emprego de diferentes linhagens,
o isolamento de diferentes colônias, assim como o aprimoramento das
tecnologias de adaptação metabólica e engenharia genética. Pesquisas
preliminares realizadas por Yang et al. (2010) avaliaram a adição do gene Hfq,
o qual coordena diversas respostas ao estresse fisiológico de alguns
microrganismos. Zhou et al. (2011) avaliaram a integração XI, XK, TAL, TKL no
genoma de Z. mobilis ZM-mtc9xt, obtendo resultados promissores, assim como
outros grupos de pesquisa apontaram para a otimização do processo sem que
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
170
houvesse outra intervenção genética, através da utilização do processo SSCF
empregando-se baixos níveis de carga enzimática, conforme relatado por
Olofsson et al. (2010). No Brasil, estudos empregando técnicas de biologia
molecular neste microrganismo são muito recentes. O centro de pesquisa
LADEBIO é pioneiro nesta temática, empregando tal bactéria, transformando-a
e desenvolvendo otimizações do processo de hidrólise enzimática e co-
fermentação simultâneas (SSCF) a partir de um resíduo agro-industrial, o
bagaço de cana-de-açúcar. Desta forma, almeja-se que em um futuro próximo
se possam empregar recursos renováveis no que tange à bioconversão de
açúcares a etanol por tal microrganismo.
Sumariamente, o objetivo e o desenho experimental adotado para a
execução do presente trabalho, pautaram-se, fundamentalmente, no
desenvolvimento de tecnologias para a otimização da produção de etanol a
partir de resíduos lignocelulósicos, mediante o uso de linhagens nativas (AG11
e CP4), através do processo SSF e da linhagem recombinante CP4, a qual é
capaz de fermentar a xilose e a glicose simultaneamente, através do processo
SSCF. Baseado no teste de fermentabilidade empregando as linhagens nativas
de Z. mobilis, realizado com o bagaço de cana-de-açúcar e com resíduos da
indústria de celulose, conclui-se que estas matérias-primas apresentaram
significativos potenciais para a produção de etanol 2G, sendo facilmente
fermentados. Constatou-se, portanto, que a celulose constitui uma excelente
fonte de carboidratos para a execução do processo de hidrólise enzimática e
fermentação simultâneas por Zymomonas mobilis, que se apresentou
promissora para a produção deste biocombustível, em virtude de sua elevada
capacidade de absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de
etanol, resultando em altos valores de produtividade. Os resultados alcançados
com o presente trabalho foram satisfatórios, no entanto, são necessárias
continuações no que tange à elaboração de novas estratégias para que as
questões inibitórias e insatisfatórias colocadas ao longo do texto sejam
contornadas, assim como o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular
para a comprovação da transformação genética, gerando oportunidades para
futuros
e
interessantes
desenvolvimentos
tecnológicos.
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
171
_____________________CAPÍTULO 6
CONCLUSÕES
6.1. CONCLUSÕES
Após análise da capacidade de utilização de glicose em meio sintético
pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi
consumido eficientemente em um período de 15 e 18 horas,
respectivamente. No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a
incapacidade de ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose.
Através de técnicas de planejamento experimental foi possível constatar
que o uso do tampão-citrato (1M, pH 5, 50% v/v) adicionado à celulignina
de bagaço de cana pré-tratada alcalinamente, influenciou negativamente a
produção de etanol pelas linhagens de Zymomonas mobilis. Neste
planejamento, as linhagens de Z.mobilis AG11 e CP4 atingiram
concentrações de etanol de 25 e 34 g/L, correspondendo a valores de
produtividade volumétrica de 1,04 e 1,25 g/L.h, respectivamente. Tendo em
vista que os melhores resultados foram alcançados com a linhagem CP4,
os estudos posteriores foram realizados com esta linhagem.
Foi construído um novo planejamento experimental, otimizando-se a
concentração de glicose inicial do SSF, a produção etanol e a
produtividade volumétrica do processo SSF com bagaço de cana pré-
tratado.
As
melhores
condições
experimentais,
apontadas
pelo
planejamento experimental foram: relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL),
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
172
carga enzimática de 25 FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L.
As concentrações máximas atingidas foram de 76 g/L de glicose inicial, 60
g/L de etanol, e produtividade volumétrica de 1,52 g/L.h, na temperatura de
30ºC e velocidade de agitação de 150 rpm, em frascos agitados. A
validação em biorreator instrumentado resultou em uma concentração de
etanol de 55 g/L, iniciando-se o processo SSF com a concentração de
glicose de 80 g/L (após etapa de pré-hidrólise enzimática). O valor de
produtividade volumétrica atingido nesta escala foi de 2,29 g/L.h, em
temperatura de 30ºC, velocidade de agitação de 150 rpm e pH 5.
Através da execução de um Planejamento Fatorial 2
4
foi possível constatar
que os nutrientes analisados: KH
2
PO
4
(g/L), MgSO
4
.7H
2
O(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
e extrato de levedura (g/L), adicionados no processo SSF, promoveram
maiores concentrações de etanol quando estavam em seus maiores níveis:
1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. Posteriormente, foi
desenvolvido um Planejamento Experimental de Superfície de Resposta,
aumentando-se a faixa de estudo dos nutrientes, além da adição dos níveis
axiais. As condições ótimas foram: extrato de levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4
(2,5 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(1,5 g/L) e MgSO
4
(1,5 g/L), resultando na
concentração máxima de etanol de 65 g/L, com 85 g/L de concentração
inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de 2,70 g/L.h,
na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm, pH 5 em biorreator.
O resíduo da indústria de celulose, PM2, foi avaliado quanto à produção de
etanol a partir do processo SSF, sendo as condições ótimas as seguintes:
relação sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e
concentração celular (1,59% v/v), resultando na máxima concentração de
etanol em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial e produtividade
volumétrica de 2,76 g/L.h. As condições ótimas obtidas através da análise
da adição de nutrientes no meio SSF para a produção de etanol a partir
dos resíduos da indústria de celulose, foram: extrato de levedura (6,25 g/L),
KH
2
PO
4
(1,25 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(2,25 g/L) e MgSO
4
(2,25 g/L), resultando na
máxima concentração de etanol de 54 g/L, a partir de 91 g/L de glicose
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
173
inicial e produtividade volumétrica de 3,6 g/L.h, em biorreator
instrumentado, na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5.
No que tange à transformação genética no microrganismo em estudo,
observou-se que após tal procedimento, o mesmo apresentou crescimento
em meio RMG (20 g/L de glicose, 2 g/L de KH
2
PO
4
e 10 g/L de extrato de
levedura) adicionado de tetraciclina (10 mg/L). A adaptação metabólica em
meio sintético foi desenvolvida com o intuito de promover resultados mais
promissores de crescimento e produção de etanol. Este procedimento
constituiu de 50 ciclos nos quais aumentava progressivamente a
concentração de xilose e reduzia-se proporcionalmente a de glicose. Após
o 20
o
ciclo de repiques, o tempo de crescimento bacteriano reduziu para
cerca de 70 horas, aumentando lentamente o consumo de xilose e
acelerando o crescimento celular. Após a realização de 50 ciclos de
adaptação metabólica, a bactéria apresentou maiores valores de
crescimento de biomassa, produção de etanol e produtividade volumétrica,
indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50) apresentaram melhor
desempenho do que aquelas cultivadas nos primeiros ciclos, com valores
destes parâmetros aumentando no mínimo em 2 vezes. Através de
experimentos avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose foram
alcançados 7,5 g/L de etanol após 72 horas, a partir de 20 g/L de glicose,
20 g/L de xilose, em meio RMGX na temperatura de 30
o
C, sem agitação.
O processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas foi
avaliado
segundo
Planejamentos
Experimentais
seqüenciais
2
2
,
empregando a bactéria Zymomonas mobilis recombinante, na temperatura
de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais, resultando na
máxima concentração de etanol de 25,3 g/L e produtividade volumétrica de
0,65 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico, 2,99:10
(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana de açúcar pré-tratado,
em biorreator instrumento. Constatou-se que a glicose foi inicialmente
metabolizada, seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%,
havendo desvio da rota para a produção de xilitol.
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
174
6.2. SUGESTÕES
I. Processo SSF empregando a linhagem nativa de Z. mobilis
As concentrações ótimas de hidrolisado celulósico do bagaço de cana,
bem como do resíduo da indústria de celulose podem ser selecionadas para
alimentar um processo de fermentação contínuo ou em batelada alimentada.
Esta forma de condução permitiria estender a fase exponencial de crescimento
e controlar os níveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores sobre
o metabolismo da bactéria.
II. Processo SSCF empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis
Conforme descrito anteriormente, o mecanismo gênico de tal bactéria
não regula corretamente a expressão dos genes inseridos. Visando contornar
esta problemática, as sugestões abaixo visam à superação dos resultados
obtidos pela linhagem recombinante de Z. mobilis desenvolvida no
LADEBIO/UFRJ,
em
colaboração
com
o
Laboratório
de
Biologia
Molecular/UnB.
Quantificar níveis enzimáticos através de análise química das atividades de
xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase;
Caracterização das proteínas heterólogas inseridas na linhagem parental,
através de Cromotografia Eletroforética;
Sequenciar o DNA da linhagem recombinante, bem como da linhagem
nativa, com a finalidade de comprovar a inserção dos genes no
microrganismo e de detectar possíveis mutações;
Desenvolver uma linhagem recombinante que possua, além dos genes de
metabolização da xilose, os genes que codificam o transporte específico da
pentose;
Investigar a integração cromossomal de genes responsáveis pela
metabolização de xilose e arabinose.
CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas
175
Danielle da Silveira dos Santos
_____________________CAPÍTULO 7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Xylose-Fermenting Zymomonas mobilis Strain. Biotechnology and
Bioengineering, v. 108, n. 4, 2011.
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from Pichia stipitis enables high levels of xylitol production by engineered
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48
–
55, 2009.
CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas
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Danielle da Silveira dos Santos
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92, p. 560
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Disponível em: Dostları ilə paylaş: |