Ouchterlony double diffusion

Particulars 

Marks 

Maximum 

Actual 

Conduction of Experiment 

 

10 

 

Write up 

 

05 

 

Observation and Result 

 

05 

 

Viva 

 

05 

 

Total 

 

25 

 

 

Signature of Staff Incharge 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Experiment 4 

DOT ELISA 

 

Introduction: 

Enzyme linked immunosorbent assay or ELISA is a sensitive immunological technique to detect the 

presence of a specific antigen (Ag) or antibody (Ab) in a biological sample. It utilizes the dual 

properties of antibody molecules being specific in reactivity and their ability to be conjugated to 

active molecules such as enzymes. An enzyme conjugated with an antibody reacts with a 

chormogenic colourless substrate to generate a coloured reaction product. ELISA is extensively used 

for diagnostic purpose which utilizes the dual properties. It requires an immobilized 

antigen/antibody bound to a solid support (e.g. microtitre plate or membrane). There are different 

types of ELISAs for the detection of a protein of interest in a given sample. One of the most common 

ELISA is dot ELISA which can visually detect the presence of an antigen very quickly. The 

nitrocellulose dot technique was first developed for screening large number of hybridoma antibodies 

in 1983. 

 

Aim: 

 

 

Principle: 

 

 

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

 

Materials Required: 

 

 

Procedure: 

1. 

2. 

3.

 

4. 

5.

 

6.

 

7.

 

Before starting the experiment the entire procedure has to be read carefully. 

Always wear gloves while performing the experiment. 

Dilute required amount of 1 OX Assay Buffer to IX with distilled water, before 

use. 

Do not cross-contaminate reagents. 

Never leave the reagents at room temperature. 

Ensure that all the three zones of the strip are immersed jn 

solution. Assay buffer: Phosphate buffered saline — Tween 

(PBST). 

 

1. Take 2 ml of IX Assay Buffer in a test tube and add 2 pl of the test serum sample. Mix 

thoroughly by pipetting. Insert a Dot-ELISA strip into the tube. 

2. Incubate the tube at room temperature for 20 minutes. Discard the solution. 

3. Wash the strip two times by dipping it in 2 ml of IX Assay Buffer for about 5 minutes 

each. Replace the buffer each time. 

4. Take 2 ml of IX Assay Buffer in a fresh test tube, add 2 pl of HRP conjugated antibody 

to it. Mix thoroughly by pipetting. Dip the ELISA strip into it and allow the reaction to 

take place for 20 minutes. 

5. Wash the strip as in step # 3 for two times. 

6. In a collection tube (provided in the kit) take 1.3 ml of TMB/H202 and dip the ELISA 

strip into this substrate solution. 

7. Observe the strip after 5 - 10 minutes for the appearance of a blue spot. 

8. Rinse the strip with distilled water. 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Flowchart: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Observation: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Result: