Research article

tions to circumvent bacterial adaptation and due to the paucity of new drugs in the pharmaceu-

tical company pipelines [

39

], our strategy could constitute an opportunity for neglected

molecules to be rejuvenated by using

“escort molecules” to improve their action. Our study

paves the way for this type of new original antibacterial strategies.

Supporting Information

S1 Fig. Results of the screening procedure.

(

Ã

) the compounds NV730, NV731, NV716 and

NV720 are the compounds 1, 2, 3, 4 selected in this study respectively. (

ÃÃ

) The concentration

of 10

μM used in this study is over the MIC of Pseudomonas aeruginosa strain PA01 for poly-

myxin-B.

(TIFF)

S2 Fig. Determination of LogD and protonated species for derivative 3.

All LogD and pro-

tonated species involved for derivative 3 have been determined by using chemical simulation

software Marvin Sketch 5.11.3.

(PDF)

S3 Fig. Inner membrane depolarization by 3.

The membrane potential disruption was fol-

lowed by monitoring Disc

3

(5) fluorescence.

(PDF)

S1 Table. Description of the clinical isolates.

The antibiotic resistance of each isolate for com-

monly used antibiotics and the MIC for doxycycline are indicated.

(PDF)

S2 Table. Results of the checkerboard assay.

For each concentration of the combination

between, (a) doxycycline and compound 3; (b) doxycycline and PAßN, the FIC index is indi-

cated.

(PDF)

S3 Table. Results of the synergy assays of compound 3 with representative anti-pseudomo-

nal agents.

(PDF)

Acknowledgments

We are grateful to Professor Patrick Plésiat (Université de Franche-Comté, Besançon, France)

for providing us with strains and for helpful and stimulating discussions. We acknowledge M.

deMéo and C. diGiorgio from the laboratory of biogenotoxicology and environmental muta-

genesis (school of Pharmacy, Marseille) for their contribution to the cytotoxicity assays, and

Dr. V. Mejean (Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des protéines, Marseille, France)

for reading the manuscript and providing suggestions.

Inhibitors of Antibiotic Resistance in Pseudomonas

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0154490

May 6, 2016

14 / 16

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: J. Bolla J. Brunel EG. Performed the experiments:

DB AL HT. Analyzed the data: J. Bolla J. Brunel JMP EG DB. Contributed reagents/materials/

analysis tools: EG J. Bolla J. Brunel JMP. Wrote the paper: DB J. Bolla J. Brunel.

References

1.

Xu Z-Q, Flavin MT, Flavin J. Combating multidrug-resistant Gram-negative bacterial infections. Expert

Opin Investig Drugs. 2014; 23(2): 163

–82. doi:

10.1517/13543784.2014.848853

PMID:

24215473

2.

Karaiskos I, Giamarellou H. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant Gram-negative patho-

gens: current and emerging therapeutic approaches. Expert Opin Pharmacother. 2014; 15(10): 1351

–

70. doi:

10.1517/14656566.2014.914172

PMID:

24766095

3.

Bassetti M, Merelli M, Temperoni C, Astilean A. New antibiotics for bad bugs: where are we? Ann Clin

Microbiol Antimicrob. 2013; 12(1): 22. doi:

10.1186/1476-0711-12-22

4.

Cox G, Wright GD. Intrinsic antibiotic resistance: mechanisms, origins, challenges and solutions. Int J

Med Microbiol. 2013; 303(6

–7): 287–92. doi:

10.1016/j.ijmm.2013.02.009

PMID:

23499305

5.

Davin-Regli A, Bolla J-M, James CE, Lavigne J-P, Chevalier J, Garnotel E, et al. Membrane permeabil-

ity and regulation of drug

“influx and efflux” in enterobacterial pathogens. Curr Drug Targets. 2008; 9

(9): 750

–9. PMID:

18781921

6.

Schweizer HP. Understanding efflux in Gram-negative bacteria: opportunities for drug discovery. Expert

opinion on drug discovery. 2012; 7(7): 633

–42. doi:

10.1517/17460441.2012.688949

PMID:

22607346

7.

Pag

ès J-M, James CE, Winterhalter M. The porin and the permeating antibiotic: a selective diffusion

barrier in Gram-negative bacteria. Nat Rev Micro. 2008; 6(12): 893

–903.

8.

Morita Y, Tomida J, Kawamura Y. Responses of Pseudomonas aeruginosa to antimicrobials. Front

Microbiol 2014; 4. doi:

10.3389/fmicb.2013.00422

9.

Mamelli L, Petit S, Chevalier J, Giglione C, Lieutaud A, Meinnel T, et al. New antibiotic molecules:

bypassing the membrane barrier of gram negative bacteria increases the activity of peptide deformy-

lase inhibitors. PLoS ONE. 2009; 4(7): e6443. doi:

10.1371/journal.pone.0006443

PMID:

19649280

10.

Livermore DM. Multiple mechanisms of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: our worst

nightmare? Clin Infect Dis. 2002; 34(5): 634

–40. PMID:

11823954

11.

Okamoto K, Gotoh N, Nishino T. Extrusion of penem antibiotics by multicomponent efflux systems

MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-OprM of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Che-

mother. 2002; 46(8): 2696

–9. PMID:

12121960

12.

Morita Y, Tomida J, Kawamura Y. MexXY multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa. Front

Microbiol. 2012; 3: 408. doi:

10.3389/fmicb.2012.00408

PMID:

23233851

13.

Masuda N, Sakagawa E, Ohya S, Gotoh N, Tsujimoto H, Nishino T. Substrate specificities of MexAB-

OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents

Chemother. 2000; 44(12): 3322

–7. PMID:

11083635

14.

Hocquet D, Roussel-Delvallez M, Cavallo J-D, Plésiat P. MexAB-OprM- and MexXY-overproducing

mutants are very prevalent among clinical strains of Pseudomonas aeruginosa with reduced suscepti-

bility to ticarcillin. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51(4): 1582

–3. PMID:

17220417

15.

Li XZ, Nikaido H, Poole K. Role of mexA-mexB-oprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.

Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39(9): 1948

–53. PMID:

8540696

16.

Masuda N, Sakagawa E, Ohya S, Gotoh N, Tsujimoto H, Nishino T. Contribution of the MexX-MexY-

oprM efflux system to intrinsic resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother.

2000; 44(9): 2242

–6. PMID:

10952562

17.

Brunel JM, Lieutaud A, Lome V, Pag

ès J-M, Bolla J-M. Polyamino geranic derivatives as new chemo-

sensitizers to combat antibiotic resistant gram-negative bacteria. Bioorg Med Chem. 2013; 21(5):

1174

–1179. doi:

10.1016/j.bmc.2012.12.030

PMID:

23352753

18.

Bolla J-M, Brunel JM, Casanova JPF, Lorenzi V, Berti L. Preparation of polyaminoisoprenyl derivatives

for use in medical and nonmedical antibiotic or antiseptic treatment. PCT Int Appl. 2012;

(WO2012113891A1):51pp.

19.

Lieutaud A, Guinoiseau E, Lorenzi V, Guiliani M, Lome V, Brunel J, et al. Inhibitors of antibiotic efflux by

AcrAB-TolC in Enterobacter aerogenes. Anti-Infective Agents. 2013; 11(2): 168

–178.

20.

Stover CK, Pham XQ, Erwin AL, Mizoguchi SD, Warrener P, Hickey MJ, et al. Complete genome

sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature; 2000; 406(6799):

959

–64. PMID:

10984043

Inhibitors of Antibiotic Resistance in Pseudomonas

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0154490

May 6, 2016

15 / 16

21.

Dumas J-L, van Delden C, Perron K, Köhler T. Analysis of antibiotic resistance gene expression in

Pseudomonas aeruginosa

by quantitative real-time-PCR. FEMS Microbiol Lett. 2006; 254(2): 217

–25.

PMID:

16445748

22.

Hamzehpour MM, Pechere J-C, Plésiat P, Köhler T. OprK and OprM define two genetically distinct mul-

tidrug efflux systems in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39(11):

2392

–6. PMID:

8585714

23.

Köhler T, Michea-Hamzehpour M, Henze U, Gotoh N, Curty LK, Pechere JC. Characterization of

MexE-MexF-OprN, a positively regulated multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa. Mol

Microbiol. 1997; 23(2): 345

–54. PMID:

9044268

24.

Muller C, Plésiat P, Jeannot K. A two-component regulatory system interconnects resistance to poly-

myxins, aminoglycosides, fluoroquinolones, and

β-lactams in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob

Agents Chemother. 2011; 55(3): 1211

–21. doi:

10.1128/AAC.01252-10

PMID:

21149619

25.

Vettoretti L, Plésiat P, Muller C, Garch El F, Phan G, Attrée I, et al. Efflux unbalance in Pseudomonas

aeruginosa

isolates from cystic fibrosis patients. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53(5): 1987

–97.

doi:

10.1128/AAC.01024-08

PMID:

19258280

26.

Odds FC. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Che-

mother. 2003; 52(1): 1. PMID:

12805255

27.

Agwuh KN, MacGowan A. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the tetracyclines including gly-

cylcyclines. J Antimicrob Chemother. 2006; 58(2): 256

–65. PMID:

16816396

28.

Taber HW, Mueller JP, Miller PF, Arrow AS. Bacterial uptake of aminoglycoside antibiotics. Microbiol

Rev. 1987; 51(4): 439

–57. PMID:

3325794

29.

Renau TE, Léger R, Filonova L, Flamme EM, Wang M, Yen R, et al. Conformationally-restricted ana-

logues of efflux pump inhibitors that potentiate the activity of levofloxacin in Pseudomonas aeruginosa.

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2003; 13(16): 2755

–8.

30.

Lomovskaya O, Warren MS, Lee A, Galazzo J, Fronko R, Lee M, et al. Identification and characteriza-

tion of inhibitors of multidrug resistance efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa: novel agents for

combination therapy. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45(1): 105

–16. PMID:

11120952

31.

Poole K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Front Microbiol. 2011; 2: 65. doi:

10.3389/

fmicb.2011.00065

PMID:

21747788

32.

Iino R, Nishino K, Noji H, Yamaguchi A, Matsumoto Y. A Microfluidic Device for Simple and Rapid Eval-

uation of Multidrug Efflux Pump Inhibitors. Front Microbiol. 2012; 3. doi:

10.3389/fmicb.2012.00040

33.

Lamers RP, Cavallari JF, Burrows LL. The efflux inhibitor phenylalanine-arginine beta-naphthylamide

(PA

βN) permeabilizes the outer membrane of gram-negative bacteria. PLoS ONE. 2012; 8(3):

e60666

–6.

34.

Kwon DH, Lu CD. Polyamines Increase Antibiotic Susceptibility in Pseudomonas aeruginosa. Antimi-

crob Agents Chemother. 2006; 50(5): 1623

–7. PMID:

16641427

35.

Verch

ère A, Broutin I, Picard M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial

efflux pumps. Sci Rep. 2012; 2. doi:

10.1038/srep00306

36.

Ejim L, Farha MA, Falconer SB, Wildenhain J, Coombes BK, Tyers M, et al. Combinations of antibiotics

and nonantibiotic drugs enhance antimicrobial efficacy. Nat Chem Biol. 2011; 7(6): 348

–50. doi:

10.

1038/nchembio.559

PMID:

21516114

37.

Bell BG, Schellevis F, Stobberingh E, Goossens H, Pringle M. A systematic review and meta-analysis

of the effects of antibiotic consumption on antibiotic resistance. BMC Infect Dis. 2014; 14: 13. doi:

10.

1186/1471-2334-14-13

PMID:

24405683

38.

Nitzan O, Suponitzky U, Kennes Y, Chazan B, Raul R, Colodner R. Is chloramphenicol Making a come-

back? Isr Med Assoc J. 2010; 12(6): 371

–4. PMID:

20928993

39.

Butler MS, Blaskovich MA, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline in 2013. J Antibiot. 2013; 66

(10): 571

–91. doi:

10.1038/ja.2013.86

PMID:

24002361

Inhibitors of Antibiotic Resistance in Pseudomonas

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0154490

May 6, 2016

16 / 16