O‘zbekiston respublikasi oliy va o‘rta maxsus ta’lim vazirligi universiteti fakulteti

izoelektrik markazlashuv - izoelektrik markazlashuv (IEF yoki elektrofokulyatsiya) - turli izoelektrik nuqtalarga asoslangan molekulalarni ajratadigan elektroforezning bir shakli. IEF ko'pincha oqsillar ustida amalga oshiriladi, chunki ularning elektr quvvati pHga bog'liq.

Elektroforez tarixan bir necha maqsadlarda ishlatilgan. Ammo bugungi kunda uning foydaliligi ko'p jihatdan tadqiqotchining ma'lum bir hodisa yoki tizimga nisbatan bergan "savoliga", shuningdek u foydalanmoqchi bo'lgan elektroforez turiga bog'liq.
Ammo biz ushbu texnikaning eng "kam uchraydigan" dan boshlab va eng mashhur va dunyodagi biologik fanlar dunyosida eng ko'p ekspluatatsiya qilinadigan ba'zi asosiy funktsiyalarini sanab o'tishimiz mumkin. Elektroforez foydali:
- makromolekulalarning murakkab aralashmalarining miqdoriy tahlili va "zeta" potentsiallarini hisoblash uchun (statik elektr maydon ta'sirida suyuq muhitdagi zarrachaning kolloid xususiyati).
Agaroza gellaridagi elektroforez
- DNK parchalarini ularni hazm qilishdan keyin restrakt fermentlari bilan ajratish uchun.
- Nuklein kislota molekulalarini keyingi tahlil qilish uchun ularni membranalarga o'tkazilishidan oldin ajratish uchun.
- PCR mahsulotlarini tahlil qilish uchun (polimeraza zanjiri reaktsiyasi) kuchayganligini yoki yo'qligini tekshiradi.
- DNK yoki RNK aralashmasidagi molekulalarning hajmini taxmin qilish uchun.
- Tozalangan nuklein kislotalarning miqdori va / yoki sifatini baholash.

1.2.Gel elektroforezining subbirliklari

Gel elektroforez
DNK fragmentlari va boshqa makromolekulalarni oʻlchami va zaryadiga koʻra ajratishusuli.
Gel elektroforezi DNK fragmentlarini oʻlchamiga mos ravishda ajratish usuli hisoblanadi.
DNK namunalari gelning bir qismida joylashgan quduqlarga (chuqurchalarga) joylashtiriladi va ularni gel orqali harakatlantirish uchun elektr toki yuboriladi.
DNK fragmentlari manfiy zaryadga ega, shuning uchun ular musbat elektrod tomonga harakat qiladi. Chunki barcha DNK fragmentlari maʼlum massa birligida bir xil zaryadga ega, kichik fragmentlar gel boʻylab kattalariga nisbatan tezroq harakatlanadi.
Gel DNK bogʻlovchi boʻyoqlar bilan boʻyalganda, bir xil oʻlchamlarga ega boʻlgan DNK fragmentlari tasmalar shaklida koʻrinadi.
Gelelektroforezi
Gel elektroforezi DNK fragmentlari (yoki RNK va oqsil singari boshqa makromolekulalar)ni oʻlchami va zaryadi boʻyicha ajratish usuli hisoblanadi. Elektroforez kerakli molekulalarni oʻz ichiga olgan gel orqali zaryad oqimini oʻtkazishdan iborat. Molekulalar oʻz oʻlchamlariga mos ravishda gel orqali turli yoʻnalishda yoki turli tezlikda bir-biridan ajraladi. 
Barcha DNK molekulalari maʼlum massa birligida bir xil zaryada ega. Shuning uchun gel elektroforezi DNK fragmentlarini oʻlchamiga qarab ajratadi. Elektroforez yordamida namunada qancha turdagi DNK fragmentlari mavjudligini va ularning bir-biriga qanday bogʻliqligini bilib olishimiz mumkin. Shuningdek, DNK qismlarining oʻlchamini bilgan holda uning absolyut oʻlchamini standart “etalon” bilansolishtirishorqalianiqlashimimumkin.
Elektroforezda molekulalarning ajratilishi ularning zaryadiga (molekulalarni tortuvchi kuchga) va molekulaning oʻralgan yoki oʻralmaganligiga hamda uning boshqa molekulalar bilan bogʻlanganiga – qanday holatda boʻlishidan qatʼi nazar koʻndalangkesimigabogʻliq.
DNK fragmentlari toʻplami uzunligiga qarab ajraladi, chunki ularning hammasi bir turdagi molekula hisoblanadi. Umuman olganda, turli fragmentlar orasidagi sezilarli farqularninguzunligihisoblanadi.
Lekin bu qoidada ayrim istisnolar mavjud. Misol uchun, baʼzi DNK molekulalari (masalan, plazmid) halqasimon, boshqalari esa chiziqli tuzilishga ega. Halqasimon molekulalarning gel boʻylab harakati chiziqli molekulalar harakatidan farq qiladi. Masalan, plazmidlar “superspirallashgan” shaklda boʻladi, shu shaklda gel orqali oʻlchamiga mos ravishda tezroq harakat qiladi, chunki ular ancha oson harakatlanishni taʼminlaydigan ixcham shaklga ega.
Gel nima?
Nomidan koʻrinib turibdiki, gel elektroforezi geldan – jelesimon moddadan iborat. DNK boʻlaklarini ajratish uchun qoʻllanadigan gellar koʻpincha quruq, kukunsimon shakldagi agaroza deb nomlangan polisaxariddan tayyorlanadi. Agaroza bufer eritma (ozroq tuz saqlagan suv)da qizdirilsa va sovitilsa, u qattiq konsistensiyali, biroz shilimshiq gel hosil qiladi. Molekulyar darajada olganda, gel – bu vodorod bogʻlari bilan bogʻlangan va mayda poralarni hosil qilgan agaroza molekulalarining yigʻindisi.
Gelning bir qismida quduqlar deb nomlanadigan, DNK namunalari joylashtiriladigan choʻntaksimon chuqurchalar mavjud boʻladi:

DNK namunalari qoʻshilishidan oldin gel maxsus gel qutisiga joylashtiriladi. Bu qutining bir chekkasida musbat, ikkinchi chekkasida manfiy elektrod joylashtirilgan. Qutining asosiy qismiga elektr zaryadini oʻtkazadigan tuz saqlovchi bufer eritma solinadi. Garchi yuqoridagi rasmda buni koʻrishning iloji boʻlmasa ham, bufer eritma qutiga gelni qoplaydigan darajada quyiladi.

Gelning quduqlar mavjud qismida manfiy elektrodlar joylashtirilgan. Quduqlarsiz qismida (DNK fragmentlari harakatlanadigan tomon) musbat elektrodlar joylashtirilgan.
Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi va mass-spektrometriya texnologiyasi hozirgi vaqtda proteomikani o'rganishda eng ko'p qo'llaniladigan usul hisoblanadi. Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi turli xil oqsillarni ajratish uchun oqsil izoelektrik nuqtasi va molekulyar og'irlik farqidan foydalanadi. Kam miqdordagi oqsillarni ikki o'lchovli jel elektroforezi bilan ajratish qiyin bo'lsa ham, uning ishlashiga nisbatan yuqori talablar mavjud, ammo uning yuqori o'tkazuvchanligi, yaxshi piksellar sonini va takrorlanuvchanligi va mass-spektrometriya bilan birlashtirilish xususiyatlari uni eng mashhur va ishonchli qiladi Proteomikani o'rganish usullari. Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi va mass-spektrometriyaga asoslangan proteomikani o'rganish protseduralari namuna tayyorlash → izoelektrik fokuslash → poliakrilamid jel elektroforezi → jelni bo'yash → qiziquvchan oqsil joylarini qazib olish → jelda hazm qilish → pektidlarni aniqlash uchun mass-spektrometriya tahlili. Barmoq izi yoki qisman amino kislota ketma-ketligi → proteinni aniqlash uchun ma'lumotlar bazasidan foydalaning. Proteomik tadqiqotlar yuqori aniqlikdagi oqsillarni ajratishni va aniq va sezgir mass-spektrometriya identifikatsiyalash usullarini talab qiladi. Jel elektroforezidagi oqsillarning ranglanishi nafaqat oqsil ajratish rezolyutsiyasiga, balki keyingi mass-spektrometriya identifikatsiyasiga ham ta'sir qiladi. Oqsillarni bo'yashni to'rt toifaga ajratish mumkin: organik reagentni bo'yash, kumush rang bilan bo'yash, lyuminestsent rang berish va izotoplarni bo'yash.
Unlu va boshq. floresan differentsial displeyining ikki o'lchovli elektroforezi (F-2D-DIGE) miqdoriy proteomikasini tahlil qilish usulini taklif qildi. Differentsial gel elektroforezi (DIGE) - bu 2-DE ning texnik yaxshilanishi. U bir nechta flüoresan tahlil usulini birlashtiradi. U bir xil gelda turli xil lyuminestsentsiya bilan etiketlenmiş bir nechta namunalarni ajratadi va ichki asosiy tushunchani taqdim etadi. Ikki namunadagi oqsillar har xil lyuminestsent yorliqlar bilan aralashtirib, ikkita namunadagi oqsilning ifodasini aniqlash uchun 2-DE ni bajaradi, natijada natijalarning aniqligi, ishonchliligi va takrorlanuvchanligi ancha yaxshilanadi. DIGE texnologiyasida har bir oqsil dog'ining o'ziga xos ichki standarti mavjud va dasturiy ta'minot har bir oqsil joyining ichki standartiga muvofiq o'z ifodasini avtomatik ravishda kalibrlashi mumkin, aniqlangan oqsillarning ko'pligi o'zgarishi haqiqatdir. DIGE texnologiyasi turli xil namunalarda qo'llanilgan.
Kapillyar Elektroforez (CE) - elektr maydoni ta'sirida elektrodlarga ko'chib o'tishga asoslangan zaryadlangan molekulalarni (ionlarni) ajratish uchun tor kapillyardan foydalanadigan elektroforez texnikasining bir turi. Bu kichik molekulalar, DNK va oqsillarni tahlil qilish uchun yuqori aniqlikdagi va tezkor usul.
Idoralar ning ahamiyati, hatto murakkab aralashmalarni ham yuqori aniqlik va takrorlanuvchan ajratish qobiliyatidadir, bu uni biokimyo, farmatsevtika va sud tibbiyoti kabi turli sohalarda qimmatli vositaga aylantiradi.
Idoralar tarixi 1970-yillarning oxiri va 1980-yillarning boshlariga to'g'ri keladi, mikrofabrikasion texnologiyalarning rivojlanishi kichik ichki diametrli kapillyarlarni yaratishga yo'l ochdi. O'shandan beri Idoralar yaxshi tashkil etilgan analitik texnikaga aylandi va turli xil ilovalar uchun tobora ko'proq foydalanilmoqda.

II.BOB.GEL ELEKTROFOREZI YORDAMIDA DNKNI AJRATISH

2.1. Agaroz gellarda DNKning bo’yalishi
Gel elektroforezi DNK fragmentlarini oʻlchamiga mos ravishda ajratish usuli hisoblanadi.
DNK namunalari gelning bir qismida joylashgan quduqlarga (chuqurchalarga) joylashtiriladi va ularni gel orqali harakatlantirish uchun elektr toki yuboriladi.
DNK fragmentlari manfiy zaryadga ega, shuning uchun ular musbat elektrod tomonga harakat qiladi. Chunki barcha DNK fragmentlari maʼlum massa birligida bir xil zaryadga ega, kichik fragmentlar gel boʻylab kattalariga nisbatan tezroq harakatlanadi.
Gel DNK bogʻlovchi boʻyoqlar bilan boʻyalganda, bir xil oʻlchamlarga ega boʻlgan DNK fragmentlari tasmalar shaklida koʻrinadi.
Faraz qilaylik, PZR reaksiyasini oʻtkazib, kerakli genning koʻplab nusxalarini hosil qildik. Yoki DNKni klonlash orqali halqasimon plazmidga kerakli genni kiritdik.
Endi PZR toʻgʻri bajarilgani yoki plazmid kerakli genni qabul qilib olganini tekshirishimiz lozim. DNK fragmentlarini vizual (oddiy koʻz bilan koʻrish orqali) tahlil qilish uchun qaysi usulni qoʻllashimiz mumkin?
Gel elektroforezi
Gel elektroforezi DNK fragmentlari (yoki RNK va oqsil singari boshqa makromolekulalar)ni oʻlchami va zaryadi boʻyicha ajratish usuli hisoblanadi. Elektroforez kerakli molekulalarni oʻz ichiga olgan gel orqali zaryad oqimini oʻtkazishdan iborat. Molekulalar oʻz oʻlchamlariga mos ravishda gel orqali turli yoʻnalishda yoki turli tezlikda bir-biridan ajraladi. 
Barcha DNK molekulalari maʼlum massa birligida bir xil zaryada ega. Shuning uchun gel elektroforezi DNK fragmentlarini oʻlchamiga qarab ajratadi. Elektroforez yordamida namunada qancha turdagi DNK fragmentlari mavjudligini va ularning bir-biriga qanday bogʻliqligini bilib olishimiz mumkin. Shuningdek, DNK qismlarining oʻlchamini bilgan holda uning absolyut oʻlchamini standart “etalon” bilan solishtirish orqali aniqlashimiz mumkin
Nomidan koʻrinib turibdiki, gel elektroforezi geldan – jelesimon moddadan iborat. DNK boʻlaklarini ajratish uchun qoʻllanadigan gellar koʻpincha quruq, kukunsimon shakldagi agaroza deb nomlangan polisaxariddan tayyorlanadi. Agaroza bufer eritma (ozroq tuz saqlagan suv)da qizdirilsa va sovitilsa, u qattiq konsistensiyali, biroz shilimshiq gel hosil qiladi. Molekulyar darajada olganda, gel – bu vodorod bogʻlari bilan bogʻlangan va mayda poralarni hosil qilgan agaroza molekulalarining yigʻindisi.
Gelning bir qismida quduqlar deb nomlanadigan, DNK namunalari joylashtiriladigan choʻntaksimon chuqurchalar mavjud boʻladi:

DNK namunalari qoʻshilishidan oldin gel maxsus gel qutisiga joylashtiriladi. Bu qutining bir chekkasida musbat, ikkinchi chekkasida manfiy elektrod joylashtirilgan. Qutining asosiy qismiga elektr zaryadini oʻtkazadigan tuz saqlovchi bufer eritma solinadi. Garchi yuqoridagi rasmda buni koʻrishning iloji boʻlmasa ham, bufer eritma qutiga gelni qoplaydigan darajada quyiladi.
Gelning quduqlar mavjud qismida manfiy elektrodlar joylashtirilgan. Quduqlarsiz qismida (DNK fragmentlari harakatlanadigan tomon) musbat elektrodlar joylashtirilgan.
DNK fragmentlari gel boʻylab qanday harakatlanadi?
Gel qutiga joylashtirilgach, tekshirilishi kerak boʻlgan DNK namunalari (misol uchun, PZR reaksiyasi yoki restriksion parchalash natijasida olingan plazmid) ehtiyotkorlik bilan quduqlarning biriga joylashtiriladi. Bitta quduq esa DNK chizgʻichi – maʼlum uzunlikka ega boʻlgan standart namuna uchun ajratiladi. Sanoat miqyosida ishlab chiqariladigan DNK chizgʻichlari har xil oʻlchamda boʻladi, shuning uchun biz kerakli fragmentlarni oʻlchami orqali ajratib olishimiz mumkin.
Shundan soʻng kuchlanish ishga tushiriladi va gel qutisi orqali elektr toki oʻtkazish boshlanadi. DNK molekulalari fosfat guruhi tutganligi bois manfiy zaryadga ega, shu tufayli ular gel matriksi orqali musbat qutb tomon harakatlanadi. Kuchlanish ishga tushirilib, gel orqali zaryad oʻtishi boshlanganda, gel ishlayotgan holatda boʻladi. 

DNK namunalari gelning manfiy elektrod qismidagi quduqlarga joylashtiriladi.
Kuchlanish ishga tushiriladi va DNK fragmentlari gel boʻylab (musbat qutb tomon) harakatlanadi.
Gel ishga tushgach, fragmentlar oʻlchamlari boʻyicha ajrala boshlaydi. Eng katta fragmentlar gelning yuqori qismida (dastlabki qismidagi manfiy elektrod atrofida) boʻladi, eng kichkinalari esa pastki qismida (musbat elektrod atrofida) boʻladi.
Reeceʼdagi chizmaga asoslangan.22squared
Gel ishlayotganda, uzun fragmentlarga qaraganda qisqa DNK fragmentlari gel matritsasining poralaridan tezroq oʻtadi. Gel biroz vaqt ishlagandan soʻng, DNKning eng qisqa fragmentlari gelning musbat qutbiga yaqinlashadi, eng uzun DNK fragmentlari esa quduqlar yaqinida qolib ketadi. Agar gel uzoq vaqt ishlasa, DNKning juda qisqa fragmentlari gelning chekkasidan chiqib ketishi mumkin. (Bu mening aybim bilan koʻp sodir boʻlgan!)
DNK fragmentlarining vizual tahlili
Fragmentlar ajralgandan soʻng gelni tekshirib, unda qanday oʻlchamdagi tasmalar borligini aniqlash mumkin. Gel DNK bogʻlovchi boʻyoq bilan boʻyalib, UB nurlari ostiga qoʻyilsa, gelning turli qismlarda joylashgan DNK fragmentlari yaltirab koʻrinadi.

Chizgʻichdagi har bir raqam yonidagi aj DNK fragmentida qancha asos jufti mavjudligini koʻrsatadi.
DNKning geldagi koʻzga eng yaxshi tashlanadigan “chiziqlari” tasma deb nomlanadi. Har bir tasma gelning shu qismida joylashgan bir xil oʻlchamli DNK fragmentlarini oʻz ichiga oladi. Bitta DNK fragmenti (hatto DNK fragmentlarining kichik guruhi) yolgʻiz oʻzi koʻzga koʻrinmaydi.
Namunadagi tasmalarni DNK chizgʻichi bilan solishtirib, ularning taxminiy oʻlchamlarini aniqlashimiz mumkin. Misol uchun, yuqorida tasvirlangan geldagi yorqin tasma taxminan 700700700 asos juft (aj) oʻlchamiga ega.
Erkin elektroforez Tizelius tomonidan ishlab chiqarilgan bo’lib, bufer bilan to’ldirilgan V —simon elnektroforetik asbobda olib boriladi. Bu idishning bir uchiga «+», ikkinchi uchiga « —» zaryadlangan elektrod tushiriladi. Elektr toki yuborilganda eritmadagi oqsil molekulalari zaryadlariga ko’ra siljiydi. Hozirgi kunda erkin elektroforez deyarli qo’llanilmaydi, chunki unga nisbatan bir qator ijobiy xususiyatga ega bo’lgan, takomillashgan usullar kashf etildi. Shulardan biri zonali elektroforez bo’lib, bunda elektroforez qattiq muhitda olib boriladi. Qattiq muhit sifatida PAT, kraxmal, agar va filtr qog’ozidan foydalanish mumkin.
Zonali elektroforez erkin elektroforezdan quyidagi jihatlari bilan farqlanadi:
Zonali elektroforezni bajarish oson.
Kam miqdorda oqsil talab etiladi, masalan: qog’ozdagi elektroforez uchun 0,5 —0,8 mg, PAT elektroforez uchun 100 — 200 mkg oqsil kerak bo’ladi.
]Elektroforez jarayonida hosil bo’lgan oqsil fraksiyalarini tashuvchi muhitda bo’yab (ajratilgan oqsilni) aniq ko’rish mumkin.
Tashuvchi muhit yoki bufer eritmani o’zgartirish yo’li bilan oqsil aralashmasini fraksiyalarga ajratish mumkin, M: qon zardobining qog’ozdagi elektroforezida borat buferini (pH —8,9) qo’llab 5 fraksiya (albumin, alfa — 1, alfa —2, beta, alfa — globulin) olinsa, tris — EDTA buferini (pH —8,9) qo’llash orqali 9 ta fraksiya olish mumkin.
Zonali elektroforezda oqsillarni fraksiyalarga ajralishi tez boradi (ba’zi uslub bo’yash bilan birgalikda 1 —2 soatda bo’ladi).
6 . Zonali elektroforez asbobi sodda tuzilgan va erkin elektroforez asbobiga nisbatan arzonga tushadi.
7. Tashuvchi muhitning o’zida ajratilgan oqsil fraksiyalariga substrat ta’sir ettirib fermentlaraktivliginianiqlashmumkin.
Shu bilan birga elektroforezning bir qator kamchiliklari ham mavjud.
Oqsillarning siljish tezligini to’g’ridan — to’g’ri aniqlab bo’lmaydi.Aniqlanayotgan oqsil va tashuvchi muhit o’rtasida salbiy bog’lanish vujudga kelishi mumkin. Bunda oqsil tashuvchiga adsorbsiyalanib qolishi kuzatiladi. Qog’ozdagi elektroforezda adsorbsiyalanish kuchliroq bo’lib PAT da bu hodisa deyarli kuzatilmaydi.

2.2.DNK bo’laklarini vizualizatsiya qilish

Zonali elektroforezning turlari. Qog’ozdagi elektroforez. Qog’ozdagi elektroforez keng tarqalgan usul bo’lib u maxsus filtr qog’ozda olib boriladi. Bu qog’oz yuqori gigroskopik bo’lishi, suvni shimishi natijasida uning og’irligi quruqligidagi og’irligiga nisbatan 180 — 200 marotaba oshishi shart. Elektroforez o’tkaziladigan asbobning turiga ko’ra elektroforez 4 soatdan 16 soatgacha davom etadi. Elektroforez qog’oz bo’yaladi va oqsilning ajralgan fraksiyalari aniq ko’riladi. Bo’yalgan filtr qog’ozni saqlab qo’yish mumkin. Agar ajratilgan oqsil miqdorini aniqlash lozim bo’lsa kerakli fraksiya qirqib olinib oqsil eritmaga o’tkaziladi .
Elektroforez asbobidan foydalanish bo’yicha namuna
Kraxmal gelidagi elektroforez. Ayrim uslubiy qiyinchiliklar bu elektroforezning keng tarqalishiga monelik qildi. Bunga sabab kraxmal gelini tayyorlash, uni gidroliz qilish ancha murakkab jarayon ekanligidadir. Lekin shunga qaramay kraxmal geli oqsilni ajratishda keng qo’llaniladi, chunki bu uslubga ko’ra oqsillar faqat zaryadlanish darajasiga ko’ragina emas, balki molekulyar og’irligiga ko’ra ham ajratiladi. Bu esa fraksiyalar sonini ko’paytiradi. M: qon zardobi oqsilidan ushbu uslub bo’yicha 8 - 1 0 ta fraksiya olish mumkin. Kraxmal gelidagi elektroforez oqsil gomogenligini bilishda aniq uslub hisoblanadi.
Agar gelidagi elektroforez. Zonali elektroforezni olib borishda agar geli tashuvchi muhit hisoblanadi. 1 — 1,5% li agar gelida oqsil erkin elektroforezdagi kabi harkatlanadi. Agar gelidagi elektroforezda qog’ozdagi elektroforezga nisbatan oqsillar tez fraksiyalarga uchraydi. Agar qatlamining tiniqligi oqsil fraksiyalarini yaxshi bo’yashni va fotometrik uslub aniqlashni osonlashtiradi. Shu bilan birga bunday sharoitda oqsil fraksiyalari «dum» hosil qilmaydi. Ajraladi. Lekin agar gelini tayyorlashning murakkabligi uning keng qo’llanishini chegaralaydi. Agar tarkibida agaropektinning bo’lishi gelning sifatiga salbiy ta’sir qiluvchi faktorlardan hisoblanadi, chunki nordon agaropektin lipoproteidlari va kuchli ishqor oqsillar bilan kompleks hosil qilish xususiyatiga ega. Agar manfiy zaryadlanganligi sababli bufer kationlari va suv molekulasi anodga siljiydi. Elektroforezda bu oqim oqsil fraksiyalarini ham o’zi bilan birga siljishiga sabab bo’lishi mumkin. Bu hodisani tekshiriladigan oqsil aralashmasini gelli plastinkaning o’rtasiga tomizish yo’li bilan bartaraf etish mumkin. Bunday holat agarozada, atsetat — sellyuloza membranasidagi, filtr qog’ozdagi eektroforezlarda kuzatilmaydi.
Atsetat-sellyuloza membranasidagi elektroforez. Atsetat — sellyuloza membranasi juda yaxshi tashuvchi muhit bo’lib, bir qator ijobiy xususiyatlarga ega. Kraxmal va agar gellarini tayyorlash murakkab va ko’p vaqt talab etiladigan jarayon bo’lib, atsetat — sellyuloza membranasiga ishlov berish filtr qog’ozniki singari oson. Undan farqli o’laroq bu elektroforezda oqsil tez va yaxshi ajraladi. Bu elektroforezda faqat oddiy oqsillargina emas, balki glikoproteinlar ham yaxshi bo’yaladi, shunga ko’ra ularni miqdoriy jihatdan ham aniqlash mumkin. Atsetat— sellyuloza membranasidagi elektroforez yordamida qog’ozdagi elektroforezga nisbatan ko’proq, kraxmal gelidagiga nisbatan esa kamroq fraksiya olinadi. Ushbu elektroforez yordamida juda oz miqdordagi (0,1 — 10 mkl distillangan suvda eritilgan 5 – 1000 mkg) oqsillar aralashmasini fraksiyalarga ajratish mumkin, shunga ko’ra atsetat —sellyuloza membranasidagi elektroforez ajratib olingan oqsilning gomogenligini aniqlashda qo’l keladi.
Gel elektroforez - bu DNK qismlarini (yoki RNK va oqsillar kabi boshqa makromolekulalar) hajmi va zaryadiga qarab ajratish uchun ishlatiladigan usul. Elektroforez, qiziqish molekulalarini o'z ichiga olgan GEL orqali oqim o'tkazishni o'z ichiga oladi. Hajmi va zaryadiga qarab, molekulalar GEL bo'ylab turli yo'nalishlarda yoki turli tezlikda harakatlanib, ularni bir-biridan ajratishga imkon beradi.
Barcha DNK molekulalari massa birligi uchun bir xil zaryadga ega. Shu sababli DNK fragmentlarining gel elektroforezi ularni faqat hajmi bo'yicha ajratadi. Elektroforez yordamida biz namunada qancha turli DNK fragmentlari mavjudligini va ularning bir-biriga nisbatan qanchalik katta ekanligini ko'rishimiz mumkin. DNK fragmentining mutlaq hajmini ma’lum o‘lchamdagi DNK bo‘laklaridan tashkil topgan standart “mezon” yonida tekshirib ham aniqlashimiz mumkin.
Nomidan ko'rinib turibdiki gel elektroforezi GELni o'z ichiga oladi: gelga o'xshash material varag'i. DNKni ajratish gellari ko'pincha agaroza deb ataladigan polisakkariddan tayyorlanadi, bu quruq, chang bo'lakdir. Agaroza buferda (ba'zi tuzlari bo'lgan suv) qizdirilsa va sovushini kutib tursa, u qattiq, ozgina yopishqoq gel hosil qiladi. Molekulyar darajada gel vodorod aloqalari bilan birlashtirilgan va mayda teshiklarni hosil qiluvchi agaroz molekulalarining matritsasidir.
Nomidan ko'rinib turibdiki, gel elektroforezi GELni o'z ichiga oladi: gelga o'xshash material varag'i. DNKni ajratish gellari ko'pincha agaroza deb ataladigan polisakkariddan tayyorlanadi, bu quruq, chang bo'lakdir. Agaroza buferda (ba'zi tuzlari bo'lgan suv) qizdirilsa va sovushini kutib tursa, u qattiq, ozgina yopishqoq gel hosil qiladi. Molekulyar darajada gel vodorod aloqalari bilan birlashtirilgan va mayda teshiklarni hosil qiluvchi agaroz molekulalarining matritsasidir.
Gelning bir uchida DNK namunalari joylashtiriladigan quduqlar deb ataladigan cho'ntagiga o'xshash chuqurliklar mavjud:
DNK namunalarini qo'shishdan oldin, GEL GEL qutisiga joylashtirilishi kerak. Qutining bir uchi musbat elektrodga, ikkinchi uchi esa salbiy elektrodga ulanadi. GEL qo'yilgan qutining asosiy qismi oqim o'tkazishga qodir sho'r tampon eritmasi bilan to'ldiriladi. Yuqoridagi rasmda buni ko'rmasangiz ham (mening ajoyib badiiy mahoratim tufayli), bufer GEL qutisini GELni zo'rg'a qoplaydigan nuqtaga to'ldiradi.
DNK namunalarini qo'shishdan oldin, GEL GEL qutisiga joylashtirilishi kerak. Qutining bir uchi musbat elektrodga, ikkinchi uchi esa salbiy elektrodga ulanadi. GEL qo'yilgan qutining asosiy qismi oqim o'tkazishga qodir sho'r tampon eritmasi bilan to'ldiriladi. Yuqoridagi rasmda buni ko'rmasangiz ham (mening ajoyib badiiy mahoratim tufayli), bufer GEL qutisini GELni zo'rg'a qoplaydigan nuqtaga to'ldiradi.
Quduqlar bilan gelning oxiri salbiy elektrodga yo'naltiriladi. Quduqsiz uchi (DNK parchalari ko'chib o'tadi) musbat elektrod yo'nalishida joylashgan.
gel harakatlanayotganda, DNKning qisqa bo'laklari uzunroq bo'lganlarga qaraganda gel matritsasining teshiklaridan tezroq o'tadi. GEL biroz vaqt ishlagandan so'ng, eng qisqa DNK bo'laklari GELning ijobiy uchiga yaqinroq bo'ladi va eng uzun DNK bo'laklari quduqlar yonida qoladi. DNKning juda qisqa bo'laklari, agar biz uni juda uzoq vaqt qoldirsak, GELning uchini sindirib tashlashi mumkin (bu, albatta, mening aybim!).
gel harakatlanayotganda, DNKning qisqa bo'laklari uzunroq bo'lganlarga qaraganda gel matritsasining teshiklaridan tezroq o'tadi. GEL biroz vaqt ishlagandan so'ng, eng qisqa DNK bo'laklari GELning ijobiy uchiga yaqinroq bo'ladi va eng uzun DNK bo'laklari quduqlar yonida qoladi. DNKning juda qisqa bo'laklari, agar biz uni juda uzoq vaqt qoldirsak, GELning uchini sindirib tashlashi mumkin (bu, albatta, mening aybim!).
DNK bo'laklarini vizualizatsiya qilish
Parchalar ajratilgandan so'ng, biz GELni ko'rib chiqamiz va unda qanday o'lchamdagi bantlar mavjudligini ko'rishimiz mumkin. GEL DNKni bog'laydigan bo'yoq bilan bo'yalgan va ultrabinafsha nurlar ostida qo'yilganda, DNK bo'laklari porlashni boshlaydi, bu bizga GEL uzunligi bo'ylab turli joylarda DNK mavjudligini ko'rish imkonini beradi.
GELdagi DNKning aniq belgilangan "chizig'i" band deb ataladi. Har bir bo'lakda bir xil o'lchamdagi ko'p sonli DNK bo'laklari mavjud bo'lib, ular guruh sifatida bir xil pozitsiyaga o'tgan. Bitta DNK bo'lagi (yoki hatto kichik DNK bo'laklari guruhi) GELda o'z-o'zidan ko'rinmaydi.
GELdagi DNKning aniq belgilangan "chizig'i" band deb ataladi. Har bir bo'lakda bir xil o'lchamdagi ko'p sonli DNK bo'laklari mavjud bo'lib, ular guruh sifatida bir xil pozitsiyaga o'tgan. Bitta DNK bo'lagi (yoki hatto kichik DNK bo'laklari guruhi) GELda o'z-o'zidan ko'rinmaydi.
Namunadagi bantlarni DNK zinapoyasi bilan taqqoslab, ularning taxminiy o'lchamlarini aniqlashimiz mumkin. Misol uchun, yuqoridagi GELdagi yorqin tasma taxminan 700700700 tayanch juftlik (bp) hajmida.
Biologik makromolekulalarni vizualizasiyalashtirishning zamonaviy usullari
Fаzоviy struqturаni vizuаlizаtsiyalаshning аsоsiy printsiplаri. RasMol dаsturi vа undа ishlаsh tаrtibi. Biоlоgiq mаkrоmоlеkulаlаrning birlаmchi strukturаsi аsоsidа ulаrni vizuаlizаtsiyalаshtirish. PyMol vа I , TASSER dаsturlаridа ishlаsh. Yarаtilgаn strukturаlаrni PDB, MMDB mа’lumоtlаr bаzаlаrigа jоylаshtirish.
Bioinformatsion dasturlar, ketma –ketlik tahlillarini samarali yoritishga asos bo’lmoqda, biroq yuqori strukturalarni to‘liq taxlil etish uchun hali ko‘p yillar davomida ish olib borishga to‘g‘ri keladi. Ketma –ketliklarni to‘g‘ri joylashtirish muammosi –zamonaviy molekulyar biologiyaning asosiy mavzusi hisoblanadi. Ushbu yo’nalishninig paydo bo’lishi dastlab aminokislotalarning chiziqli ketma–ketligi qanday qilib oqsilning uchlamchi strukturasini belgilashi haqidagi tadqiqotlarda aks eta boshladi. 1961 yilda ribonukleazaning to‘liq denaturatsiyaga uchraganligi va fermentativ faolligi va dastlabki strukturasining to‘liq qayta tiklanganligi namoyish etilgan. Shundan so‘ng birlamchi struktura uchlamchi strukturani belgilaydi degan xulosaga kelingan. Dastlab oqsil molekulalarning joylashishini belgilovchi qonuniyatlar belgilangan. 1998 yilda ikkilamchi strukturani belgilovchi usul 50-60% ishonchlilik darajasiga ega bo‘lgan. Biologik makromolekulalarning birlamchi strukturasi asosida ularning fazoviy strukturalarini aniqlash, ularning to‘g‘ri taxlanish qonuniyatlarini tushunish uchun RasMol, PyMol, Modeller kabi bir qancha bioinformasion dasturlar mavjud. Ular yordamida ketma-ketligi aniqlangan makromolekulalarni vizualizasiyalashtirish mumkin. Ikkilamchi strukturani aytib berish uchun uchta asosiy yo‘nalish mavjud:
1. Shu kungacha ma'lum bo‘lgan uchlamchi strukturalardan olingan parametrlarni qo‘llovchi emperik statistik yondashuvlar.
2. Vodorod bog‘lar potensiali, zaryad, gidrofoblik, brikkanlik darajasi kabi fizik –kimyoviy xususiyatlarga asoslangan usullar.
3. Ikkilamchi strukturani taxmin qilish uchun gomologik oqsillarning ma'lum bo‘lgan strukturalaridan foydalanuvchi, bashorat qiluvchi algoritmlar.
Eng yaxshi usullardan biri standart emperik usuldir. Emperik tasvirlar yaratish uchun gomologik bo‘lmagan oqsillardagi mumkin bo‘lgan konformasiyalardan foydalaniladi. Lekin, uning ham ishonchlilik darajasi u qadar yuqori emas -65%. Bu konformatsion potensiallarni baholash uchun qo‘llaniluvchi ma'lumot bazalari adekvatlik darajasining kichikligi bilan belgilanadi.
Molekulyar modellashtirish –molekulalar strukturasi va uning hususiyatlari haqidagi ma'lumotlarga tayangan holda uning molekulasini vizuallashtirish jarayonidir. Buning natijasida molekulaning fazoviy strukturasini namoyon etuvchi uchlamchi strukturalar shakllanadi. Molekulyar modellashtirish usullari kompyuterli kimyo, hisoblash biologiyasi va molekulyar sistemalardagi bog‘lanishlarning tiplarini individual ko‘rinishda tasvirlash uchun qo‘llaniladi.
Oddiy tizimlarni molekulyar modellashtirish jarayonida hisoblash ishlari qo‘lda bajarilishi mumkin. Lekin, murakkab tizimlarni molekulyar modellashtirish jarayonida ayniqsa, molekulyar dinamikasini tadqiq etish jarayonida hisoblash va vizuallashtirishning kompyuterli usullaridan foydalaniladi. Bunday usul kompyuterli molekulyar modellashtirish deb nomlanadi ( inglizchada Computer Assisted Molecular Modeling-CAMM). Molekulyar modellashtirishning asosiy belgisi bu sistemalarni kichik qismlar asosida, atomlar yoki katta o‘lchamga ega bo‘lmagan atomlar guruhi hisoblanadi. Aynan shu hususiyati bilan molekulyar modellashtirish, elektronlar ham hisobga olinadigan kvant kimyosidan farqlanadi.
Molekulyar mexanika –molekulyar modellashtirishning bir usuli boo‘lib, modelning fizik asoslarini ochib berish uchun klasik mexanika qonunlaridan foydalaniladi. Atomlar mos ravishdagi zaryadlar bilan ifodalanadi. Qo‘shni atomlar orasidagi bog‘lanishlar molekulaga hos kimyoviy bog‘lar vositasida mustahkam bo‘ladi va Van-der-Vals kuchlari yordamida bu bog‘lar yanada mustahkamlanadi. Elektrostatik bog‘lanishlar Kulon qonuni asosida tushuntiriladi. Fazodagi atomlarga Dekart yoki ichki kordinatalari biriktiriladi: dinamik hisoblashlarda tezlik va mos keluvchi harorat kiritilishi mumkin. Molekulyar dinamik hisoblashlar boshqa tomondan sistemaning vaqtga nisbatan funksiya ko‘rinishida namoyon bo’ladi. Minimallashtirish va molekulyar dinamika uchun Nyutonning ikkinchi qonuni qo‘llaniladi. Harakatning bu qonunini turli algoritmlar vositasida integrallanishi atomlarning fazodagi va vaqt birligi ichidagi treaktoriyasining olinishiga olib keladi. Atomga ta'sir etuvchi kuch potensial energiyaning manfiy hosilali funksiyasi singari aniqlanadi.
Molekulalarni modellashtirish uchun tasvirlarni tasavvur qilishda ikkita maydon moduli mavjud. Bular vakum maydonida va erituvchi fazasidagi hisoblashlar natijasida o’rganiladi. Masalan vakumdagi sistemalarning qiymatlari „gaz faza“dagi hisoblashlar, shuningdek erituvchi molekulani o‘z ichiga oluvchi qiymatlarni „aniq berilgan erituvchi“ qiymatlari deb atalishi mumkin. Hisoblashlarning boshqa guruhi erituvchining mavjudligini aniq bo‘lmagan erituvchi bilan qiymatlar deb ataluvchi potensial funksiyaning qo‘shimcha a'zolari bilan hisobga olgan holda amalga oshiriladi.
Hozirgi kunda molekulyar modellashtirish metodlari noorganik, biologik va polimer sistemalarning termodinamikasi, dinamikasi va strukturalarini o‘rganishda qo‘l kelmoqda. Biologik nuqtai nazardan oqsillarning barqarorligi, konformatsion o‘zgarishlari va oqsillar hamda DNKni membranalardagi molekulalarni tanish muammolari molekulyar modellashtirish usullari asosida o‘rganiladi.
11.PyMol va I-TASSER dasturlarida ishlash. Yaratilgan strukturalarni PDB, MMDB ma'lumotlar bazalariga joylashtirish.
RasMol - kompyuterli programmasi haqida.
RasMol - komp'yuterli programma bo‘lib, molekulalarning vizualizasiyasi uchun va biologik makromolekularni fazoviy strukturasining tuzilishini hamda ularni turli ko‘rinishlarini o’rganish uchun qo‘llaniladi. Asosan oqsil va nuklein kislotalar strukturalarini vizualizasiyasida foydalaniladi. RasMol programmasi birinchi bo‘lib 1992-yildа Rоjеr Sаylе tоmоnidаn yarаtilgаn mоlеkulаlаrni vizuаllаshtirishning muhim ilmiy vоsitаsi hisоblаnаdi. RasMol bioinformatika va molekulyar biologiyada keng ko’lamda qo‘llaniladigan molekulalarning vizualizasiyalovchi eng yaxshi o‘quv dasturi sanaladi.
«RasMol» so‘zi – ingl. “molekulalar rastri” so‘zining qisqartmasi bo‘lib, “rastr” so‘zi odatda komp'yuter ekranidagi piksellar matrisasini bildiradi. Molekulyar grafikaning bu dasturi, oqsillar, nuklein kislotalar va uchlamchi strukturasi ma'lum bo‘lgan kichik molekulalarni vizualizasiyalashtirishga mo‘ljallangan. Molekulani namoyish etish uchun “RasMol”ga atomlarning molekuladagi fazoviy dekart kordinatalari asosida joylanishini aks ettiruvchi atom kordinatalari kerak bo‘ladi. “RasMol” kordinatalarning turli xil formatlarini aks ettiradi, xususan, “PDB” formatida ham. Dasturning asosiy oynasining adresi quyida berilgan.
www.umass.edu/microbio/rasmol
«Chime» va «Protein explorer» dasturlari – «RasMol» ning hosilalari bo‘lib, molekulalarni dastur oynasida vizualizasiyalashtirish imkonini beradi.
«Molmol» atamasi inglizcha – Molecule analysis and Molecule display - molekulalar tahlili va namoyishini bildiradi. Bu dasturlar bilan faqatgina tarmoqqa ulangan holdagina ishlash mumkin. «Molmol» - asosan YaMR – spektrometriya metodi yordamida aniqlangan oqsillar va nuklein kislotalarning uchlamchi strukturalarini analiz qilish va o‘zgartirish imkonini beradi. Rаsmоlning yarаtilish tаriхi.
Rаsmоl mоlеkulyar grаfik tаsvirlаr uchun mo’ljаllаngаn kоmpyutеr dаsturi vа аsоsаn biоlоgik mаkrоmоlеkulа tuzilmаlаrni tаsvirlаsh uchun ishlаtilаdi. Rаsmоl sayti vа Rаsmоl оchiq mаnbа vеrsiyalаri ishlаb chiqaruvchilаr uchun qulаylik yaratish maqsadida tаqdim еtilgan. Rаsmоlni rivоjlаntirish takomollashtirib borish ko’plаb tadqiqotlar yordamida intеgrаtsiyalash va o’zgаrtirishlаr orqali taminlab kelinmoqda. Source Forge tоmоnidаn yarаtilgаn sаyt оrqаli ham hozirda bu saytdan foydalanish imkoniyatlari mavjud. Rаsmоl ustidа ishlаsh uchun rаsmаn АQSh enеrgеtikа dеpаrtаmеnti, АQSh Milliy Fаnlаr jаmg’аrmаsi vа АQSh (NIH) Milliy tibbiyot fаnlаri instituti grаntlаri tоmоnidаn qo’llаb quvvаtlаndi. Ushbu mаtеriаldа bildirilgаn hаr qаndаy fikr mulohazalar vа хulоsаlаr yoki tаvsiyalаr muаllifi mоliyalаshtiruvchi tashkilotlarning etiboridan chetda qolmaydi.
Mаnbа kоdi vа hujjаtlаr mаvjudligini tа’minlаsh mаqsаdidа ushbu sаyt dаsturlаri vа hujjаtlаr muаlliflik huquqigа ega. Dasturning оchiq kоdli vеrsiyalаri fоydаlаnuvchilarga nusха vа o’zgаrtirishlаr kiritishgа to’sqinlik qilmаydi, bаlki оchiq kоdli vеrsiyalаrdаn "yopiq mаnbа" vеrsiyalаrini yarаtishgа to’sqinlik qilаdi. Tеgishli muаlliflik huquqi vа litsеnziyalаr mаnbаlаr asosida shakllantiriladi.
2.3.DNK bo’laklarini ajratishda gel elektroforezining ahamiyati
Gel elektroforezi usuli DNK fragmentini toʻgʻridan toʻgʻri koʻrish imkonini beradi. Tadqiqotchilar geldagi DNK fragmentlarini aniqlab, PZR reaksiyasining natijalarini tahlil qila oladilar. Gel elektroforezi DNK fragmentlarini ularning oʻlchami asosida ajratadi. Fragmentlar boʻyoqlar bilan boʻyaladi va tadqiqotchilar ularnikoʻraolishadi.
DNK fragmentlari gel ichida manfiy elektroddan musbat elektrod tomon harakatlanadi.
Gelda harakatlangandan soʻng, fragmentlar oʻlchami boʻyicha ajralib qoladi. Kichikroqlari ostki tomonda (musbat elektrod), kattalari esa yuqori tomonda (manfiyelektrod)joylashadi.

DNKni oʻqish. DNKni oʻqish bu DNK molekulasidagi nukleotid asoslari (A, T, S va G)ning ketma-ketligini aniqlash hisoblanadi. Baʼzi hollarda kichik bir DNK boʻlagi oʻqilsa, boshqa hollarda katta DNK fragmentlarining kolleksiyasi (masalan, butun boshli genom) guruh holida oʻqilishi mumkin. 

Agaroz geli mikrobiologiya yoki molekulyar biologiya laboratoriyasida gel elektroforezini o'tkazish uchun ishlatiladi. Shunisi e'tiborga loyiqki, jel elektroforezi uchun ishlatiladigan agar kukuni mikrobial etishtirish uchun odatiy madaniyat muhiti plitalarini tayyorlash uchun ishlatiladigan kukunli agardan farq qiladi. Jel elektroforezida, agarozgel jelni tayyorlash uchun kukun ishlatiladi. Agaroz jeli agaroz kukunining ma'lum miqdorini (masalan, 1,5%) bufer eritmasida yoki deionizatsiyalangan suvda aralashtirish orqali tayyorlanadi. Agaroz jeli agarozaning 0,6% – 3% gacha bo'lgan turli konsentratsiyalari bilan tayyorlanishi mumkin va bu odatda tadqiqotchi hal qilmoqchi yoki ajratmoqchi bo'lgan nuklein kislotasi bo'laklarining hajmiga bog'liq. Nuklein kislotalarning katta bo'laklari agaroza foizi kamroq bo'lgan jelda yaxshiroq ajratiladi yoki eriydi, kichikroq nuklein kislota fragmentlari esa yuqori foizli agaroza bo'lgan jelda yaxshiroq ajratiladi. Masalan, 1,5% agaroz jelini tayyorlash uchun 1,5 g agaroz kukunini o'lchab oling va uni 100 ml bufer yoki deionlangan suvda konussimon kolbada eritib yuboring. Barcha bo'laklarni parchalash uchun aralashmani yaxshilab aralashtiring va eritma suv kabi tiniq bo'lguncha mikroto'lqinli pechda ma'lum bir haroratda (masalan, 1-2 daqiqa) qaynatib qizdiring. Mikroto'lqinli pech mavjud bo'lmagan joylarda agaroz eritmasini isitish uchun Bunsen burner alangasi ham bo'lishi mumkin. Agaroz jeli eritmasi bir hil eritma hosil bo'lguncha qizdirilishi kerak. Isitgandan so'ng, jelni quyish apparati yoki plitaga quyishdan oldin gomogenat jeli taxminan 60 o C ga qadar sovishini kutish kerak. Agaroza, oq kukun va bufer eritmasi agaroz jelining ikkita asosiy komponenti bo'lib, jel elektroforez texnikasini ishlatish uchun zarur bo'lgan jelni hosil qilish uchun ikkalasi ham etarli darajada qizdirilishi kerak.
tishli taroq (1-rasm) agaroz jelida namuna quduqlari deb nomlanuvchi quduqlarni hosil qilish uchun ishlatiladi. Shunday qilib, tishli taroq jelni quyishdan oldin jel quyish moslamasiga yoki patnisga joylashtirilishi kerak, shunda quduqlar mos ravishda hosil bo'ladi. DNK namunalarini quduqlarga kiritishdan oldin tishli taroq chiqariladi. Shakllangan quduqlar yoki teshiklar soni odatda tahlil qilinadigan namunalar yoki organizmlar soniga bog'liq va shuning uchun agaroz jeli tajribasida ishlatiladigan tishli taroq turi o'zgaradi. Jel elektroforezini tahlil qilish uchun namunalar mikropipet yordamida tishli quduqlarning har biriga alohida emlanadi yoki quyiladi (2-rasm). Bir nechta pipetka uchlari (3-rasm) molekulyar biologiya tajribalarida bir nechta tahlillar uchun ham mavjud.
Sovutilgan gomogen eritmani jel quyish moslamasiga yoki patnisga (4-rasm). To'kish asta-sekin bajarilishi kerak va quyish paytida hosil bo'lgan barcha havo pufakchalari bir martalik pipetka yordamida olib tashlanishi kerak. Havo pufakchalari, agar taroq atrofida joylashishi mumkin bo'lsa, odatda quduqlarning shakliga ta'sir qilishi mumkin.
1 -rasm. Agaroz jelida namunali quduqlarni tayyorlash uchun ishlatiladigan turli o'lchamdagi tishli taroqlar tasviri. Tishli taroqlar turli o'lchamlarda mavjud va ishlatiladigan tur asosan tadqiqotchi ishlatmoqchi bo'lgan namunalar soniga bog'liq. Tishli taroq jel elektroforezida muhim ahamiyatga ega, chunki u odatda agaroz jelida quduqlar deb ataladigan bo'shliqlarni hosil qiladi va aynan shu quduqlarda nuklein kislotasi namunalari pipetlanadi. Shunisi e'tiborga loyiqki, tishli taroq elektroforetik gel kamerasiga eritilgan agaroz jeli quyilishidan oldin kiritiladi va jelga ruxsat beriladi. 2-rasm. Bir uchli mikropipetalar. 3-rasm. Bir nechta uchli mikropipetka pipetka uchlari uchun uchli idish bilan. 4 -rasm. Jel quyish apparati. Agaroz gel plitasi gel quyish apparati yoki patnisda hosil bo'ladi, so'ngra keyingi tahlil qilish uchun elektroforez idishiga o'tkaziladi. Jelni quyishdan oldin, jel quyish moslamasi yoki patnisning gorizontal yuzaga qo'yilganligini ta'minlash juda muhim, shunda hosil bo'lgan jel bir xil bo'ladi. Jel quyish apparatiga eritilgan agaroz jelini quyishdan oldin tishli taroqni kiritish kerak.
To'kilgan jel jel quyish moslamasida bir necha daqiqaga (masalan, 20 daqiqa) ruxsat etiladi, shunda u o'rnatiladi yoki jel hosil bo'ladi. agaroz jel plitasi. Jel quyish apparati quyilgan jelga agaroz gel elektroforez texnikasi uchun zarur bo'lgan xarakterli gorizontal shaklni beradi. Sovutgandan va jellanganidan so'ng, jel endi agaroz jel elektroforezi tajribasiga tayyor. Keyin u elektroforetik matritsaga yoki buferlangan eritma qo'shiladigan kameraga kiritiladi. Amalda, agaroz jel plitasi elektroforetik idishdagi buferlangan eritmaga botiriladi.
Alohida namunalarni agaroz jelida taroq yordamida hosil qilingan namuna quduqlariga pipetka bilan soling (5-rasm). Pipetka uchi pipetlanadigan har bir namuna uchun almashtirilganligiga ishonch hosil qiling. Quduqlardan biriga (odatda birinchi quduq) DNK bo'lagi yoki narvon (ma'lum yoki standart o'lchamli) qo'shiladi va narvon ajratilgan DNK bo'laklarini (noma'lum o'lchamli) solishtirish uchun ishlatiladi. Ba'zi agaroz jeli tajribalarida tahlil qilinadigan DNK eritmasi bilan birga etidiy bromid (EtBr) eritmasi qo'shiladi. Biroq, EtBr odatda sovutilgandan so'ng va gel elektroforez idishiga quyishdan oldin tayyorlangan jelga qo'shiladi.
EtBr kimyoviy bo'yash vositasi sifatida ishlaydi, bu elektroforez tajribasidan so'ng DNK bantlari yoki parchalarini ko'rishga yordam beradi. (EtBr - bu DNK bilan bog'laydigan va alohida DNK bo'laklarining o'rnini aniq belgilovchi bo'yoq). Ba'zi agaroz jeli tajribalarida elektroforezlangan DNK eritmasi bilan birga binoni bo'yoqlari (bu holda EtBr) qo'shilmaydi. Ammo u elektroforez tahlilidan oldin yoki keyin qo'shiladi, chunki uning asosiy vazifasi DNK parchalarini vizualizatsiya qilishga yordam berishdir. Eslatma: EtBr mutagen yoki kanserogen xususiyatga ega, shuning uchun uni ehtiyotkorlik bilan ishlatish kerak. SYBR yashil, nuklein kislotasi jeli bo'yog'i ajratilgan nuklein kislota bo'laklarini ko'rish uchun jel elektroforez texnikasida ishlatilishi mumkin bo'lgan yana bir bo'yash vositasidir. Biroq, EtBr eritmasi gel elektroforez tajribalarida eng ko'p qo'llaniladigan bo'yoq hisoblanadi va tadqiqotchi EtBr bilan ishlaganda qo'lqop kiyishi juda muhim, chunki bo'yoq mutagen bo'lib, teri tomonidan osongina so'rilishi mumkin va odamda sog'liq muammolariga olib kelishi mumkin.
5-rasm. Agaroz jelida yaratilgan quduqlarga namunalarni yuklash tasviri. Namunalarni yuklashda, quduqlarni teshmaslik uchun pipetkani burchak ostida ushlab turish kerak. Teshilgan quduqlar DNK namunalarining buferga va/yoki elektroforez idishiga oqib chiqishiga olib keladi va bu elektroforez jarayonining ifloslanishiga olib keladi.
Jel orqali elektr toki (masalan, 100 volt) o'tadi va jarayonning tegishli vaqt chegarasida ishlashiga ruxsat beriladi. DNK, manfiy zaryadlangan molekula manfiy zaryadlangan elektroddan (katod) anodga (musbat elektrod) qarab harakat qiladi. DNK jel matritsasi bo'ylab harakatlanadi, kichikroq molekulalar katta molekulalarga qaraganda tezroq harakat qiladi. Elektroforez jarayoni tugagandan so'ng elektr zaryadi yoki oqim o'chiriladi.
Ajratilgan DNK bo'laklari ultrabinafsha nurlari ostida ko'rinadi va jel plitasini EtBr yoki boshqa bo'yash bo'yog'iga namlangandan keyin suratga olinadi.

XULOSA
Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi va mass-spektrometriya texnologiyasi hozirgi vaqtda proteomikani o'rganishda eng ko'p qo'llaniladigan usul hisoblanadi. Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi turli xil oqsillarni ajratish uchun oqsil izoelektrik nuqtasi va molekulyar og'irlik farqidan foydalanadi. Kam miqdordagi oqsillarni ikki o'lchovli jel elektroforezi bilan ajratish qiyin bo'lsa ham, uning ishlashiga nisbatan yuqori talablar mavjud, ammo uning yuqori o'tkazuvchanligi, yaxshi piksellar sonini va takrorlanuvchanligi va mass-spektrometriya bilan birlashtirilish xususiyatlari uni eng mashhur va ishonchli qiladi Proteomikani o'rganish usullari. Ikki o'lchovli gel elektroforez texnologiyasi va mass-spektrometriyaga asoslangan proteomikani o'rganish protseduralari namuna tayyorlash → izoelektrik fokuslash → poliakrilamid jel elektroforezi → jelni bo'yash → qiziquvchan oqsil joylarini qazib olish → jelda hazm qilish → pektidlarni aniqlash uchun mass-spektrometriya tahlili. Barmoq izi yoki qisman amino kislota ketma-ketligi → proteinni aniqlash uchun ma'lumotlar bazasidan foydalaning. Proteomik tadqiqotlar yuqori aniqlikdagi oqsillarni ajratishni va aniq va sezgir mass-spektrometriya identifikatsiyalash usullarini talab qiladi. Jel elektroforezidagi oqsillarning ranglanishi nafaqat oqsil ajratish rezolyutsiyasiga, balki keyingi mass-spektrometriya identifikatsiyasiga ham ta'sir qiladi. Oqsillarni bo'yashni to'rt toifaga ajratish mumkin: organik reagentni bo'yash, kumush rang bilan bo'yash, lyuminestsent rang berish va izotoplarni bo'yash.

Unlu va boshq. floresan differentsial displeyining ikki o'lchovli elektroforezi (F-2D-DIGE) miqdoriy proteomikasini tahlil qilish usulini taklif qildi. Differentsial gel elektroforezi (DIGE) - bu 2-DE ning texnik yaxshilanishi. U bir nechta flüoresan tahlil usulini birlashtiradi. U bir xil gelda turli xil lyuminestsentsiya bilan etiketlenmiş bir nechta namunalarni ajratadi va ichki asosiy tushunchani taqdim etadi. Ikki namunadagi oqsillar har xil lyuminestsent yorliqlar bilan aralashtirib, ikkita namunadagi oqsilning ifodasini aniqlash uchun 2-DE ni bajaradi, natijada natijalarning aniqligi, ishonchliligi va takrorlanuvchanligi ancha yaxshilanadi. DIGE texnologiyasida har bir oqsil dog'ining o'ziga xos ichki standarti mavjud va dasturiy ta'minot har bir oqsil joyining ichki standartiga muvofiq o'z ifodasini avtomatik ravishda kalibrlashi mumkin, aniqlangan oqsillarning ko'pligi o'zgarishi haqiqatdir. DIGE texnologiyasi turli xil namunalarda qo'llanilgan.
Kapillyar Elektroforez (CE) - elektr maydoni ta'sirida elektrodlarga ko'chib o'tishga asoslangan zaryadlangan molekulalarni (ionlarni) ajratish uchun tor kapillyardan foydalanadigan elektroforez texnikasining bir turi. Bu kichik molekulalar, DNK va oqsillarni tahlil qilish uchun yuqori aniqlikdagi va tezkor usul.
Idoralar ning ahamiyati, hatto murakkab aralashmalarni ham yuqori aniqlik va takrorlanuvchan ajratish qobiliyatidadir, bu uni biokimyo, farmatsevtika va sud tibbiyoti kabi turli sohalarda qimmatli vositaga aylantiradi.
Idoralar tarixi 1970-yillarning oxiri va 1980-yillarning boshlariga to'g'ri keladi, mikrofabrikasion texnologiyalarning rivojlanishi kichik ichki diametrli kapillyarlarni yaratishga yo'l ochdi. O'shandan beri Idoralar yaxshi tashkil etilgan analitik texnikaga aylandi va turli xil ilovalar uchun tobora ko'proq foydalanilmoqda.
ADABIYOTLAR RO’YXATI