O’zbekiston respublikasi oliy ta’lim, fan va innovatsiyalar vazirligi mirzo ulug’bek nomidagi o’zbekiston milliy universiteti

O’ZBEKISTON RESPUBLIKASI OLIY TA’LIM, FAN VA INNOVATSIYALAR VAZIRLIGI


MIRZO ULUG’BEK NOMIDAGI
O’ZBEKISTON MILLIY UNIVERSITETI

Fan:
Mavzu: Mikroorganizmlardan lipaza fermentini ajratib olish usullari

Tayyorladi: Anorqulova Mahliyo
Bajardi:
TOSHKENT 2023
Reja:
1. Fermentlar injenerligining asosiy vazifasi.
2. Mikroorganizmlardan ferment preparatlarini ajratib olish usullari
3. Tozalanmagan, kompleks ferment preparatlarining olinishi.
4. CHo‘ktirish usullari va uning nazariyasi. 5. Fermentlarni tozalash usullari.

Fermentlar injenerligining asosiy vazifasi – biologik sistema yoki tirik hujayralardan ajratib olingan fermentlarning katalitik xususiyatlaridan foydalangan holda biotexnologik jarayonlarni yaratishdir. U yangi mahsulotlarni olish, ularning sifatini yaxshilash va iqtisodiy ko‘rsatkichlarini ko‘tarish bilan bog‘liq bo‘lgan masalalarni echadi. Hozirgi kunda amaliyotda fermentlar keng qo‘llanadi. Ma’lumki, fermentlardan organik sintezlarni katalizatori sifatida foydalaniladi. SHunga qaramay, fermentlarning “nozik” tomoni ham bordir, ya’ni ularning buzilishidir. Ular kam chidamli moddalar bo‘lib, nozik makromolekulyar strukturali oqsillardir. Ular tashqi ta’sir ostida osongina o‘z xossasini yo‘qotadi. Fermentlar katalizatorligida kechadigan reaksiyalar murakkab mexanizmga ega. Ularning aktivligini tashqi muhitning o‘zgarishi, uning kislotaliligi, ularni aktivlashtiruvchi yoki susaytiruvchi qo‘shimcha moddalar qo‘shish bilan boshqarish mumkindir. Fermentlar manbai turli hayvon, o‘simliklarning to‘qimalari, mikroorganizmlar bo‘lishi mumkin. Fermentlar qaysi biri kerakligi va qaysi birini olish qulayligiga qarab tanlanadi. YAqin davrlargacha amaliy maqsadlarda hayvon va o‘simlik fermentlaridan foydalanib kelingan. Hayvonlardan olinadigan fermentlar go‘sht sanoatining yo‘ldosh mahsulotlari hisoblanadi. Barcha to‘qima va hujayralar ichida fermentlarga boy organ oshqozon osti bezidir. Undan tarkibida bir qator gidrolitik fermentlar (amilaza, proteaza, lipaza va b.) tutgan kompleks preparatlar olinadi. Masalan, oshqozon osti bezidan pankreatin - quritilgan ekstrakt olinadi. Hayvon xomashyolaridan ayrim fermentlarning tozalangan preparatlari - pepsin, tripsin, ximotripsin, rennin (ximozin), ribonukleaza, DNKaza, lipaza, gialuronidaza, katalaza ham ajratib olinadi. O‘simliklardan sanoat miqyosida proteolitik fermentlarning ayrim preparatlari - papain (qovun daraxti mevasining sharbatidan), fitsin (anjir bargi va Ficus oilasiga mansub o‘simliklardan) ajratib olinadi. SHu bilan birga o‘simliklardan ferment ajratib olish iqtisodiy jihatdan samarali emas, chunki sarflanadigan o‘simlikka nisbatan olinadigan mahsulot kam miqdorda bo‘ladi. Undan tashqari har doim ham istalgan mintaqada kerakli o‘simlikni o‘stirish imkoni yo‘q.

Hayvonlardan fermentlarni ajratib olishda ham ayrim qiyinchiliklar tug‘iladi. SHuning uchun hozirda fermentlar manbai sifatida mikroorganizmlardan keng foydalanilmoqda. Mikroorganizmlar – ferment olish uchun juda qulay manba hisoblanadi, chunki ularning hujayradagi konsentratsiyasini mikroorganizm o‘sishini tezlatish yoki genetik manipulyasiya hisobiga oshirish mumkin. Mikroorganizmlar tez o‘sadi, arzon muhitlarda o‘sadi va turli fermentlarga boydir. Mikrob fermentlari hozirda o‘simlik va hayvon fermentlari o‘rnini bosmoqda. Qator fermentlar meditsina diagnostikasida ham o‘ziga xos o‘rin egallab kelmoqda. Masalan, xolesterinoksidaza qon zardobidagi xolesterin, ureaza esa siydik kislotasi miqdorini miqdorini o‘lchashda ishlatiladi. Gen injenerligi tadqiqotlarida esa restriktatsion endonukleazalar va ligazalar ishlatiladi. Mikrobiologik usulda olingan fermentlar plastmassa ishlab chiqarishda ham o‘rin egallaydi. Qattiq yoki suyuq ozuqa muhitlarida o‘stirilgan mikroorganizmlarning kulturasi va ularning kultural suyuqliklari tarkibida juda ko‘p miqdorda ballast moddalap bordir. Fermentlarni ajratish va tozalash - ko‘p mehnat va harajat talab qiluvchi jarayondir, agarda ferment preparati mikroorganizm kulturasi ko‘rinishida ishlatilsa, u tozalanmaydi. Spirt va terini oshlash tarmoqlarida tozalanmagan mikroorganizmlar kulturasini ishlatish maqsadga muvofiqdir va xuddi shunday mikroorganizmlarni qishloq xo‘jaligida em-xashak tayyorlashda yoki fermalarda emlarni qayta ishlashda qo‘llash mumkin. Oziq-ovqat sanoatining bir qancha tarmoqlarida (non, pivo, vino, pishloq, kraxmal va sharbat ekstraksiya qiluvchi), hamda tekstil, mo‘yna va mikrobiologik sanoatlarda, shu jumladan tibbiyotda ballast moddalardan qisman yoki to‘liq tozalangan, ya’ni faqat toza ferment preparatlari ishlatiladi. Toza ferment preparatlarini olishning boshlang‘ich materiali bo‘lib filtrlangan kultural suyuqlik, produtsentning biomassasi yoki qattiq ozuqa muhitda o‘stirilgan kulturaning suvli ekstrakti xizmat qiladi. Ferment preparatlari kukun yoki suyuq konsentrat ko‘rinishida olinishi mumkin. Ajratish jarayonida preparatning ymumiy massasida faol oqsilning nisbiy ulushi, ya’ni uning ulushiy faolligi optadi. Tozalanmagan, kompleks ferment preparatlarining olinishi. Tozalanmagan ferment preparati - mikroorganizm kulturasini mo‘‘tadil sharoitda namligi 8-12% ga olib kelingan va butun ozuqa muhiti qoldiqlari bilan birgalikdagi massasidir. Tozalanmagan ferment preparati kulturani qattiq yoki suyuq ozuqa muhitida o‘stirish yo‘li bilan olinishi mumkin. Suyuq muhitda o‘sgan kultura quritishdan oldin biomassasi va ozuqa muhiti qoldiqlaridan qisman tozalangan yoki shundayligicha quritilgan bo‘ladi. Qattiq ozuqa muhitida o‘stirilgan mikroorganizm kulturasi odatda 35 dan 58 % gacha namlikka zga bo‘ladi. Bunday mahsulot chidamsiz bo‘lganligi sababli uni tezda ishlab chiqarishga joriy qilish yoki namligini 10-12% gacha quritib olish kerak. Quritish jarayonidan oldin, o‘stirish xonasidan olingan mikroorganizm maydalanadi va keyin quritiladi Mikroorganizm kulturalarini quritish uchun tasmali, tonnelli, shaxtali, barabanli, javonli (shkafli) va tebranuvchan quritgichlardan foydalanish mumkin. Ishlab chiqarishda, yuqorida qayd qilinganlariga nisbatan ko‘proq to‘g‘ri yo‘naltirilgan baraban tipidagi quritgichlar ishlatiladi. Bunda xo‘l kultura issiqlik beruvchi qurilma bilan birgalikda 80-85oS da quritgichga tushadi. Bunday yuqori haroratda quritiluvchi xo‘l mikroorganizmlarning mayda bo‘laklaridagi namni bug‘lanishi hisobiga qattiq qizib ketish holati kuzatilmaydi va undagi fermentlarning faolligi to‘liq saqlanadi. Ko‘pchilik barabanli quritgichlarning ichki tomonida parraksimon kurakchalar mavjud bo‘lib, bara6an 6-8 min-1 tezlikda aylanishi hisobiga quritilayotgan materialni bir tekisda tarqalishini va quritilishini ta’minlaydi. SHuning uchun bunday tipdagi quritgichda quritilgan mahsulot butun massasi bo‘ylab bir xil namlikka ega bo‘ladi. Ushbu quritgichda mikroorganizm bo‘lakchalari 3-7 min. davomida quritiladi, berilayotgan issiqlik tezligi 2-3 m/s, 80-850S haroratda hamda chiqishda esa 60-65oS bo‘ladi va quritilayotgan material harorati 400Sdir. Quritish jarayonida atigi 3-10% gacha ferment faolligi yo‘qotilishi mumkin. Mikroorganizmlarni quritishda ishlatiladigan quritgichlarning yana bir turi – germetik berk bo‘lgan lentali bug‘ konveyerli quritgichdir. Bunday qurilmalarda fermentning faolligi ko‘p yo‘qotiladi, lekin ular ixcham va yuqori samaradorlikka ega. Qattiq ozuqa muhitida o‘stirilgan mikroorganizmlarni quritish uchun har xil konstruksiyali quritgichlardan foydalanish mumkin, qaysiki mahsulotning faolligi pasayishini minimumgacha tushirishni, uning quritgichda 5-8 min. davomida bo‘lishi va chiqishida 40-42oS dan pastda bo‘lishini ta’minlaydi. Tayyor quruq mikroorganizmlar maxsus qoplash mashinalarida 25-40 kg qilib qoplanadi va tayyor mahsulotlar omboriga yuboriladi. Ko‘pchilik produtsentlar sintez qilgan fermentlarning asosiy qismini suyuq ozuqa muhitiga chiqaradilar va to‘playdilar. Toza ferment preparatlarini produtsentning biomassasi bilan birgalikda filtrlarda, sentrifugalarda yoki separatorlarda ajratiladi. Mikrobiologiya sanoatida asosan tashqi tomoni bilan filtrlovchi yacheykalibarabanli to‘xtovsiz ishlovchi vakuum filtrlar ishlatiladi. Bu filtrlar yuqori darajada mexanizatsiyalashtirilgan bo‘lib, har xil suspenziyalarni bir xil tezlikda filtrlash imkonini beradi. Barabanning sirti to‘rsimon bo‘lib, bo‘z yoki filtrlovchi sun’iy gazlama bilan o‘ralgan va u filtrlanuvchi suyuqlikka cho‘ktirilgan bo‘ladi. Filtrlovchi sirtda to‘plangan har xil erimagan komponent va biomassa maxsus pichoq yordamida tozalanadi. Baraban filtrlar biomassani ajratish uchun juda qulay, lekin ular past samaradorligi, qo‘polligi va aseptika sharoitlarini ta’minlay olmasligi bilan ajralib turadi. Ferment sanoatida ko‘pincha ramali filtr-press ham ishlatiladi. Mahsulot qo‘l ishiga asoslangan holda olinadi. Ramali filtr-presslarniig filtrlovchi hajmi kichik bo‘lganligi sababli barabanli vakuum-filtrga nisbatan ham kam samaradordir. Ramali filtrda filtrlash jarayoni 0,6-0,4 Mpa bosim ostida olib boriladi. Odatda filtratning birinchi qismi tiniq bo‘lmaydi va u qayta filtrlanadi. Filtr-pressning kamchiliklari gorizontal kamerali tipdagi FPAKM da birmuncha bartaraf etilgan. U ustma-ust joylashgan filtrlovchi plitalar va filtrlovchi gazlamadan iborat. Ushbu uskunaning ishi avtomatlashtirilgan va ish yuzasi 2,5 dan 50 m2 hajmga zga. Nisbiy samaradorligi boshqalariga nisbatan b-8 marta yuqori va ferment faolligi 4-5% atrofida yo‘qotiladi. Ularni ishlab chiqarishga joriy qilish juda istiqbolli va bakteriyalar kultural suyuqligini filtrlashda juda qo‘l keladi. Ferment sanoatida 8SM tipidagi separatorlar ham keng qo‘llaniladi. Ular ichiga baraban o‘rnatilgan idish ko‘rinishida bo‘ladi. Barabanlarning ichida silindrik to‘siqlar o‘rnatilgan bo‘lib, yuqori tezlikdagi markazdan qochma kuch hisobiga uning tagida cho‘kma holida biomassa va boshqa komponentlar cho‘kadi. Separatorning samaradorligi yuqori bo‘lib, 2000-5000 l/s gacha etadi. Bizda ASE3, ASI, ASE-B tipidagi separatorlar hamda "Alfa-Laval" (SHvetsiya) firmasining soploli separatorlari ishlatiladi. Biomassani filtrlash samarasi ishlatilayotgan uskuna tipiga, ozuqa muhit tarkibiga, ajratilayotgan bo‘lakchalar katta-kichikligiga, erimagan fraksiyalar miqdoriga, filtrlovchi materialning fizik-kimyoviy xususiyatlariga, harorat rejimiga va boshqa omillarga uzviy bog‘liqdir. Filtrlash jarayonini yaxshilash maqsadida kultural muhit kimyoviy qayta ishlanadi, ya’ni ishqoriyligi rN 8-8,5 ga keltirib 0,1%li SaCl eritmasi va har xil kizelgurlar (diatomit, radiolit, mikrozil, klargel va x.k.) qo‘shiladi. Bu to‘ldiruvchilar filtrlash samarasini oshiradi, lekin ferment faolligiga salbiy ta’sir qiladi. Olingan biomassa (bioshrot) sterilizatsiya qilinadi va quritilib chorva mollariga em sifatida ishlatiladi. Kultural suyuqlik filtrati esa toza ferment preparati olish uchun qayta ishlashga yuboriladi. Qattiq ozuqa muhitida o‘stirilgan mikroorganizmlardan fermentlarni ekstraksiya qilish. Barcha fermentlar asosan suvda eruvchandir. SHuning uchun eng yaxshi ekstragent bo‘lib suv hisoblanadi. Mikroorganizmlardan fermentlarni olish uchun ular mayda qilinib hujayra devorlari mexanik yoki avtomatik holda buzilib, ekstraksiya jarayoniga jalb etiladi. Bu usulda ham xo‘l holdagi, ham quruq holdagi mikroorganizmdan ferment eritmasini olish mumkin. Biomassadan ferment ekstraksiyasini to‘liq amalga oshirish uchun harorat, rN, jarayon davomiyligi, ekstraksiya uskunasining konstruktiv xususiyatlari, ajratilayotgan ferment tabiati va boshqa bir qancha omillarga bog‘liq. Bu omillar har bir produtsent misolida alohida tadqiqotlar yordamida aniqlanadi va tavsiya etiladi. Masalan, harorat ekstraksiya jarayoniga katta ta’sir ko‘rsatadi, ya’ni juda ko‘p fermentlar termolabil bo‘lib, hattoki 35-40oS da inaktivatsiyaga uchraydi. SHuning uchun zavod sharoitida iloji boricha suvning harorati 22-25oS da ushlab turiladi va har bir mikroflora o‘smasligi uchun antiseptiklardan (formalin, benzol, toluol, xloroform va x.k.dan foydalaniladi. Ko‘pchilik holatlarda fermentlarni rN 5-7 ko‘rsatkichida to‘liq ajratib olish mumkin. Bioshrot bilan fermentlarni kam isrofgarchiligi asosida quyuqlashtirilgan ekstraktlar olish uchun maxsus ekstraksiya uskunalarini ishlatish kerak. Bu qurilmada ekstraksiya qilinayotgan mikroorganizm fermenti nisbatan ko‘p faollikni yo‘qotadi va qo‘l ishiga asoslanadi. Vakuum-bug‘glantirnsh usulida ferment eritmalarini quyuqlashtirish. Qattiq va suyuq ozuqa muhitlarida o‘stirilgan mikroorganizmlarning ekstraktlari saqlash uchun chidamsizdir. Tayyor texnik preparat formalarini (P2x va G2x) olish va ularni quyuqlashtirish kerak. Quruq texnik yoki toza ferment ppepapatlarini vakuum-bug‘lantirish usuli ham bir bosqich bo‘lib hisoblanadi. Odatda fermentlar bug‘lantirish haroratiga juda ta’sirchan bo‘ladi. SHuning uchun quyuqlashtirishning asosiy sharti past haroratda qaynatish va jarayonni qisqa muddatda olib borish bilan birga, bug‘lantirilayotgan suyuqlikni qizib ketishi va fermentlar inaktivatsiyaga uchrashini oldini olishdir. Agarda quyuqlashtirilayotgan eritma qanchalik toza bo‘lsa, shunchalik kam miqdorda har xil moddalarni kam tutadi va undagi ferment yuqori haroratga juda ham ta’sirchan bo‘ladi. Qattiq ozuqa muhitida o‘stirilgan organizm ekstraktida juda ko‘p miqdorda himoyalovchi birikmalar bo‘ladi va ular quyuqlashtirish jarayonida ferment inaktivatsiyasini oldini oladi, lekin kultural suyuqlikni quyuqlashtirishda buning aksini kuzatish mumkin, ya’ni ferment ko‘p miqdorda faolligini yo‘qotadi. Quyuqlashtirish jarayonida ferment eritmalaridagi moddalarning miqdori va mineral tarkibi birmuncha o‘zgaradi, quruq modda hisobiga esa 11-20 %ga kamayadi va quyuqlashgan ekstraktning rN ko‘rsatkichi ham o‘zgaradi. Produtsentning turiga qarab ularning kultural suyuqliklari ham har xil kimyoviy tarkibga va fermentlar kompleksiga ega bo‘lganligi uchun, vakuumbug‘lantirishning harorat rejimlari tadqiqot yo‘li bilan aniqlanadi. Ferment faolligini quyuqlashtirish jarayonida yo‘qotilishi nafaqat uni olib borilish rejimiga, balki uskuna yoki qurilmaning konstruksiyasiga ham bog‘liqdir. Keyingi yillarda vakuum-bug‘lantirish uskunalari ancha takomillashtirilmoqda. Ushbu uskunalar trubka shaklida (gorizontal, vertikal va qiya) bo‘lib, jarayonni o‘tish muddatini 10 marotabaga yaqin qisqartirdi va fermentni faolligini yo‘qolishini bir muncha kamaytirdi. Bular jumlasiga «Alfa-Laval» (SHvetsiya), «Edinstvo» (YUgoslaviya), «Lyuva» (SHveysariya), «APV» (Fransiya») va b. bir qancha firmalar uskunalarini kiritish mumkin va ularning samaradorligi 200 dan 20000 l/s ni tashkil qiladi hamda fermentni faolligi 10% atrofida yo‘qotiladi. Ferment eritmalarini membranalar yordamida tozalash Membranali tozalash usuliga dializ va elektrodializ, baromembranali usulga esa qaytariluvchi osmos, ultrafiltratsiya, mikrofiltratsiya va nozik filtratsiya kabilar kiradi. Eritmadagi moddalarni dializ usulida ajratish – membranani modda massasiga qarab tanlab o‘tkazuvchanlik xususiyatiga asoslangan. Bu jarayon uchun yarimo‘tkazgich membrananing har ikki tomonida eritmalar konsentratsiyasini farqi vujudga kelishi kerak. Dializ jarayonini ushbu tenglik bilan ifodalash mumin: Q = DdSΔC Bunda, Q – ma’lum vaqt ichida membranadan o‘tgan modda miqdori, Dd – dializ koeffitsienti, S – membrana sirtining yuzasi, ΔC – membrananing har ikki tomonidagi moddalarning konsentratsiyasi farqi. Dializdan ferment preparatlarini kichik molekulali moddalardan tozalashda foydalaniladi. Masalan, ferment eritmalarini shakar, aminokislotalar, mineral tuzlar va boshqalardan 60-100% gacha bo‘lgan miqdorda tozalashga erishish mumkin. Ayniqsa, fermentlar yuqori konsentratsiyali tuzlar bilan cho‘ktirilganda dializdan va eletrodializdan unumli foydalanish kerak. Lekin to‘rtlamchi strukturaga ega bo‘lgan fermentlarni va metallofermentlarni ajratishda elektrodializdan foydalanish mumkin emas, ya’ni ferment ushbu jarayonda o‘z faolligini yo‘qotadi. Dializ jarayoni juda sekin o‘tuvchi jarayondir, hamda eritmaning miqdori ko‘p bo‘lganda, juda ko‘p miqdorda membrana sarflanadi. Dializda quyidagi har xil ko‘rinishdagi yarimo‘tkazgich membranalar ishlatiladi, pergament, sellofanning har xil turlari, ultrafiltratsiyada ishlatiladigan membranalar va boshqalardir. Dializ usuli bir qancha kamchiliklarga ega bo‘lganligi sababli hozirgi kunda ishlab chiqarishda ishlatilmaydi. Ba’zan ilmiy laboratoriyalarda fermentlarni yuqori tozalikda olish uchun ishlatilishi mumkin. Baromembrana usuli ishlatiladigan membranalar tirqishlarining kattakichikligiga qarab sinflanadi. Masalan, qaytariluvchan osmos (≈3xI0-4 mkm); gelfiltratsiya (15x10,5 mkm); mikrofiltratsiya (0,2 mkm) va nozik filtratsiya (10 mkm) dir. Quyuqlashtirish va tozalashning qaytariluvchan osmos va ultrafiltratsiya usullari kimyo, neftni qayta ishlash, oziq-ovqat, farmatsevtika va ferment sanoatlarida juda keng tarqalgan. Eng asosiysi, jarayonni juda ham kam harajatlar va energiya evaziga olib borilishidir. Ultrafiltratsiya jarayonida fermentlarni harorat ta’siridagi inaktivatsiyasi umuman bartaraf qilingan bo‘lib, birvarakayiga eritma bir qancha ballast birikmalardan xona haroratida tozalanadi. Ushbu jarayon yuqori bosim ostida o‘tganligi uchun samaradorligi ham yuqoridir. Bu usulning ham asosiy elementi bo‘lib membranalar hisoblanadi. Hozirgi kunda sellofandan, kauchukdan, polietilendan, polisteroldan, sellyulozadan va b. bir necha xil materiallardan tayyorlangan membranalar ishlatilmoqda. Membranalar xususiyatiga qarab 0,05-0,2 mkm li bir qavatli – izotrop va ikki qavatli – anizotrop turlariga bo‘linadi. CHo‘ktirish usullari va uning nazariyasi. Sanoat uchun zarur bo‘lgan ko‘pchilik fermentlar suvda eruvchan oqsillardir. Ferment eritmalari olinish manbalariga qarab mikroorganizmlar lizatlari, ekstraktlari, kultural suyuqlik filtratlari, o‘simlik yoki hayvon to‘qimalari gomogenatlari bulishi mumkin. Bu ferment eritmalari tarkibi juda murakkab sistemaga ega. Unda fermentlardn tashqari kolloid tabiatiga ega bo‘lgan har xil birikma va moddalar ham uchraydi. Bunday murakkab sistemalardan fermentlarni ajratib olish mushkul vazifadir. Ma’lumki, oqsilning gidrofob guruhlari oqsil molekulasi ichida to‘planib harakat joylashadi. Oqsilning har xil erituvchilarda erish darajasi molekula sirtida gidrofob va gidrofil qoldiqlarning tarqalishi bilan belgilanadi. Oqsillarni asosiy erituvchisi bo‘lgan suvning ba’zi xususiyatlarini (harorat, rN, ion kuchi, neytral tuzlar, organik erituvchilarni yoki inert birikmalarni qo‘shish yo‘li bilan) o‘zgartirish hisobiga oqsil molekulasining gidrat yoki solvat qatlamiga ta’sir qilib agregatsiyaga uchratish va cho‘kmaga tushirish mumkin. Sanoatda asosan organik erituvchilar yoki tuzlar bilan cho‘ktirishdan foydalaniladi. Bu usullar bir-biridan cho‘ktirish mexanizmi bilan farqlanadi. Neytral tuzlar yordamida cho‘ktirish. Bu jarayon asosan oqsil molekulasining gidrofobligi darajasiga bog‘liq. Tipik oqsil molekulasi sirtida bir qator aminokislotalar (tirozin, triptofan, leysin, izoleysin, metionin, valin va fenilalanin) zanjiri shaklida yopishgan gidrofob qismlarga ega. Oqsil molekulasining gidrofob qismi suv bilan to‘qnashganda suv molekulalari bilan orientirlangan qavat hosil bo‘ladi va shu joylar «muzlatilgan» holatda bo‘ladi. Bunday tartibli strukturalar termodinamik jihatdan chidamli emasdir. Agar suv molekulalarini oqsil tabiatiga o‘xshamagan moddalar bilan immobilizatsiya qilinsa, oqsil molekulalari o‘zaro ta’sirlashib agregatlar hosil qila boshlaydi. Ma’lumki, tuzlarning ionlari gidratlanadi. Agar oqsil eritmasiga ma’lum miqdorda suv qo‘shilsa u suv bilan bog‘lanadi va suvdan bo‘shagan oqsil molekulalari agregat hosil qiladi. Tuz ionlari qancha ko‘p bo‘lsa, oqsillarning agregatlanishi ham shuncha kuchayadi va cho‘kmaga tushishi ortadi. Tuzlar bilan cho‘ktirish jarayoni ta’siriga ko‘ra har xil oqsillarga har xil bo‘ladi. Bu birinchidan, oqsil molekulasi sirtidagi gidrofob qismlarning miqdori va razmeriga bog‘liq. Qancha shunday qismlar ko‘p bo‘lsa, oqsil shuncha tez cho‘kmaga tushadi. Ba’zi oqsillar borki, tuzlarning eng yuqori konsentratsiyalarida cho‘kmaga tushmaydi. CHo‘ktirish jarayonida oqsillar yonida turgan boshqa oqsillar bilan ham agregat hosil qilib cho‘kmaga tushishi mumkin. Bunda bir qancha fermentlar kompleksini olish mumkin. Lekin fraksiyalarga bo‘lib cho‘ktirilsa bir muncha yuqori natijaga erishish mumkin. Oqsillarni tuzli eritmalarda eruvchanligi Konning empirik tenglamasiga bo‘ysunadi: lgS = lgSo - ksμ bunda S, So - oqsilning tuzli eritma va toza suvdagi eruvchanligi; ks – tuzlash konstantasi, μ – eritmaning ion kuchi. Tuzlar bilan cho‘ktirish jarayonini unumli o‘tkazish uchun ksμ ko‘rsatkichi iloji boricha katta bo‘lishi kerak. ks ko‘rsatkichi tuzning tabiatiga bog‘liq bo‘lib, vodorod ionlari konsentratsiyasiga bog‘liq emas. Ushbu jarayon gidrofob o‘zaro ta’sirga asoslangan bo‘lsada uning borishiga ta’sir qiluvchi boshqa omillar ham mavjuddir. Ular: muhit rN i, harorat. Ferment eritmasi tozaligi darajasi, jarayonni o‘tkazish muddati va boshqalardir. Tuz bilan cho‘ktirishda asosan ishqoriy metallarning neytral tuzlari ishlatiladi. Har xil ionlarning cho‘ktirish effekti ularning ion kuchiga bog‘liq. Natriy tuzlari anionlarini tuzlash ta’siri kuchiga qarab quyidagicha joylashtirish mumkin: SO42>CH3COO->Cl->NO3->Br->J->CNS-, hamda kationlarni esa quyidagicha Li+>Na+>K+>( NH4) +. Ferment preparatlarini tuz yordamida cho‘ktirilganda ularning tarkibida 6085% gacha har xil ballast qo‘shimcha moddalar uchrashi mumkin. Ushbu jarayonning eng qiyin bosqichi, bu - tuzni qo‘shish va uni eritishdir. Eritmada tuzning lokal konsentratsiyasini oshirib yubormaslik uchun u avval maydalanib, sekin astalik bilan ma’lum bir qismdan qo‘shib boriladi va tinmay aralashtirib turiladi. Aralashtirish davomida ko‘pik hosil bo‘lishiga yo‘l qo‘ymaslik kerak. Jarayon erigan na agregatlangan oqsillarning muvozanati hosil bo‘lguncha 20-40 min, ba’zida bir necha soat davom etadi. Tuz bilan cho‘ktirish juda ham ko‘p omillarga bog‘liq bo‘lgan murakkab texnologik jarayondir. SHuni esda tutish kerakki, tuz hech qachon fermentni butunlay cho‘ktirmaydi, balki uning eruvchanligini pasaytiradi, xolos. Agar eritmada 1 mg/ml oqsil bo‘lsa uning 90%i cho‘kmaga tushishi mumkin, lekin zritmada bor-yo‘g‘i 0,1 mg/ml oqsil bo‘lsa hech qanday ferment preparatini olishning iloji bo‘lmaydi. Neytral tuzlar bilan oqsillarni cho‘ktirib ferment preparatlarini olish usullari asosan chet ellarda keng tarqalggan. Organik erituvchilar yordamida cho‘ktirish. Fermentlarni suvda eruvchan organik erituvchilar bilan cho‘ktirish usullari sanoat miqyosida keng ko‘lamda qo‘llaniladi. Oqsillarni cho‘ktirish samarasi organik erituvchilar ta’sirida suvning faolligini kamayishi bilan uzviy bog‘liqdir. Erituvchining konsentratsiyasi ortishi bilan fermentning zaryadlangan gidrofil molekulalarini suv ta’sirida solvatlanish qobiliyati pasayadi. Oqsilning gidrofob qismidagi suv molekulalari organik erituvchi tomoniga o‘ta boshlaydi va natijada fermentning eruvchanligi pasayadi. Oqibatda oqsil molekulalari agregatlanadi va cho‘kmaga tushadi. Oqsillarni agregatlanishi elektrostatik va Van-der-Vaals kuchlari ta’sirida, alohida joylashgan oqsil molekulalari o‘rtasida yuzaga keladi. Oqsillarni agregatlanishi jarayoni va cho‘kma hosil bo‘lishi cho‘ktirishning bir qancha omillariga bog‘liqdir. SHulardan biri oqsil molekulasining razmeridir. CHo‘ktirish jarayonida oqsil molekulasining razmeri qanchalik katta bo‘lsa, erituvchining salbiy ta’sir qiluvchi konsentratsiyasi shunchalik past bo‘ladi. Bu bog‘liqlikka molekulaning gidrofoblik darajasi, solvat qavatiga chidamliligi na boshqa omillar ta’sir qilishi mumkin. CHo‘ktirish uchun ishlatiladigan organik erituvchi suv bilan to‘liq aralashishi va ferment bilan esa aloqada bo‘lmasligi kerak. Asosan bu jarayon uchun etil spirti, atseton va izopropil spirti keng qo‘llanilsa, metanol, n-propanol, dioksan, 2metoksietanol va boshqa spirtlar, ketonlar, efirlar va ularning aralashmalari kamroq ishlatiladi. Erituvchilarni tanlashda ularning toksikligiga, portlash xavfidan xolisligiga va pegeneratsiya bo‘lish qobiliyatiga e’tibor berish kerak. Ishlab chiqarish uchun eng yaroqlilari bo‘lib etil spirti va izopropanol hisoblansa, atsetonning ko‘rsatkichlari esa sal pastroqdir. Bular orasida eng istiqbollisi izopropanoldir. Bu erituvchilar yordamida fermentlarni komplekslarga ajratish yoki fraksiyalar holida cho‘ktirib olish mumkin. Ferment preparatlarini cho‘ktirish uchun nafaqat erituvchining tabiati va konsentratsiyasi, balki elektrolitlarning ishtiroki, cho‘ktirish harorati, muhit rN ko‘rsatkichi, quruq moddalarning tarkibi na miqdori kabi bir qancha omillarga e’tibor berish kerak. CHo‘ktirish eritmasida ba’zi ionlarning uchrashi ferment mo‘‘tadilligiga ta’sir qilishi mumkin. Masalan, Sa2+ ionlari a-amilaza, proteinaza, glyukoamilaza fermentlari faolligiga ijobiy ta’sir qilsa, magniy, marganets, kobalt kabi metall ionlari himoya vazifasini bajaradi. SHular bilan birgalikda ba’zi metallarning (Fe2+, Pb2+, Si2+, Ag2+, Ni2+, AI3+, Hg+ va x.k.) ionlari salbiy ta’sir ko‘rsatadi va ularning eritmada bo‘lishi maqcadra muvofiq emasdir. Eritmada elektrolitlarning bo‘lishi erituvchi sarfini kamaytirishga va cho‘kma strukturasini yaxshilashga xizmat qiladi. Ferment eritmasi va erituvchining harorati ferment cho‘ktirish jarayonida past bo‘lishiga harakat qilish kerak. Spirt va fermentning suvli eritmasi aralashtirilganda issiqlik ajralib chiqishi va aralashma harorati 5-100S ga ko‘tariladi. Agarda spirt oldindan sovutilgan bo‘lmasa fermentlarning inaktivatsiyasini kuzatish mumkin. Bu hodisa nafaqat termoinaktivatsiyaga, hattoki ferment molekulasini denaturatsiyagacha olib keladi. Ferment preparatlarini cho‘ktirishda rN ko‘rsatkichi juda katta ahamiyatga ega. Bir xil ferment eritmasidan har xil rN ko‘rsatkichi ta’sirida bir-biridan cho‘kmasi miqdori va ferment faolligi bilan farq qiluvchi preparatlar olish mumkin. Ma’lumki, fermentlar o‘zlarining izoelektrik nuqtalarida oqsil agregatlari hosil qilib to‘liq cho‘kmaga tushadilar. Oqsillarni izoelektrik nuqtalarida cho‘ktiruvchi reagentlar ishlatmay cho‘ktirish jarayoni izoelektrik cho‘ktirish deyiladi. Organik cho‘ktiruvchilarni izoelektrik nuqta rNiga yaqii rN da qo‘llash fermentlarni oson cho‘ktirish va erituvchini kam miqdorda sarflash uchun xizmat qiladi. rN ko‘rsatkichi izoelektrik nuqtadan chetga chiqsa cho‘kma unumi va ferment faolligi 30-50% gacha yo‘qotiladi. Faol fermentni preparat yoki mo‘‘tadil strukturali cho‘kma holida olish uchun eritmada 10-12% atrofida quruq modda miqdori bo‘lishi kerak. Ko‘p tadqiqotlardan ma’lumki, fermentlarni cho‘ktirishda, ayniqsa proteolitik fermentlarni, quruq moddaning eng optimal miqdori 10% bo‘lishi kerak. YUqorida qayd qilingan omillar qatorida ferment zritmalarini erituvchi bilan aloqada bo‘lish muddati ham katta ahamiyatga zga. Ferment sanoatida to‘xtovsiz ishlaydigan cho‘ktiruvchilarda ushbu vaqtni juda ham qisqartirishga erishilgandir, bu albatga ferment faolligini kamayishini oldini oladi. Organik erituvchilar bilan cho‘ktirish samaradorligi shu jarayonga mo‘ljalllangan uskunaga ham uzviy bog‘liqdir. Bunday uskunalar asosan ferment zritmalarini qabul qilgich, to‘xtovsiz aralashtirgich, ferment eritmasi va erituvchini to‘xtovsiz ravishda uzatuvchi konturlar, separator va avtomatizatsiya tizimlaridan tuzilgan bo‘ladi. Silindr shaklidagi aralashtirgichdan ferment eritmasi va erituvchi murakkab harakat yo‘nalishi bo‘ylab qisqa vaqt ichida aralashib o‘tadi va natijada hosil bo‘lgan aralashma separator qismiga uzatiladi. Separatorda cho‘kmaga tushgan oqsil molekulalari ajratib olinadi. Bunday qurilmada ferment bilan erituvchining aloqa muddati o‘n marotabagacha qisqartiriladi. Bunda fermentning cho‘kmaga tushish unumi 15-20% gacha ortadi. Separatorda ajratilgan cho‘kma har xil usullar bilan mo‘‘tadil sharoitda quritib olinadi. CHo‘kma tepasida qolgan suyuqlik tarkibida 50-75% gacha erituvchi ulushi bo‘ladi va rektifikatsiya bo‘limida regeneratsiya qilishga yuboriladi. Organik erituvchilar bilan cho‘ktirish unumi produtsent o‘stirilgan ozuqa muhiti tarkibiga va ferment preparatini quyuqlashtirilganlik darajasiga ham bog‘liqdir. Fermentlarni tozalash usullari. Fermentlar va boshqa oqsil moddalari har xil erimaydigan adsorbsiya (surilish) qobiliyatiga ega. Bu xususiyat oqsil aralashmalarini birikmalarga ajratishda va ayniqsa fermentlarni laboratoriya sharoitida tozalashda, hamda gomogen bo‘lgan ferment preparatlarini olishda ishlatiladi. Adsorbsiya usuli, shu bilan birga kolonkali xromatografiya usullari fermentlarni yuqori darajada toza va ko‘p miqdorda olish imkonini beradi.
Oqsillarning muhim adsorbentlari bo‘lib, hap xil ionalmashuvchilar, ya’ni kalsiy fosfat, alyuminiy gidroksid gellari va ma’lum tipdagi fermentlar uchun maxsus bo‘lgan har xil affin adsorbentlar hisoblanadi. Fermentlarni tozalash va oqsillarni ajratish texnologiyasi qanday tipdagi usulda bo‘lishiga qaramay quyidagilarga asoslanadi. Ferment mahsulotini o‘z tarkibiga olgan oqsillar aralashmasi ma’qul bo‘lgan erituvchida (buferda) eritiladi va shu erituvchi bilan muvozanatlangan kolonkaga yuboriladi. Keyin shu kolonkadan ma’lum tarkibga ega bo‘lgan buferni yoki konsentratsiyasi o‘sib boruvchi gradientli yuvish eritmasi, yoki bo‘lmasa ushbu ferment uchun maxsus bo‘lgan bog‘lovchi (ligand) yordamida oqsil bosqichma-bosqich yuvib olinadi. Kolonkadan yuvib olingan ferment preparatlari fraksiyalar to‘plamida yig‘iladi va fermentni toza preparatini olish uchun boshlang‘ich material bo‘lib xizmat qiladi. Ionalmashuv xromatografiya usuli. Bu usulda oqsillar elektrostatik kuch yordamida bog‘lanadilar, ya’ni bu hodisa zaryadlangan oqsil sirtlari va zaryadlangan ionalmashuv birikma guruhlarining zich qatlami o‘rtasida yuzaga keladi. Tipik ionalmashuvchi sifatida bo‘ktirilgan dietilaminoetil (DEAE-) yoki karboksimetil (KM) sellyulozani ko‘rsatish mumkin. Ular bo‘ktirilgan holatda zaryadli guruhlarning 0,5 M konsentratsiyasiga zga bo‘ladi. Bu zaryadlap kolonkada qapama-qarshi bo‘lgan ionlarni (metall ionlari, xlor ionlari, bufer va h.k. neytrallaydi. Odatda oqsilning umumiy zaryad belgisi ion almashuvchiga o‘tirgan ion belgisi bilan bir xil bo‘ladi va kolonkadan o‘tish jarayonida aynan uni siqib chiqaradi. SHuning uchun ham bu jarayon xususiyatiga qarab "ion almashuv" jumlasi qo‘llaniladi. Kolonkada adsorbsiyalangan kepakli oqsilni yuvish uchun affin usulidan tashqari ikki usuldan foydalaniladi. Birinchi usul - buferning rN ko‘rsatkichini ma’lum darajaga o‘zgartirish bilan ion kuchini oshirib, adsorbent va oqsil o‘rtasidagi elektrostatik o‘zaro ta’sirni kamaytirishdir. Bu usul umuman yaxshi natija bermaydi. CHunki bufer hajmini kichik bo‘lganligi uchun rN ko‘rsatkichini birdaniga o‘zgar-tirish oqsil aralashmalariga va boshqa birikmalarning yomon ajralishiga sabab bo‘ladi. Keyingi yillarda bu usul L.L.Slyuyterman va boshqalar (1981) tomonidan xromatofokus usuliga o‘tkazish yo‘li bilan takomillashtirilmoqda. Bunda yuvish jarayonida amfolit tipidagi bufer hajmi yuqori bo‘lgan buferlardan foylalaniladi va shu usul keyinchalik sanoat miqyosida o‘z o‘rnini topishi mumkin. Ikkinchi usul keng miqyosda foydalanilayotgan kaliy yoki natriy xlorid tuzlari yordamida gradient tuzishga asoslangan. Tuz ionlari ishtirokida mustaqil oqsil na adsorbentlar o‘rtasidagi o‘zaro tortish kuchi kamayadi. Tuz ionlari konsentratsiyasini oshishi bilan adsorbentga bog‘langan oqsillar o‘z o‘rinlarini ularga bo‘shatadilar va o‘zlari kolonkadan yuvilib chiqa boshlaydilar. SHu bilan birga tuz ionlari ta’sirida adsorbentlar o‘zaro yaqinlashib oqsil harakati uchun tor yo‘lkalar hosil qiladi va bu hodisa fermentlarni kolonkadan chiqishida fraksiyalarga ajratib olish imkonini beradi. Ion almashuvchiga bog‘langan fermentni affinli yuvish yordamida ajratish mumkin. Buning uchun kolonkaga oqsil bilan bog‘lanadigan maxsus ligand yuboriladi. Bunda oqsil ligand bilan birgalikda tezda kolonkadan yuvilib chiqadi. Lekin kerakli oqsilni taniydigan va uni sorbentdan ajratib oladigan ligandni topish juda mushkul vazifadir. SHu bilan birga ligandni qanday zaryadlanganligi va konsentratsiyasiga alohida e’tibor berish kerak. Bo‘lmasa qarama-qarshi holatda ligand o‘zi ionalmashuvchiga bog‘lanib qolishi mumkin. Affinli xromatografiya usuli. Bu usul oqsil va fermentlarni tozalash va ajratishning adsorbsiya hodisasiga asoslangan usullari ichida alohida o‘rinni egallaydi. Ko‘pincha uni affinli xromatografiya yoki bioaffinli yoki bo‘lmasa biospetsifik xromatografiya deyiladi. Ma’lumki, barcha biologik faol birikmalar, xususan fermentlar ham ligandlar yoki affinli ligandlar deb nomlanadigan birikmalarga maxsus bog‘lanish xususiyatlariga egadir. Agarda shunday ligandlarni inert matritsaga kovalent bog‘lasa faqat kerakli fermentni ushlovchi va qolgan oqsil va moddalarni o‘tkazib yuboruvchi maxsus adsorbentni olish mumkin. Maxsus yuvuvchilardan yoki jarayon sharoitlari farqi asosida ligandni fermentga bo‘lgan xususiyatini o‘zgartirish yo‘li bilan oqsilni desorbsiyaga uchratib, tozalash natijasida bitta yuqori tozalikka ega bo‘lgan fermentni olish mumkindir. Lekin ligand va uni ushlab turuvchini tanlash juda qiyin vazifadir. Ko‘pchilik hollarda affinli adsorbentlarni sintez qilishda tozalanayotgan fermentning xususiyatlarini e’tiborga olish kerak. Affinli xromatografiya uchun har xil turdagi erimaydigan sorbentlardan foydalanadi, lekin eng ko‘p tarqalgani ko‘ndalang qilib ulangan agaroza donachalaridir. Ular yuqori bosimda o‘z shaklini saqlaydi va buferlarni hamda erituvchilarni almashtirishga bardoshlidir. Ligandlar esa matritsaga shunday bog‘langan bo‘lishi kerakki, oqsillar hech qiyinchiliksiz ularga kelib bog‘lanishi va buning uchun matritsa bilan ligand o‘rtasida ko‘prikcha bo‘lishi kerak. Bulardan tashqari ligand boshqa birikmalar bilan o‘zaro bog‘lanmasligi, fakat matritsaga bog‘langan va yuvish, regeneratsiya jarayonlariga chidamli bo‘lishi shartdir. Gelxromatografiya usuli. Gelfiltratsiya jarayonini amalga oshirish uchun dekstran asosida olingan gellardan foydalaniladi va ular yordamida razmeriga qarab har xil makromolekulalarni tez ajratish mumkin. Gel ochiq holdagi ko‘ndalang tikilgan uch o‘lchamli molekula turi bo‘lib, kolonkalarni oson to‘ldirish uchun yumaloq donachalar (granula) ko‘rinishida bo‘ladi. Donachalarda kichik teshikchalari bo‘lib, ularga faqat juda kichik molekulali birikmalar kiradi va yirik molekulalar esa kirmaydi. Bu usul gellarning aynan shu xususiyatiga asoslangandir. Bu usul fermentlarni tozalash va ajratishda nafaqat laboratoriya, balki sanoat miqyosida ham keng qo‘llaniladi. Gelfiltratsiya uchun ko‘ndalang tikilgan dekstran (sefadekslar va sefakrillar) gellaridan, ko‘ndalang tikilgan poliakrilamid gellaridan (biogellar), akrilamid polimer zanjiri yopishtirilgan agaroza gellardan (ultragellar) va b. agaroza gellaridan foydalaniladi. Kolonkada ferment eritmasining bir qismi gel donachalar orasida va bir qismi esa donachalarning teshikchalari ichida joylashadi. Gelfiltratsiya – bu tarqaluvchan xromatografiyaning bir shakli bo‘lib, eritilgan moddalar eritmaning bir muncha yuzada joylashgan harakatchan va ichki tomonida joylashgan kam harakatli qismlarida tarqalgan bo‘ladi. Kolonkada eritilgan moddaning ushlab qolinish darajasi uning gel teshikchalariga kira olish qobiliyatiga bog‘liqdir. SHuning uchun gelfiltratsiya jarayonida kolonkadan avval yuqori molekulali moddalar va keyin esa kichik molekulalilari birin-ketin chiqa boshlaydi. Bunda gel molekulyar to‘r vazifasini bajaradi Bu jarayon ideal ravishda olib borilishi uchun gel tayyorlangan material erigan birikmalar ta’siriga juda ham inert bo‘lishi kerak. Afsuski bugungi kunda ishlatilayotgan barcha gellar inert emas va ba’zan ma’lum pN ko‘rsatkichida ular surish qobiliyatini namoyon qilishi mumkin, masalan, shunday gellarga sefakrillarni kiritish mumkin. Gelfiltratsiya usuli bilan mayda gel donachalarida yuqori bosim ostida juda ko‘p har xil moddalarning, shu jumladan oqsillarning aralashmalari ajratilmoqda. Bu yangi yuqori bosim ostida suyuq xromatografiya uslubi qisqa vaqt ichida yuqori darajali ajratish imkonini beradi va u fermentlarni tozalashning oxirgi bosqichlarida juda ham unumlidir.