O`zbekiston Raspublikasi Oliy va o`rta-maxsus ta`lim vazirligi

Mavzuning dolzarbligi. Tibbiy bioinformatika fanining eng tez
rivojlanayotgan yo'nalishlaridan biridir. So'nggi 25 yil ichida kuzatilgan tibbiyotning ushbu yo'nalishi "Inson genomi" xalqaro loyihasining boshlanishi bilan bog'liq. Ushbu mavzuni chuqur o’rganish,ushbu mavzu haqidagi bilimlarni rivojlantirish bugungi kunda asosiy masalalardan biridir.
Mavzuning o’rganilgan darajasi: Botti et al. 1998 S.A Botti, C.E Felder, J.L Sussman, I Silman Electrotactins: a class of adhesion proteins with conserved electrostatic and structural motifs Protein Eng., 11 (1998), pp. 415-420 View Record in ScopusGoogle Scholar Bourne et al. 1999 Y Bourne, P Taylor, P.E Bougis, P Marchot mavzu boyicha shu va boshqa adabiyotlardan foydalanildi.
Kurs ishining maqsad va vazifalari. Alfa/Beta gidrolazalar supero ilasi fermentlari katalitik aminokislotalarining qiyosiy bioinformasion tahlili mavzusini o’rganish hama mutatsion kasalliklarning oldini olish chora tadbirlarini rivojlantirishdan iborat.
Kurs ishining tuzilishi:Kurs ishi kirish ,asosiy qism, xulosa 3 ta rasm, foydalanilgan adabiyotlar ro’yxati, Jami 27 betdan iborat


I BOB Alfa Beta gidrolazalar supero ilasi fermentlari katalitik aminokislotalarining qiyosiy bioinformasion taxlili

1. Alfa/beta-gidrolaza qatlam fermentlarining bioinformatik tahlili

Alfa-beta gidrolazalarning super oilasi turli xil katalitik funktsiyalarga ega bo'lgan tizimli bog'liq fermentlarning eng katta guruhlaridan biridir. Bioinformatik tahlil lipaza va amidaza katalitik faolliklari bir xil tuzilmaviy doirada qanday amalga oshirilishini o'rganish uchun ishlatilgan. Funktsional diskriminatsiya uchun javobgar bo'lishi kerak bo'lgan subfamilaga xos pozitsiyalar - lipazlar va peptidazalar ichida saqlanib qolgan, ammo ular orasidagi farqli pozitsiyalar aniqlangan. Subfamilaga xos pozitsiyalardagi mutatsiyalar Candida antarctica lipase B (CALB) ga amidaza faolligini kiritish uchun ishlatilgan. Molekulyar modellashtirish tanlangan qoldiqlarning mutantlarning tegishli kutubxonasi tomonidan amid substratining bog'lanishi va katalitik konversiyasiga ta'sirini baholash uchun amalga oshirildi. Amidaza katalitik faolligining bilimga asoslangan mezonlarini qondiradigan reaktiv ferment-substrat komplekslarini tanlash uchun silika skriningi qo'llanildi. Gly39, Thr103, Trp104 va Leu278 subfamiliyaga xos pozitsiyalarda almashtirish bilan tanlangan CALB variantlari ishlab chiqarildi va eksperimental o'lchangan amidaza faolligining sezilarli yaxshilanishini ko'rsatdi. Ushbu natijalarga asoslanib, biz fermentlardagi struktura-funksiya munosabatlarini o'rganish uchun tizimli vositani ishlab chiqish va bu ma'lumotni ratsional ferment muhandisligi uchun ishlatish uchun subfamilaga xos pozitsiyalarning qiymatini yanada chuqurroq o'rganishni taklif qilamiz.
Qiyosiy bioinformatik tahlil fermentlarning struktura-funktsiya munosabatlarini o'rganishning asosidir. Shu bilan birga, umumiy ajdoddan kelib chiqqan va tabiiy tanlanish jarayonida sezilarli funktsional o'zgarishlarga uchragan ko'plab fermentlar statistik jihatdan ishonchli qiyosiy tahlil uchun maqbul ketma-ketlik o'xshashligiga ega emas. Shu bilan birga, ularning faol sayt tuzilmalari, umuman olganda, saqlanib qolishi mumkin, boshqa qismlar esa sezilarli darajada farq qilishi mumkin. Shu sababli, eng funktsional jihatdan muhim tarkibiy elementlar - faol sayt tuzilmalarining qiyosiy tahlilini amalga oshirish ham mantiqiy, ham jozibali ko'rinadi; ya'ni substratni bog'lashda va katalitik mexanizmda ishtirok etadigan aminokislota qoldiqlari. PDB ma'lumotlar bazasidan foydalanish asosida fermentlar tarkibidagi funktsional muhim aminokislotalar qoldiqlari va bo'shliqlarini strukturaviy tahlil qilish va identifikatsiya qilish dasturlari bilan birgalikda ferment faol sayt tuzilmalari kutubxonasini yaratish uchun kompyuter algoritmi ishlab chiqilgan. Taklif etilgan metodologiya ba'zi a,b-gidrolaz superfamiliya fermentlarini solishtirish uchun ishlatilgan. Tushunish katalitik maydonlarning yuqori strukturaviy o'xshashligini, shu jumladan katalitik triadaning konservativ tashkil etilishini va oksianion teshik qoldiqlarini, taqqoslangan uzoq gomologlar orasida keng funktsional xilma-xillikka qaramasdan aniqladi. Metodologiya turli toifadagi fermentlarning katalitik va substrat bog'lanish joylarining strukturaviy tashkil etilishini solishtirish, shuningdek, fermentlar evolyutsiyasini o'rganish va ferment faol sayt tuzilmalari ma'lumotlar bankini yaratish uchun ishlatilishi mumkin.

1-rasm
C. antarktidadan (1TCB) lipaz B va H. brasiliensisdan (1YB6) gidroksinitril liazaning strukturaviy moslashuvi. Ikki fermentning faol joyi qoldiqlarini o'z ichiga olgan konservalangan qismlar turli ranglarda belgilangan.
PDB ma'lumotlar bazasidan foydalanishga asoslangan ferment faol sayt tuzilmalari kutubxonasini yaratish uchun kompyuter algoritmi, shuningdek, ko'plab tarkibiy tahlil va ferment tuzilishidagi funktsional muhim aminokislotalar qoldiqlari va bo'shliqlarini aniqlash dasturlari ishlab chiqilgan. Taklif etilgan metodologiya ba'zi a,b-gidrolaza superoilasi a'zolarining qiyosiy bioinformatik tahlili uchun ishlatilgan. PDB ma'lumotlar bankida Candida antarctica qidiruvidan olingan lipaz B bilan tuzilishga asoslangan o'xshashlik SSM dasturi yordamida amalga oshirildi. Muvaffaqiyatli oʻrnatilgan ikkilamchi tuzilma elementlari miqdori boʻyicha xitlar bekor qilindi (kamida 30% SSE maqsadli tuzilmada ham, 1TCB soʻrovida ham mos kelishi kerak). Ketma-ket bo'lmagan (nr) ketma-ketlik ma'lumotlar to'plami orqali PSI-BLAST dasturi bilan ketma-ketlikka asoslangan o'xshashlik qidiruvi amalga oshirildi. Ketma-ketliklar 95% o'xshashlik chegarasida klasterlangan va klasterdan faqat bitta vakillik ketma-ketligi olindi.
Fermentlarning to'liq o'lchamli tuzilmalari va faol maydonlarining bir nechta ketma-ketligi t-kofe va Mustang algoritmlari yordamida amalga oshirildi.
Strukturaviy tahlil uchun ThePymol dasturi ishlatilgan. Jalview dasturi birlamchi tuzilish moslamalarini tasvirlash uchun ishlatilgan.
Bir nechta tekislash statistik tahlili
Ko'p qatorli I ustunning saqlanish ballini baholash uchun Valdar&Thornton

formuladan foydalanilgan: rasm, illyustratsiya va hokazolarni saqlaydigan tashqi fayl.
Ob'ekt nomi AN20758251-08-093-g005.jpg, bu erda M - aminokislotalarni almashtirish matritsasi; s i va s j - I ustunning i va j ketma-ketligidagi aminokislotalar; g koeffitsienti esa quyidagicha hisoblanadi

w i va w j parametrlari Vingron va Argosdagi kabi i va j ketma-ketliklarining og'irliklariga ishora qiladi. Oldingi tadqiqotlarimiz natijalariga ko'ra, katalitik triada qoldiqlari va oksianion teshigining ABH katlamidagi o'zgarmas joylashuvi ABH katlama fermentlarining katalitik mexanizmining saqlanib qolgan yagona tuzilmaviy xususiyati emasligi ko'rinadi. Haqiqatan ham, biz ABH katlama fermentlarining katalitik yadrosining strukturaviy saqlanishi bilan bog'liq bo'lgan tadqiqotimizda, avvalroq, katalitik mexanizmda ishtirok etadigan qoldiqlar b-varaqning bir tekisligida joylashganligini aniqladik. faqat ABH burmasidagi strukturaviy oʻrnini saqlab qoladi, balki saqlanib qolgan tekis geometriyalar bilan oʻralgan . Xususan, “katalitik kislota zonasi” , “nukleofil zonasi” va “oksianion zonasi” katalitik kislota, katalitik nukleofil va oksianion teshigi qoldiqlarini mos ravishda optimal tartibda muvofiqlashtiradi. fermentativ faollikka erishish uchun talab qilinadi. Planar zonalar b varaq iplarining C uchida joylashgan: katalitik kislota zonasi b7 va b6 iplarning C uchidagi qoldiqlardan, nukleofil zonasi esa C-dagi qoldiqlardan hosil bo'ladi. b5 va b3 iplarning uchlari va oksianion zonasi bilan ustma-ust tushadi, bu esa b3 va b4 iplarning C uchidagi qoldiqlardan hosil bo'ladi.
Katalitik kislota, katalitik nukleofil va oksianion teshigi qoldiqlarining muvofiqlashuviga qo'shimcha ravishda, biz katalitik kislota zonasi, nukleofil zonasi va oksianion zonasi katalitik histidinning koordinatsiyasiga bilvosita ta'sir qilishini aniqladik . Xususan, katalitik kislota zonasi katalitik gistidindan oldin halqa bo‘lagi bilan bog‘langanligini va nukleofil zonasi va oksianion zonasidan saqlanib qolgan aromatik qoldiqlar katalitik gistidindan keyin keladigan halqa fragmentidagi qoldiqlar bilan o‘zaro ta’sir qilishi mumkinligini ko‘rsatdik. Biz uchta planar zonaning katalitik gistidinni o'z ichiga olgan egiluvchan halqaning barqarorlashuviga kooperativ ta'sir ko'rsatishini, uning b-varaqning tepasida va katalitik kislota va katalitik nukleofilga yaqin o'rnini tartibga solishini xulosa qildik. Katalitik histidindan oldin va undan keyin bo'lgan halqa qismlarini o'z ichiga olgan o'zaro ta'sirlar serin gidrolazalarida kuzatiladigan taniqli, saqlanib qolgan zaif vodorod aloqasini to'ldiradi, bu esa katalitik gistidinning imidazol halqasini b-da bog'laydi. b6 ipining C-terminusidagi qoldiqning asosiy zanjir kislorodi bilan o'zaro ta'sir qilish orqali varaq.
Hozirgacha ABH katlama fermentlarining strukturaviy yadrosini qiyosiy tahlilimiz b-varaqda joylashgan katalitik mexanizm birliklarini muvofiqlashtiruvchi konservatsiyalangan, strukturaviy tashkilotlarni aniqlashda muvaffaqiyatli bo'ldi. Ammo, katalitik mexanizmning boshqa qoldiqlaridan farqli o'laroq, katalitik gistidinni yopiq, strukturaviy tashkilot tomonidan muvofiqlashtirish mumkin emas, chunki u moslashuvchan halqada joylashgan va shuning uchun katalitikni muvofiqlashtiradigan strukturaviy elementlar mavjudligini so'rash oqilona savoldir. histidin yuqorida aytib o'tgan to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita o'zaro ta'sirlardan tashqari katalitik triadaning boshqa qoldiqlari yonida.
Bu savolni hal qilish uchun biz katalitik gistidin atrofidagi mahalliy tuzilishga e'tibor qaratdik, katalitik qoldiqlarni bir-biriga nisbatan nozik sozlashni boshqaradigan strukturaviy determinantlarni qidirdik. Vakil ABH tuzilmalarining faol joylarining qiyosiy tahlili katalitik gistidinni katalitik kislota va katalitik nukleofil yonida muvofiqlashtiruvchi va to'g'ri yo'naltiruvchi bir nechta saqlanib qolgan strukturaviy elementlarni aniqladi. Bundan tashqari, katalitik mexanizmning qoldiqlarini muvofiqlashtiradigan bir nechta saqlanib qolgan strukturaviy elementlar ligandlarni bog'lashda muntazam ishtirok etganga o'xshaydi. Umuman olganda, ushbu keng qamrovli tadqiqot natijalari ABH katlamining katalitik strukturaviy yadrosining tizimli tavsifini to'ldiradi. Ketma-ket taqqoslash va eksperimental ma'lumotlardan kelib chiqadigan ma'lumotlar bilan birgalikda biz ABH katlama fermentlarining faol sayt doirasini to'liq, tizimli xaritalash fermentativ faollikka ta'sir qiluvchi omillarni yoritishga yordam beradi va ABH foydaliligini potentsial oshirishga yordam beradi. oqsil muhandisligi ilovalarida katlama fermentlari.
Kirish bo'limida ko'rib chiqqanimizdek, ABH katlama fermentlarining kislota-asos-nukleofil katalitik triadasi qoldiqlari ABH burmasi bo'ylab saqlanib qolgan pozitsiyalarda joylashgan: katalitik kislota va katalitik nukleofil bilan bir tekislikda joylashgan. b-varaq, katalitik asos, konservalangan gistidin esa bu tekislikdan tashqarida joylashgan bo'lsa-da, boshqa ikkita katalitik qoldiq bilan bevosita o'zaro ta'sir qiladi. Oldingi tadqiqotimizda biz planar katalitik qoldiqlarni muvofiqlashtiruvchi saqlanib qolgan strukturaviy elementlarni aniqladik. Bu erda biz oqsillarning strukturaviy tasnifi (SCOP) ma'lumotlar bazasining 40 ABH qatlamli fermentlar oilasi vakili tuzilmalarini solishtirish orqali katalitik kislota va katalitik nukleofil yonida joylashgan katalitik gistidinni muvofiqlashtiruvchi saqlanib qolgan strukturaviy elementlarni qidirdik , Protein ma'lumotlar bankidan (PDB) olingan .
Katalitik gistidinning katalitik nukleofil va katalitik kislotaga nisbatan koordinatsiyasini o'rganish uchun bizning qiyosiy tahlilimiz ikki qismdan iborat bo'ldi: birinchi qism katalitik nukleofil-asos juftligi atrofidagi tuzilishga, ikkinchi qism esa katalitik nukleofil-asos juftligiga tegishli. katalitik kislota-asos juftligini o'rab turgan struktura bilan bog'liq. Ushbu tahlil natijalari ham ikki qismdan iborat: birinchi qismda katalitik gistidin yonidagi katalitik nukleofilni koordinatsiyalashda ishtirok etuvchi saqlanib qolgan strukturaviy elementlar bilan tanishtiramiz, ikkinchi qismda esa biz ushbu sohani qayta ko'rib chiqamiz. katalitik kislota zonasini va katalitik gistidin yonidagi katalitik kislotani muvofiqlashtiruvchi saqlanib qolgan strukturaviy elementlarni o'rab oladi. ABH fermentlarining faol joyida joylashgan, lekin katalitik qoldiqlarni muvofiqlashtirishda ishtirok etmaydigan qo'shimcha saqlanib qolgan strukturaviy elementlar ikkala qismda ham qayd etilgan.
Nihoyat, biz ligand bilan bog'langan ABH tuzilmalarining faol joylarini taqqoslashdan olingan topilmalarimiz bilan tanishtiramiz, bu erda katalitik qoldiqlarni muvofiqlashtirishda ishtirok etadigan bir nechta saqlanib qolgan strukturaviy elementlar ham ligandni bog'lashda ishtirok etishini aniqladik.

2.