Oqsil muhandisligi

.1 Oqsil muhandisligi tushunchasi. Rivojlanish tarixi

Protein muhandisligi biotexnologiyaning foydali yoki qimmatli oqsillarni ishlab chiqish bilan shug'ullanadigan bo'limidir. Bu nisbatan yangi intizom bo'lib, oqsillarni katlama va oqsillarni o'zgartirish va loyihalash tamoyillarini o'rganishga qaratilgan.

Protein muhandisligi uchun ikkita asosiy strategiya mavjud: yo'naltirilgan protein modifikatsiyasi va yo'naltirilgan evolyutsiya. Bu usullar bir-birini istisno qilmaydi; tadqiqotchilar ko'pincha ikkalasini ham qo'llashadi. Kelajakda oqsillarning tuzilishi va funktsiyalari haqida batafsil ma'lumot, shuningdek, yuqori texnologiyadagi yutuqlar oqsil muhandisligi imkoniyatlarini sezilarli darajada kengaytirishi mumkin. Natijada, yangi aminokislotalarni genetik kodga kiritish imkonini beruvchi yangi usul tufayli tabiiy bo'lmagan aminokislotalarni ham kiritish mumkin [2].

Protein muhandisligi oqsil fizikasi va kimyo va genetik muhandislik kesishmasida paydo bo'lgan. U kerakli xususiyatlarga ega modifikatsiyalangan yoki gibrid oqsil molekulalarini yaratish muammosini hal qiladi. Bu vazifani amalga oshirishning tabiiy usuli modifikatsiyalangan oqsilni kodlovchi genning tuzilishini bashorat qilish, uni sintez qilish, klonlash va retsipient hujayralarida ifodalashdir [7].

Proteinning birinchi nazorat ostida modifikatsiyasi 1960-yillarning o'rtalarida Koshland va Bender tomonidan amalga oshirildi. Proteaza - subtilisinning faol markazida gidroksil guruhini sulfgidril guruhi bilan almashtirish uchun ular kimyoviy modifikatsiya usulidan foydalanganlar. Biroq, ma'lum bo'lishicha, bunday tiolsubtilisin proteaz faolligini saqlamaydi.

Kimyoviy ma'noda oqsil bir xil turdagi molekula bo'lib , u poliaminokislotalar zanjiri yoki polimerdir. U 20 turdagi aminokislotalar ketma-ketligidan iborat. Proteinlarning tuzilishini o'rgangandan so'ng, odamlar o'zlariga savol berishdi: aminokislotalarning mutlaqo yangi ketma-ketligini loyihalash mumkinmi, shunda ular odamga kerak bo'lgan funktsiyalarni oddiy oqsillarga qaraganda ancha yaxshi bajaradi? Protein muhandisligi nomi bu g'oya uchun paydo bo'ldi [17].

Ular XX asrning 50-yillarida bunday muhandislik haqida o'ylashni boshladilar. Bu birinchi protein aminokislotalar ketma-ketligini dekodlashdan so'ng darhol sodir bo'ldi. Dunyoning ko'plab laboratoriyalarida tabiatni takrorlash va mutlaqo o'zboshimchalik bilan berilgan poliaminokislotalar ketma-ketligini kimyoviy sintez qilishga urinishlar qilingan.

Eng muhimi, kimyogar B. Merrifild bunga erishdi. Bu amerikalik poliaminokislotalar zanjirlarini sintez qilish uchun juda samarali usulni ishlab chiqishga muvaffaq bo'ldi. Buning uchun Merrifild 1984 yilda kimyo bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan.

Shakl 1. Protein muhandisligining ishlash sxemasi

Amerikalik qisqa peptidlarni, shu jumladan gormonlarni sintez qila boshladi. Shu bilan birga, u avtomat - "kimyoviy robot" ni yaratdi - uning vazifasi sun'iy oqsillarni ishlab chiqarish edi. Robot ilmiy doiralarda shov-shuvga sabab bo'ldi. Biroq, tez orada uning mahsulotlari tabiat ishlab chiqaradigan narsalar bilan raqobatlasha olmasligi ma'lum bo'ldi.

Robot aminokislotalar ketma-ketligini aniq takrorlay olmadi, ya'ni bu noto'g'ri edi. U bitta zanjirni bitta ketma-ketlik bilan, ikkinchisini esa biroz o'zgartirilgan bilan sintez qildi. Hujayrada bitta oqsilning barcha molekulalari bir-biriga ideal tarzda o'xshash, ya'ni ularning ketma-ketligi mutlaqo bir xil.

Yana bir muammo bor edi. Hatto robot to'g'ri sintez qilgan molekulalar ham fermentning ishlashi uchun zarur bo'lgan fazoviy shaklni olmagan. Shunday qilib, tabiatni organik kimyoning odatiy usullari bilan almashtirishga urinish juda kamtarona muvaffaqiyatga olib keldi.

Olimlar oqsillarning kerakli modifikatsiyalarini izlab, tabiatdan o'rganishlari kerak edi. Bu erda gap shundaki, mutatsiyalar tabiatda doimo sodir bo'lib, oqsillarning aminokislotalar ketma-ketligining o'zgarishiga olib keladi. Agar u yoki bu substratni samaraliroq qayta ishlovchi zarur xossalarga ega mutantlarni tanlab olsak, u holda bunday mutantdan o'zgargan fermentni ajratib olish mumkin bo'ladi, buning natijasida hujayra yangi xossalarga ega bo'ladi. Ammo bu jarayon juda uzoq davom etadi.

Genetik muhandislik paydo bo'lganda hamma narsa o'zgardi. Unga rahmat, ular nukleotidlarning har qanday ketma-ketligi bilan sun'iy genlarni yaratishni boshladilar. Bu genlar tayyorlangan vektor molekulalariga kiritildi va bu DNKlar bakteriyalar yoki xamirturushlarga kiritildi. U erda sun'iy gendan RNK nusxasi olib tashlandi. Natijada kerakli protein ishlab chiqarildi. Uning sintezidagi xatolar chiqarib tashlandi. Asosiysi, to'g'ri DNK ketma -ketligini tanlash, keyin hujayraning fermentativ tizimi o'z vazifasini mukammal bajardi. Shunday qilib, gen muhandisligi eng radikal shaklda protein muhandisligiga yo'l ochdi, degan xulosaga kelishimiz mumkin [3].

1.2 Protein muhandislik strategiyalari

Maqsadli protein modifikatsiyasi. Proteinni maqsadli modifikatsiya qilishda olim kerakli o'zgarishlarni amalga oshirish uchun oqsilning tuzilishi va funksiyasi haqidagi batafsil bilimlardan foydalanadi. Umuman olganda, bu usulning afzalligi arzon va texnik jihatdan murakkab emas, chunki saytga yo'naltirilgan mutagenez usullari yaxshi rivojlangan. Biroq, uning asosiy kamchiligi shundaki, oqsilning batafsil tuzilishi haqidagi ma'lumotlar ko'pincha yo'qoladi va hatto tuzilishi ma'lum bo'lsa ham, turli mutatsiyalarning ta'sirini oldindan aytish juda qiyin bo'lishi mumkin.

Proteinni o'zgartirish dasturi algoritmlari oldindan belgilangan maqsadli tuzilmani shakllantirish uchun kam energiya talab qiladigan yangi aminokislotalar ketma-ketligini aniqlashga intiladi. Topilishi kerak bo'lgan ketma-ketlik katta bo'lsa-da, oqsilni o'zgartirish uchun eng qiyin talab shu kabi suboptimal ketma-ketliklardan farqli o'laroq, optimal ketma-ketlikni aniqlash va aniqlashning tez, ammo aniq usulidir [1, 25].

Yo'naltirilgan evolyutsiya. Yo'naltirilgan evolyutsiyada oqsilga tasodifiy mutagenez qo'llaniladi va ma'lum sifatlarga ega bo'lgan variantlarni tanlash uchun tanlanadi. Mutatsiya va tanlashning keyingi bosqichlari qo'llaniladi. Bu usul tabiiy evolyutsiyani taqlid qiladi va odatda yo'naltirilgan o'zgartirish uchun ajoyib natijalar beradi.

DNKni aralashtirish deb nomlanuvchi qo'shimcha usul yaxshi natijalarga erishish uchun muvaffaqiyatli variantlarning qismlarini aralashtirib, chiqaradi. Bu jarayon jinsiy ko'payish jarayonida tabiiy ravishda yuzaga keladigan rekombinatsiyalarni taqlid qiladi. Yo'naltirilgan evolyutsiyaning afzalligi shundaki, u protein tuzilishi haqida oldindan ma'lumotga ega bo'lishni talab qilmaydi va berilgan mutatsiya qanday ta'sir ko'rsatishini taxmin qilish uchun kerak emas. Darhaqiqat, yo'naltirilgan evolyutsiya tajribalarining natijalari hayratlanarli, chunki kerakli o'zgarishlar ko'pincha bunday ta'sirga ega bo'lmasligi kerak bo'lgan mutatsiyalar tufayli yuzaga keladi. Kamchilik shundaki, bu usul yuqori o'tkazuvchanlikni talab qiladi, bu barcha oqsillar uchun mumkin emas. Ko'p miqdorda rekombinant DNK mutatsiyaga uchragan bo'lishi kerak va mahsulotlar kerakli sifat uchun tekshirilishi kerak. Variantlar soni ko'pincha jarayonni avtomatlashtirish uchun robototexnika sotib olishni talab qiladi. Qolaversa, qiziqishning barcha sifatlarini saralash har doim ham oson emas [1, 25].

II. Ishlab chiqarilgan oqsillarga misollar
Protein muhandisligi tayyor oqsilning kimyoviy modifikatsiyasiga yoki tabiiy oqsillarning o'zgartirilgan variantlarini olish imkonini beradigan genetik muhandislik usullariga asoslangan bo'lishi mumkin [22].

Muayyan biologik katalizatorni loyihalash oqsilning o'ziga xosligini ham, organometall kompleksning katalitik faolligini hisobga olgan holda amalga oshiriladi. Bu erda "yarim sintetik bioorganik komplekslarni" olish uchun amalga oshirilgan bunday modifikatsiyaga misollar keltirilgan. Sperma kitining miyoglobini kislorodni bog'lashga qodir, ammo biokatalitik faollikka ega emas. Ushbu biomolekulani oqsil molekulalari yuzasida gistidin qoldiqlari bilan bog'laydigan ruteniyni o'z ichiga olgan uchta elektron o'tkazuvchi komplekslar bilan birlashtirib, bir vaqtning o'zida bir qator organik substratlarni, masalan, askorbatni oksidlovchi kislorodni kamaytirishga qodir bo'lgan kompleks hosil bo'ladi. darajasi tabiiy askorbat oksidaz bilan deyarli bir xil. Asos sifatida, oqsillarni boshqa yo'llar bilan o'zgartirish mumkin. Masalan, papani ko'rib chiqing. Bu yaxshi o'rganilgan proteolitik fermentlardan biri bo'lib, ular uchun uch o'lchovli struktura aniqlangan. Sistein-25 qoldig'i yaqinida oqsil molekulasi yuzasida proteoliz reaktsiyasi davom etadigan kengaytirilgan truba joylashgan. Ushbu saytni potentsial substrat bog'lash joyiga kirish imkoniyatini o'zgartirmasdan flavin hosilasi bilan alkillash mumkin. Bunday o'zgartirilgan flavopapainlar M-alkil-1,4-dihidronikotinamidlarni oksidlash uchun ishlatilgan va bu o'zgartirilgan ba'zi oqsillarning katalitik faolligi tabiiy flavoprotein NADH dehidrogenazalariga qaraganda ancha yuqori edi. Shunday qilib, juda samarali yarim sintetik ferment yaratish mumkin edi. Muayyan holatda joylashgan yuqori faol elektron tortib oluvchi o'rinbosarlarga ega flavinlardan foydalanish nikotin amidini kamaytirish uchun samarali katalizatorlarni ishlab chiqishga imkon beradi.

DNKning kimyoviy sintezidagi so'nggi yutuqlar oqsil muhandisligi uchun tubdan yangi imkoniyatlarni ochib berdi: tabiatda uchramaydigan noyob oqsillarni yaratish. Bu texnologiyani yanada rivojlantirishni talab qiladi, shuning uchun genlarni genetik muhandislik usullari bilan o'zgartirish oqsillarda prognoz qilinadigan o'zgarishlarga, ularning aniq belgilangan funktsional xususiyatlarini yaxshilashga olib keladi: aylanishlar soni, ma'lum bir substrat uchun KM, issiqlik barqarorligi, optimal harorat, suvsiz erituvchilarda barqarorlik va faollik, substrat va reaksiyaning o'ziga xosligi, kofaktorga bo'lgan talab, pH optimalligi, proteaza qarshiligi, allosterik tartibga solish, molekulyar og'irlik va subbirlik tuzilishi. Odatda, bu yaxshilanish mutagenez va selektsiya, yaqinda esa kimyoviy modifikatsiya va immobilizatsiya orqali erishiladi. Muayyan turdagi protein molekulasini muvaffaqiyatli loyihalash uchun oqsillarning strukturaviy xususiyatlarini va ularning kerakli xususiyatlarini bog'laydigan bir qator fundamental naqshlarni aniqlash kerak. Shunday qilib, o'rganilayotgan oqsil molekulasining aniq kristalli tuzilishini bilib, uning katalitik faolligini oshirish uchun maqsadli ravishda o'zgartirilishi kerak bo'lgan qismlarini aniqlash mumkin. Bunday modifikatsiya oqsilning aminokislotalar ketma-ketligini o'zgartirishdan iborat bo'lishi mumkin [20].

Yana bir misol - saytga xos mutagenezni amalga oshirish. Bu quyidagi tarzda sodir bo'ladi. Tadqiqotchini qiziqtirgan oqsilning geni klonlanadi va tegishli genetik tashuvchiga kiritiladi. Keyin kerakli mutatsiya bilan oligonukleotid primeri sintezlanadi, uning o'ndan o'n beshgacha nukleotidlar ketma-ketligi tabiiy genning ma'lum bir hududiga etarlicha homolog bo'ladi va shuning uchun u bilan gibrid tuzilmani shakllantirishga qodir. Ushbu sintetik primer vektorning qo'shimcha nusxasini sintezini boshlash uchun polimerazlar tomonidan qo'llaniladi, so'ngra asl nusxadan ajratiladi va mutant oqsilning boshqariladigan sintezi uchun ishlatiladi. Muqobil yondashuv zanjirning uzilishi, o'zgartiriladigan joyni olib tashlash va uni kerakli nukleotidlar ketma-ketligi bilan sintetik analog bilan almashtirishga asoslangan.

Tirozil-tRNK sintetaza tirozin tRNKning aminoatsillanishini katalizlaydi, bu tirozinning ATP tomonidan faollashishini o'z ichiga oladi va tirozil adenilat hosil qiladi. Bacillus stearothermophilusdan ajratilgan ushbu fermentning geni M13 bakteriofagiga kiritilgan. Keyin fermentning katalitik xususiyatlari, ayniqsa uning substratni bog'lash qobiliyati saytga xos modifikatsiya orqali o'zgartirildi. Shunday qilib, treonin-51 alanin bilan almashtirildi. Bu, ko'rinishidan, bu qoldiq va tirozil adenilat o'rtasida vodorod aloqasini hosil qilishning mumkin emasligi sababli, substrat bog'lanishining ikki baravar oshishiga olib keldi. Alanin prolin bilan almashtirilganda, ferment molekulasining konfiguratsiyasi buziladi, ammo substratni bog'lash qobiliyati yuz baravar ortadi, chunki uning histidin-48 bilan o'zaro ta'siri osonlashadi. Shunga o'xshash hududga xos o'zgarishlar b-laktamazada kuzatilgan va odatda fermentning inaktivatsiyasi bilan birga keladi. Serin-70 ni sistein bilan almashtirish p-tiollaktamaza hosil bo'lishiga olib keladi, uning bog'lanish konstantasi tabiiy fermentnikidan farq qilmaydi, lekin penitsillinga nisbatan faolligi atigi 1-2% ni tashkil qiladi. Shunga qaramay, bu mutant fermentning ba'zi faollashtirilgan sefalosporinlarga nisbatan faolligi boshlang'ich faollikdan kam emas yoki hatto undan oshib ketadi; bu oqsillar proteazlar ta'siriga ham chidamliroq.

Strukturaviy tadqiqotlar natijalarining adekvatligini tekshirish uchun bugungi kunda saytga xos harakatlar natijasida yuzaga kelgan mutatsiyalar qo'llaniladi . Ba'zi hollarda ular oqsilning strukturaviy barqarorligi va uning katalitik faolligini ajratish mumkinligini ko'rsatish uchun ishlatilgan. Protein strukturasining barqarorligi va funktsiyasi o'rtasidagi bog'liqlik haqida etarli ma'lumotga ega bo'lsak, biz biologik katalizatorlarning faolligini aniq sozlashimiz va to'liq sintetik analoglarni yaratishimiz mumkin. Yaqinda chop etilgan maqolada ribonukleaza molekulasining faol qismini kodlovchi birinchi sintetik ferment genining klonlanishi haqida xabar berilgan [4].

III. Protein muhandisligini qo'llash
Mavjud oqsillarni (fermentlar, antitelalar, hujayra retseptorlari) xususiyatlarini yaxshilash va tabiatda mavjud bo'lmagan yangi oqsillarni yaratish uchun oqsil muhandisligi texnologiyasidan (ko'pincha rekombinant DNK usuli bilan birgalikda) foydalaniladi. Bunday oqsillar dori vositalarini yaratishda, oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda va sanoat ishlab chiqarishida ishlatiladi [8].

Hozirgi vaqtda oqsil muhandisligining eng mashhur qo'llanilishi "ekologik toza" sanoat jarayonlarini ishlab chiqish uchun fermentlarning katalitik xususiyatlarini o'zgartirishdir. Atrof-muhit nuqtai nazaridan fermentlar sanoatda qo'llaniladigan barcha katalizatorlar ichida eng maqbul hisoblanadi. Bu biokatalizatorlarning suvda erishi va neytral pH bo'lgan muhitda va nisbatan past haroratlarda to'liq ishlash qobiliyati bilan ta'minlanadi. Bundan tashqari, ularning yuqori o'ziga xosligi tufayli, biokatalizatorlardan foydalanish ishlab chiqarishning juda kam kiruvchi qo'shimcha mahsulotiga olib keladi. Kimyo, to‘qimachilik, farmatsevtika, sellyuloza-qog‘oz, oziq-ovqat, energetika va zamonaviy sanoatning boshqa sohalarida biokatalizatorlardan foydalangan holda ekologik toza va energiya tejaydigan sanoat jarayonlari uzoq vaqtdan beri faol joriy etilgan.

Biroq, biokatalizatorlarning ba'zi xususiyatlari ba'zi hollarda ulardan foydalanishni qabul qilib bo'lmaydi. Masalan, ko'pchilik fermentlar harorat ko'tarilganda parchalanadi. Olimlar bunday to'siqlarni engib o'tishga va og'ir ishlab chiqarish sharoitida fermentlarning barqarorligini oqsil muhandislik usullaridan foydalangan holda oshirishga harakat qilmoqdalar [18].

Sanoat dasturlariga qo'shimcha ravishda, oqsil muhandisligi tibbiyot ishlanmalarida o'zining munosib o'rnini topdi. Tadqiqotchilar viruslar va mutant o‘simtalarni keltirib chiqaruvchi genlar bilan bog‘lanib, ularni zararsiz holga keltiradigan oqsillarni sintez qilishmoqda; yuqori samarali vaktsinalar yaratish va ko'pincha farmatsevtika preparatlari uchun maqsad bo'lgan hujayra yuzasi retseptorlari oqsillarini o'rganish. Oziq-ovqat mahsulotlarini yaxshilash bo'yicha olimlar o'simlik oziq-ovqatlarini, shuningdek, jelleştirici moddalarni yoki quyuqlashtiruvchi moddalarni saqlaydigan oqsillarning sifatini yaxshilash uchun protein muhandisligidan foydalanadilar.

Protein muhandisligini qo'llashning yana bir sohasi kimyoviy va biologik hujumlar uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan moddalar va mikroorganizmlarni zararsizlantirishi mumkin bo'lgan oqsillarni yaratishdir. Masalan, gidrolaza fermentlari asab gazlarini ham, qishloq xo'jaligida ishlatiladigan pestitsidlarni ham zararsizlantirishga qodir. Shu bilan birga, fermentlarni ishlab chiqarish, saqlash va ishlatish atrof-muhit va inson salomatligi uchun xavfli emas [4].