Rev. Virtual Quim



Yüklə 419.83 Kb.
Pdf просмотр
tarix05.08.2017
ölçüsü419.83 Kb.

 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1381 

 

 



Artigo 

Óleo Essencial das Flores de Eugenia klotzschiana (Myrtaceae): 

Composição Química e Atividades Tripanocida e Citotóxica In 

Vitro 

Carneiro, N. S.; Alves, J. M.; Alves, C. C. F.; Esperandim, V. R.; Miranda, 

M. L. D.* 

Rev. Virtual Quim., 2017, 9 (3), 1381-1392. Data de publicação na Web: 12 de junho de 2017 

http://rvq.sbq.org.br

 

 

Essential  Oil  of  Flowers  from  Eugenia  klotzschiana  (Myrtaceae):  Chemical 



Composition and In Vitro Trypanocidal and Cytotoxic Activities

 

Abstract:  Chagas  disease,  which  is  caused  by  Trypanosoma  cruzi,  has  been  commonly  treated  by  nifurtimox  and 

benzonidazole,  two  drugs  that  cause  several  side  effects.  As  a  result,  the  use  of  natural  products  for  treating 

neglected diseases has increased in recent years and plants have become a promising alternative to developing new 

medicines.  Therefore,  this  study  aimed  to  determine  the  chemical  composition  of  the  essential  oil  from  fresh 

flowers of Eugenia klotzchiana and to evaluate for the first time its trypanocidal and cytotoxic potential in vitro. The 

essential oil from the fresh flowers was obtained by hydrodistillation carried out by a Clevenger apparatus and its 

chemical  composition  was  determined  by  GC-MS.  The  main  compounds  found  in  the  essential  oil  were 

ses uite pe oids:  β-caryophyllene  (21.1%),  bicyclogermacrene  (10.2%)  and  spathulenol  (20.9%).  Results  showed 

that the essential oil had strong trypanocidal activity against the trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi (IC

50

 = 



.  μg/ L  a d  ode ate  toto i it  agai st fi o lasts i  the  o e t atio   a ge  CC

50

 



.  μg/ L . I  sho t, 

the essential oil from fresh flowers of Eugenia klotzchiana can be considered a new source of bioactive compounds 

for the development of antiparasitic drugs. 



Keywords: Eugenia klotzchianaMyrtaceae; essential oil; flowers; Trypanosoma cruzi, cytotoxic analysis.

 

 

Resumo

 

A Doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e os medicamentos mais utilizados em seu tratamento são o 

nifurtimox  e  benzonidazol,  que  causam  vários  efeitos  colaterais.  O  uso  de  produtos  naturais  no  tratamento  de 

doenças  negligenciadas  aumentou  nos  últimos  anos  e  as  plantas  tornaram-se  uma  alternativa  promissora  para  o 

desenvolvimento  de  novos  medicamentos.  Portanto,  este  estudo  teve  como  objetivo  determinar  a  composição 

química  do  óleo  essencial  das  flores  frescas  de  Eugenia  klotzchiana  e  avaliar  pela  primeira  vez  seus  potenciais 

tripanocida e citotóxico in vitro. O óleo essencial das flores frescas foi obtido por hidrodestilação em aparelho tipo 

Clevenger  e  sua  composição  química  foi  determinada  por  CG-EM.  Os  principais  compostos  encontrados  no  óleo 

esse ial  das  flo es  fo a   ses uite pe oides:  β-cariofileno  (21,1%),  biciclogermacreno  (10,2%)  e  espatulenol 

(20,9%). Os resultados mostraram que o óleo essencial apresentou promissora atividade tripanocida contra formas 

tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (CI

50

 



=  ,  μg/ L  e  ode ada  itoto i idade so e fi o lastos  a fai a de 

concentração analisada (CC

50

 



,  μg/ L . E  su a, o óleo essencial das flores frescas de Eugenia klotzchiana 

pode  ser  considerado  uma  nova  fonte  de  compostos  bioativos  para  o  desenvolvimento  de  medicamentos 

antiparasitários. 

Palavras-chave: Eugenia klotzchiana; Myrtaceae; óleo essencial; flores; Trypanosoma cruzi; análise citotóxica.

 

* Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, Campus Pouso Alegre, CEP 37550-000, 



Pouso Alegre, MG, Brasil. 

 

mayker.miranda@ifsuldeminas.edu.br



  

DOI: 

10.21577/1984-6835.20170080

 


Volume 9, Número 3 

 

Revista Virtual de Química 



ISSN 1984-6835

 

Maio-Junho 2017 



 

1382 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

Óleo Essencial das Flores de Eugenia klotzschiana (Myrtaceae): 



Composição Química e Atividades Tripanocida e Citotóxica In 

Vitro 

Nárgella S. Carneiro,

a

 José Milton Alves,

a

 Cassia Cristina F. Alves,

a

 Viviane 

R. Esperandim,

b

 Mayker Lazaro D. Miranda

c,

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Goiano, Campus Rio Verde, CEP 75901-



970, Rio Verde-GO, Brasil. 

Universidade de Franca, Centro de Pesquisa em Ciências Exatas e Tecnologia, CEP 14404-600, 



Franca-SP, Brasil. 

c

 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, Campus Pouso 



Alegre, CEP 37550-000, Pouso Alegre-MG, Brasil. 

mayker.miranda@ifsuldeminas.edu.br   



 

Recebido em 4 de maio de 2017. Aceito para publicação em 7 de junho de 2017 

 

1. 

Introdução 

2. 

Parte Experimental 

2.1.

 Material vegetal 

2.2. 

Extração do óleo essencial 



2.3.

 Análise do óleo essencial por CG-EM 

2.4. 

Atividades tripanocida e citotóxica in vitro 



3. 

Resultados e Discussão 

4. 

Conclusão 

 

1. 



Introdução

 

 



As  doenças  tropicais  negligenciadas  são 

um  grupo  de  17  doenças  consideradas 

infecções  crônicas  comuns  em  pessoas  mais 

carentes, 

oriundas 

de 


países 

menos 


desenvolvidos.  A  organização  mundial  da 

saúde 


reconhece 

urgência 



do 

desenvolvimento  de  novas  ferramentas  e 

tecnologias  para  o  combate  dessas  doenças 

que  são  consideradas  os  maiores  problemas 

de saúde do mundo.

 



A  Doença  de  Chagas  ou  Tripanossomíase 

Americana  é  causada  pelo  protozoário 

flagelado 

Trypanosoma 

cruzi

que 


é 

transmitido 

ao 

hospedeiro 



humano, 

principalmente  por  triatomíneos  infectados.

2

 

Esta  doença  atinge  cerca  de  7-8  milhões  de 



latinos  americanos  e  o  modo  principal  de 

transmissão  para  as  pessoas  é  através  de 

fezes dos vetores infectados.

2

 Existem outros 



meios  de  contaminação  como  transfusão  de 

sangue contaminado, transmissão congênita, 



Carneiro, N. S. et al. 

 

 



Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1383 

 

transplante  de  órgãos



2

  e  inclusive  pela 

ingestão  de  frutos  infectados,  como  por 

exemplo o açaí.

3

  

No  tratamento  da  Doença  de  Chagas  são 



amplamente  empregados  dois  fármacos 

nitro-heterocíclicos: 

nifurtimox 



benzonidazol.

2

  Estes  fármacos  apresentam 



vários  efeitos  colaterais,  como:  anorexia, 

náuseas, 

alterações 

gastrointestinais, 

dermatopatia alérgica, polineurite, depressão 

da medula óssea, neuropatia periférica entre 

outros.

4

 



Devido  a  estas  complicações  causadas 

pelos fármacos disponíveis, torna-se cada vez 

mais  relevante  a  busca  por  novos  agentes 

quimioterápicos  que  sejam  eficazes  e 

apresentem  baixa  toxicidade.  Neste  sentido, 

a  ampla  biodiversidade  de  compostos 

bioativos  presentes  em  óleos  essenciais 

extraídos  de  plantas  têm  despertado  cada 

vez  mais  o  interesse  dos  pesquisadores  do 

mundo inteiro.

Estes óleos essenciais podem 



ser obtidos de diferentes espécies de plantas 

e  possuem  várias  atividades  biológicas,  tais 

como:  antibacteriana,  anticancerígena,  anti-

inflamatória,  antimutagênica,  antifúngica, 

antioxidante e antiprotozoária.

6

 



A  espécie 

Eugenia 

klotzschiana 

é 

conhecida  popularmente  como  Pêra-do-



Cerrado  e  possui  distribuição  geográfica 

restrita 

sendo 

atualmente 



bastante 

empregada  para  prática  vegetativa  de 

controle  da  erosão  dos  solos.

7

  Eugenia 



klotzschiana,  uma  espécie  típica  do  Cerrado, 

é  encontrada  em  regiões  tropicais  e  se 

adapta  bem  a  solos  drenados  e  permeáveis, 

como  os  de  Goiás,  Distrito  Federal,  Mato 

Grosso,  Mato  Grosso  do  Sul,  Minas  Gerais  e 

sudoeste  da  Bahia.

8

  Estudos  recentes 



demonstraram  que  além  das  folhas  de  E. 

klotzschiana  possuírem  significante  potencial 

antioxidante  esta  espécie  também  pode  ser 

encontrada na Bolívia.

8,9


  

No  Brasil  a  família  Myrtaceae  apresenta 

23  gêneros  e  aproximadamente  1000 

espécies.

10

  As  plantas  pertencentes  a  esta 



família  são  consideradas  fontes  ricas  em 

óleos 


essenciais 

responsáveis 

por 

importantes  benefícios  tanto  econômicos 



quanto  aqueles  relacionados  à  saúde.

10 


gênero Eugenia possui cerca de 400 espécies 

no  Brasil  e  muitas  destas  espécies  têm  se 

destacado  devido  a  produção  destes  óleos 

essenciais que exibem diversas propriedades 

farmacológicas.

11

  

Os óleos essenciais obtidos de espécies de 



Eugenia têm sido alvos de diversos trabalhos 

e  dentre  as  espécies  estudadas  pode-se 

destacar  E.  uniflora,

12

  E.  punicifolia,



13

  E. 



caryophyllata,

14

 



E. 

brasiliensis

15 




E. 

racemulosa.

16

 Especificamente, as espécies E. 



brasiliensis  e  E.  uniflora  já  tiveram  seus 

potenciais 

antiparasitários 

investigados 

anteriormente  frente  ao  T.  cruzi.

17-18


  Em 

adição,  as  atividades  anti-Trypanosoma  cruzi 

e  citotóxica  do  óleo  essencial  das  flores 

frescas  de  E.  klotzschiana  estão  sendo 

descritas pela primeira vez neste trabalho. 

Dando  continuidade  à  nossa  linha  de 

pesquisa  que  visa  conhecer  a  composição 

química  e  as  atividades  biológicas  de  óleos 

essenciais,

19

  o  presente  trabalho  aborda  a 



composição  química  do  óleo  essencial  das 

flores frescas de Eugenia klotzschiana (Figura 

1) e suas atividades in vitro contra as formas 

tripomastigotas  do  Trypanosoma  cruzi  e 

citotóxica  frente  a  fibroblastos  da  linhagem 

LLCMK


2

 



 

 

Carneiro, N. S. et al. 



 

 

 



1384 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

 



Figura 1. Flor de Eugenia klotzschiana (Myrtaceae) 

 

2. 



Parte Experimental

 

 



2.1. Material vegetal 

 

As  flores  frescas  da  pêra-do-cerrado 



(Eugenia  klotzschiana)  foram  coletadas  em 

dezembro  de  2014  as  18h:00min  em  uma 

propriedade  rural  com  áreas  de  vegetação 

nativa  típica  do  Cerrado,  no  município  de 

Portelândia  localizado  no  estado  de  Goiás 

latitude  sul 

° 

′  e  lo gitude  oeste 



° 

′ .  A  a ost a  oletada  foi  depositada  no 

Herbário 

Germano 


Guarim 

Neto 


da 

Universidade Federal de Goiás, sob o registro 

HJ 7414. 

 

2.2. Extração do óleo essencial 

 

As flores frescas (100 g) foram submetidas 



em  triplicata  à  extração  do  óleo  essencial 

pelo método de hidrodestilação em aparelho 

do  tipo  Clevenger,  por  um  período  de  2 

horas. Em seguida, o hidrolato foi submetido 

à  extração  com  três  porções  de  10  mL  de 

diclorometano  em  funil  de  separação.  Os 

óleos  essenciais  extraídos  foram  reunidos  e 

secos  com  sulfato  de  sódio  anidro, 

acondicionados em frascos de vidro âmbar e 

mantidos  sob  refrigeração  até  a  realização 

das análises.  

 

2.3. Análise do óleo essencial por CG-EM 

 

A  identificação  dos  constituintes  do  óleo 



essencial 

das 


flores 

frescas 


foi  realizada  empregando-se  cromatografia 

gasosa 


acoplada 

à 

espectrometria 



de  massas  (CG-EM),  utilizando  aparelho 

Agilent  Technologies  7820A  CG  e  MSD 

5975.  A  análise  foi  realizada  com  coluna 

capilar 


de 

sílica 


fundida, 

modelo 


DB-5 (5% fenil-95% dimetilpolisiloxano, 30 m 

de 


comprimento 

0,25 



mm 

de 


diâmetro interno x 0,25 µm de espessura de 

filme) 


da 

Shimadzu®, 

sendo 

utilizado  como  gás  de  arraste  hélio  (He)  em 



fluxo 

de 


1,0 

mL/min. 


injeção em modo split 1:20 foi realizada com 

injetor 

240°C. 



temperatura  da  fonte  foi  de  270°C  e  a 

programação 

de 


temperatura 

do 


forno  foi  temperatura  inicial  60°C  até  180°C 

com 


taxa 

de 


aquecimento 



°C/min.  Para  a  detecção  foi  aplicada  a 

ionização 

por 

elétrons 



70 


eV. 

A  determinação  da  composição  química  do 

óleo 

essencial 



foi 

realizada 

pela análise dos espectros de massas, obtidos 

por 


CG-EM. 

Os 


constituintes 

voláteis  foram  identificados  por  comparação 

de 

seus 


espectros 

de 


massas 

Carneiro, N. S. et al. 

 

 



Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1385 

 

com um banco de dados (biblioteca NIST 11) 



pela 


comparação 

de 


seus 

índices  de  retenção (IR) com os relatados na 

literatura.

20

 



Os 

índices 


de 

retenção  foram  determinados  em  relação  a 

retenção 

de 


uma 

série 


de 

n-alcanos  (C

10

-C



29

),  analisada  nas  mesmas 

condições 

cromatográficas 

das 

amostras. 



 

2.4. Atividades tripanocida e citotóxica in 

vitro  

 

Para obtenção das formas tripomastigotas 



do  Trypanosoma  cruzi,  as  células  LLCMK

2

 



foram 

cultivadas 

em 

meio 


RPMI 

suplementado  com  2  x  10

-6

  mol/L  de  L-



glutamina,  10

-5

  mol/L  de  NaHCO



3

,  100  U/mL 

de pe i ili a, 

 μg/ L de est epto i i a e 

10  %  de  soro  fetal  bovino  inativado.  O 

procedimento  foi  realizado  em  frascos  de 

cultura  a  37  °C,  sob  5  %  de  CO

2

  ambiente  e 



humidade  relativa  de  95  %.  As  formas 

tripomastigotas  foram  mantidas  em  meio 

RPMI  e  os  parasitas  foram  transferidos  para 

meio fresco a cada 48 h para obter as formas 

livres  dos  parasitas.  O  ensaio  realizado  após 

24  h  baseou-se  na metodologia  relatada  por 

Esperandim et al. (2013).

21 


Aproximadamente 

1  x  10


6

  tripomastigotas  foram  adicionadas  a 

cada  poço  numa  placa  de  microtitulação  de 

96  poços.  Em  seguida,  o  óleo  essencial  foi 

adicionado em concentrações que variam  de 

,  a 


 μg/ L. Após   h de i u ação, a 

atividade  biológica  das  amostras  foi avaliada 

pelo ensaio colorimétrico de sal de tetrazólio 

de  MTT  (MTT  =  brometo  de  3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) 

(5 


mg/mL)  .  As  leituras  foram  conduzidas  por 

um  leitor  de  microplacas  a  517  nm  de 

comprimento de onda. Os controlos positivos 

e  negativos  foram  benzonidazol  (de  12,5  a 

  μg/ L   e  ,   %  de  di etilsulfó ido 

(DMSO),  respectivamente.  Os  ensaios  foram 

realizados em triplicata.  

As  células  de  fibroblastos  LLCMK

2

  foram 


propagadas 

em 


meio 

RPMI 


1640 

suplementado  com  100  U/mL  de  penicilina, 

 μg/ L de est epto i i a e   % de so o 

de vitelo fetal inativado. Mantidas a 37 °C em 

5  %  de  CO

2

.  Uma  suspensão  de  células  foi 



semeada  a  uma  concentração  de  1  x  10

6

 



células/mL  numa  microplaca  de  96  poços 

com meio RPMI 1640. Em seguida, as células 

foram  tratadas  com  óleo  essencial  a 

diferentes  concentrações  (6,25,  12,5,  25, 50, 

  e 


  μg/ L .  As  pla as  fo a  

incubadas a 37 °C durante 24 h e a atividade 

biológica 

foi 


avaliada 

pelo 


método 

colorimétrico MTT  [MTT; Brometo  de  3-(4,5-

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]  num 

leitor de microplacas a 540 nm. O meio RPMI 

1640  foi  o controle  positivo  enquanto  que  o 

meio  DMSO  e  RPMI  1640  foi  o  negativo. 

Todas  as  experiências  foram  realizadas  em 

triplicata.  A  percentagem  de  viabilidade 

celular  foi  determinada  pela  seguinte 

fórmula: % de viabilidade celular = 1 - [(Y-N) / 

(N-P)]  x  100,  em  que  Y  =  absorbância  de 

poços  contendo  células  e  óleo  essencial  em 

diferentes  concentrações;  N  =  controle 

negativo; e P = controle positivo.

21

 

 



3. 

Resultados e Discussão

 

 



O  óleo  essencial  foi  obtido  por 

hidrodestilação  das  flores  frescas  de  E. 



klotzschiana e apresentou coloração amarelo 

claro,  odor  acentuado  e  rendimento  de 

0,09%.    Foram  identificados  33  compostos 

com 


concentrações 

acima 


de 

0,1% 


correspondendo a 85,8% da composição total 

do  óleo  estudado  (Tabela  1,  Figura  2).  Em 

relação à composição química, identificou-se 

por 


CG-EM 

2,9% 


de 

monoterpenos 

hidrocarbonetos,  3,0%  de  monoterpenos 

oxigenados, 

41,9% 

de 


sesquiterpenos 

hidrocarbonetos,  36,3%  de  sesquiterpenos 

oxigenados e 1,7% de outros (Tabela 1). 

 

 



 

 

 

Carneiro, N. S. et al. 



 

 

 



1386 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

Tabela 1. Composição química do óleo essencial das flores frescas de E. klotzschiana 



Compostos 

IR

a

 

IR

b

 

Área % 

α-Pineno 

954 

953 


2,5 

Mirceno 


990 

977 


1,2 

Limoneno 

1033 

1031 


0,4 

Citronellol 

1226 

1223 


1,4 

Geraniol 

1252 

1249 


1,6 

Eugenol 


1362 

1362 


1,7 

β-Elemeno 

1392 

1396 


1,3 

α-Cedreno 

1410 

1408 


0,6 

β-Copaeno 

1416 

1415 


0,7 

β-Cedreno 

1419 

1418 


0,4 

α-(E)-Bergamoteno 

1432 

1438 


1,8 

α-Guaieno 

1439 

1438 


0,4 

β-Cariofileno 

1454 

1450 


21,1 

α-Humuleno 

1456 

1458 


0,3 

Alloaromadendreno 

1462 

1463 


0,4 

α-Muuroleno 

1480 

1482 


0,6 

Germacreno-D 

1484 

1486 


0,8 

β-Selineno 

1489 

1490 


0,4 

Epizonareno 

1497 

1495 


0,4 

γ-Muuroleno 

1500 

1497 


0,6 

Biciclogermacreno 

1502 

1501 


10,2 

β-Bisaboleno 

1505 

1504 


0,4 

β-Sesquifelandreno 

1525 

1521 


0,3 

Epiglobulol 

1530 

1532 


4,6 

Elemol 


1560 

1560 


0,2 

trans-nerolidol 

1569 


1570 

0,3 


Espatulenol 

1575 


1577 

20,9 

Globulol 

1592 

1590 


1,4 

α-Cadinol 

1653 

1652 


2,8 

2,3-Diidrofarnesol 

1681 

1680 


0,6 

Selin-7(11)-en-4-ol 

1691 

1690 


0,5 

α-Farnesol 

1714 

1714 


3,4 

Óxido de ledeno 

1890 

1890 


1,6 

Monoterpenos hidrocarbonetos 

 

 



2,9 

Monoterpenos oxigenados 

 

 



3,0 

Sesquiterpenos hidrocarbonetos 

 

 



41,9 

Sesquiterpenos oxigenados 

 

 



36,3 

Outros 

 

 



1,7 

Total 

 

 



85,8 

IR

a

:  Índices  de  retenção  linear  da  literatura  (Adams,  2007).

20

  IR



b

:  Índices  de  retenção 

calculados a partir dos tempos de retenção em relação a série de  n-alcanos (C

10

-C

29



) em uma 

coluna capilar DB-5 de 30 m. 

 

 


Carneiro, N. S. et al. 

 

 



Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1387 

 

 



Figura 2. Cromatograma (CG-EM) do óleo essencial das flores frescas de E. klotzschiana. 

 

É  descrito  na  literatura  que  o  odor 



apresentado  pelos  óleos  essenciais  é  devido 

aos  diversos  constituintes  voláteis  que 

influenciam  diretamente  no  aroma,  os 

majoritários e inclusive aqueles constituintes 

químicos  que  não  estejam  em  altas 

concentrações ou com alto rendimento.

22

 

A  análise  da  composição  química  do óleo 



essencial das flores frescas de E. klotzschiana 

coletadas  na  região  sudoeste  do  estado  de 

Goiás  exibiu  três  constituintes  majoritários 

identificados como sendo os sesquiterpenos: 

β-cariofileno  (21,1  %,  1),  biciclogermacreno 

(10,2  %,  2)  e  espatulenol  (20,9  %,  3)  (Figura 

3). 

 

H



H

H

H



H

H

HO



1

2

3

H

H



 

Figura 3. Estruturas dos constituintes majoritários do óleo essencial das flores frescas de E. 

klotzschiana

: β-cariofileno (1), biciclogermacreno (2) e espatulenol (3

 

É  importante  ressaltar  que  estes  três 



constituintes  químicos  predominantes  no 

óleo  essencial  das  flores  frescas  de  E. 



klotzschiana  também  já  foram  identificados 

anteriormente 

como 

constituintes 



majoritários,  porém  em  concentrações 

diferentes,  no  óleo  essencial  das  folhas  de 



Eugenia calycina uma espécie pertencente ao 

mesmo  gênero  da  planta  estudada.

23

  O 


estudo dos óleos essenciais das folhas e caule 

de  E.  sulcata  exibiu  composição  química 

semelhante a observada para E. klotzschiana 

tendo  como  componentes  ma

jo itá ios  o  β-

cariofileno  e  espatulenol.

24

  O  óleo  essencial 



das  folhas  de  E.  punicifolia  ocorrente  no 

estado de Pernambuco também demonstrou 

composição  química  similar  a  de  E. 

klotzschiana apresentando como um de seus 

o stitui tes  ajo itá ios o β-cariofileno.

13

 

1 0 .0 0



1 5 .0 0

2 0 .0 0


2 5 .0 0

3 0 .0 0


3 5 .0 0

4 0 .0 0


5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 0


 

 

Carneiro, N. S. et al. 



 

 

 



1388 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

As  variações  nas  concentrações  dos 



constituintes  químicos  de  óleos  essenciais 

podem  ser  justificadas  levando-se  em 

consideração 

vários 


fatores 

como 


sazonalidade,  ritmo  circadiano,  estágio  de 

desenvolvimento  e  idade,  temperatura, 

horário  de  coleta,  disponibilidade  de  água, 

radiação  UV,  os  nutrientes  do  solo,  altitude, 

composição  atmosférica  e  dano  tecidual,  já 

que 


todos 

atuam 


no 

metabolismo 

secundário,  influenciando  na  quantidade 

total  de  metabólitos  produzidos  e  também 

em suas proporções relativas.

19

 



Em  relação  às  atividades  biológicas 

investigadas,  o  óleo  essencial  das  flores 

frescas  de  E.  klotzschiana  demonstrou  ser 

ativo  frente  às  formas  tripomastigotas  do 



Trypanosoma  cruzi.  Observou-se  o  aumento 

da  inviabilidade  das  células  tripomastigotas 

com  aumento  da  concentração  de  óleo 

essencial.  Desta  forma,  o  óleo  essencial 

apresentou  satisfatória  atividade  tripanocida 

com  CI


50

  =  20,2  µg/mL  em  comparação  com 

controle  positivo  utilizado  o  benzonidazol 

com CI


50

 

=  ,  μg/ L  Ta ela  . 



 

Tabela  2.  Atividade  tripanocida  in  vitro  do  óleo  essencial  das  flores  frescas  de  E. 

klotzschiana 

 

 

% de lise ± DP/concentração (µg/mL) 

   6,25 

   12,5 

     25 

     50 

   100 

    200 

    400 

   CI

50

 

(µg/mL) 

EK-EO 

20,8±4,9 

34,2±2,4 

56,8±2,2 

72,3±1,4 

92,2±0,7 

95,7±0,7 

96,4±0,7 

   20,2 

EK-EO: óleo essencial de E. klotzschiana. Desvio padrão - DP 

 

O  estudo  anterior  realizado  com os óleos 



essenciais  de  duas  espécies  de  Citrus 

ocorrentes  na  região  sudoeste  de  Goiás, 

descreve  que  amostras  com  CI

50

  <  10  µg/mL 



tiveram  atividade  tripanocida  considerada 

altamente ativa, ativa (CI

50

 > 10 < 50 µg/mL), 



moderadamente ativa (CI

50

 > 50 < 100 µg/mL) 



e inativa (CI

50

 > 100 µg/mL) frente às formas 



tripomastigotas do T. cruzi.

25

 



A  atividade  antiparasitária  apresentada 

pelo  óleo  essencial  das  flores  frescas  de  E. 



klotzschiana pode ser atribuída ao sinergismo 

entre  os  constituintes  presentes  no  óleo 

essencial  analisado.

26

  Em  adição,  dentre  os 



constituintes  presentes  no  óleo  destaca-se  a 

presença 

daqueles 

que 


já 

possuem 


reconhecida  atividade  tripanocida  relatada 

na literatura como por exemplo os terpenos:  

α-pineno  (2,5  %)  identificado  no  óleo 

essencial 

dos 

frutos 


de 

Schinus 

terebinthifolius

27



mirceno 


(1,2 

%) 


ocorrente  em  plantas  do gênero  Xylopia

28

,  o 



eugenol  (1,7  %)  identificado  anteriormente 

no  óleo  essencial  do  cravo  da  índia

29

 

e  o  β-



cariofileno  (21,1  %)  que  exibiu  efeito 

tripanocida  significativo  através  do  efeito 

sinérgico com diterpenos.

30

  



As 

várias 


atividades 

biológicas 

apresentadas pelos óleos essenciais inclusive 

contra  os  tripanossomatídeos

31-32 

se  devem 



principalmente à sua composição terpênica e 

ao  já  mencionado  sinergismo  entre  seus 

constituintes.

33

 Os terpenos são responsáveis 



pelo caráter hidrofóbico dos óleos essenciais, 

permitindo sua difusão através da membrana 

celular  do  parasito  afetando  assim  as  vias 

metabólicas e organelas intracelulares.

6

 

A  citotoxicidade  foi  avaliada  frente  às 



células  LLCMK

2

  devido  o  meio  celular  ser  o 



mesmo  em  que  são  cultivados  os  parasitas. 

Justifica-se a execução deste ensaio uma vez 

que  se  comprova  a  eficácia  da  amostra 

contra os parasitas  sem que  a mesma esteja 

lisando as células sadias ao mesmo tempo em 

que lisa os parasitas. As culturas de células de 

fibroblasto  de  mamífero  LLCMK

2

  foram 



tratadas  com  o  óleo  essencial  nas 

concentrações de 6,25, 12,5, 25,0, 50,0, 100, 



Carneiro, N. S. et al. 

 

 



Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1389 

 

 e 



 μg/ L du a te   h. Os  esultados 

mostraram  que  o  óleo  essencial  das  flores 

frescas  apresentou  moderada  toxicidade  na 

concentração  avaliada,  apresentando  CC

50

  = 


,  μg/ L  Ta ela   e   o pa ação  o  

o  controle  positivo  o  benzonidazol  (CC

50

  = 


,  μg/ L  e  o   dados  já  epo tados  a 

literatura.

34

 

 



Tabela 3. Atividade citotóxica do óleo essencial das flores frescas de E. klotzschiana. 

 

 

% de células viáveis ± DP/concentração (µg/mL) 

  6,25 

  12,5 

   25 

     50 

    100 

    200 

    400 

  CC

50

 

(µg/mL) 

EK-EO 

100±0 


100±0 

100±0 


100±0 

95,3±0,8 

50,3±0,9 

23,3±1,9 

   220,3 

EK-EO: óleo essencial de E. klotzschiana. Desvio padrão - DP 

 

Avaliar 



citotoxicidade 

de 

uma 


determinada  amostra  é  relevante  porque 

torna  possível  a  elucidação  do  mecanismo 

biológico  gerador  do  efeito  citotóxico  e  o 

mecanismo de ação de diferentes compostos 

durante  a  sua  interação  com  os  tecidos.

35

  É 



descrito  na  literatura  que  amostras  que 

apresentaram  valor  de  CC

50

 



  μg/ L 

foram  consideradas  altamente  tóxicas, 

tóxicas 

CC

50



 

  < 



  μg/ L, 

moderadamente  tóxicas  CC

50

  >  100  <  1000 



μg/ L e  ão tó i as CC

50

 



 μg/ L.


36

  

A  moderada  citotoxicidade  exibida  pelo 



óleo  essencial  das  flores  frescas  de  E. 

klotzschiana 

frente  a  fibroblastos  da 

linhagem LLCMK

2

 é um indicador de que este 



óleo  essencial  pode  ser  bem  tolerado  frente 

ao sistema biológico,

37

 entretanto, ainda são 



necessários  estudos  adicionais  que  avaliem 

sua toxicidade in vivo

 

4. 

Conclusão

 

 



Os  resultados  do  presente  trabalho 

demostraram que o óleo essencial das flores 

frescas  de  E.  klotzschiana  coletadas  em 

dezembro de 2014 as 18h:00min apresentou 

em sua composição química uma mistura de 

mono  e  sesquiterpenos,  sendo  que  os 

constituintes 

majoritários 

foram 

os 


te pe oides: β-cariofileno, biciclogermacreno 

e o espatulenol. O óleo essencial apresentou 

ainda satisfatória atividade tripanocida frente 

às  formas  tripomastigota  do  Trypanosoma 



cruzi e exibiu moderada citotoxicidade frente 

às células LLCMK

2

.  As promissoras atividades 



tripanocida  e  citotóxica  foram  descritas  pela 

primeira  vez.  Em  suma,  nossos  resultados 

fornecem  subsídios  para  futuros  estudos  do 

óleo  essencial  das  flores  frescas  de  E. 



klotzschiana  visando  o  isolamento  dos 

compostos  bioativos  e  investigação  de  seus 

potenciais antiparasitários. 

 

Referências Bibliográficas 



 

1

 



Hotez, P. J.; Pecoult, B.; Rijal, S.; Boehme, C.; 

Aksoy,  S.;  Malecela,  M.;  Tapia-Conyer,  R.; 

Reeder,  J.  C.  Eliminating  the  neglected 

tropical  diseases:  translational  science  and 

new  technologies.  PLoS  Neglected  Tropical 

Diseases 201610, e0003895. [CrossRef] 

2

 



Lavorato, S. N.; Sales Júnior, P. A.; Murta, S. 

M.  F.;  Romanha,  A.  J.;    Alves,  R.  J.  In  vitro 

activity 

of 


1,3-bisaryloxypropanamines 

against  Trypanosoma  cruzi-infected  L929 

cultures. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 

2015110, 566. [CrossRef] 

3

 



Passos, L. A. C.; Guaraldo, A. M. A.; Barbosa, 

R. L.; Dias, V. L.; Pereira, K. S.; Schmidt, F. L.; 

Franco, R. M. B.; Alves, D. P. Sobrevivência e 

infectividade  do  Trypanosoma  cruzi  na  polpa 

de  açaí:  estudo  in  vitro  e  in  vivo

Epidemiologia  e  Serviços  de  Saúde  2012,  21

223. [CrossRef] 



 

 

Carneiro, N. S. et al. 



 

 

 



1390 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

4



 

Oliveira, M. F.; Nagao-Dias, A. T.; Pontes, V. 

M.  O.;  Sousa  Júnior,  A.  S.;  Coelho,  H.  L.  L.; 

Coelho,  I.  C.  B.  Tratamento  etiológico  da 

Doença  de  Chagas  no  Brasil.  Revista  de 

Patologia Tropical 200837, 209. [CrossRef] 

5

 



Melo,  D.  C.;  Miranda,  M.  L.  D.;  Ferreira 

Júnior, W. G.; Andrade, P. M.; Alcoba, A. E. T.; 

Silva,  T.  S.;  Cazal,  C.  M.;  Martins,  C.  H.  G. 

Anticariogenic 

and 

antimycobacterial 



activities  of  the  essential  oil  of  Siparuna 

guianensis  Aublet  (Siparunaceae).  Orbital: 

The  Electronic  Journal  of  Chemistry  2017,  9

55. [CrossRef] 

6

 

Raut, J. S.; Karuppayil, S. M. A status review 



on  the  medicinal  properties  of  essential  oils. 

Industrial  Crops  and  Products  2014,  62,  250. 

[CrossRef] 

7

 

Oliveira,  G.  C.;  Lopes,  P.  S.  N.;  Cunha  Neto, 



F.  R.;  Carvalho,  J.  G.;  Gavilanes,  M.  L. 

Caracterização  de  plantas  de  Eugenia 



klotzschiana  Berg  (Pêra-do-Cerrado)  e  do 

ambiente  de  sua  ocorrência  na  região 

fisiográfica  dos  campos  das  vertentes  em 

Minas Gerais. Revista da Universidade Alfenas 



19995, 9. [Link] 

8

 



Takao,  L.  K.;  Imatomi,  M.;  Gualtieri,  S.  C.  J. 

Antioxidant  activity  and  phenolic  content  of 

leaf  infusions  of  Myrtaceae  species  from 

Cerrado (Brazilian Savanna).  Brazilian Journal 



of Biology 201575, 948. [CrossRef] 

9

 



Villarroel, D.; Proença, C. E. B. A new species 

and new records of Myrtaceae from the Noel 

Kempff  Mercado  National  Park  region  of 

Bolivia. Kew Bulletin 201368, 261. [CrossRef] 

10

 

D



’Angelis, A. S. R.; Negrelle R. R. B. Pimenta 

pseudocaryophyllus 

(Gomes) 


Landrum: 

aspectos 

botânicos, 

ecológicos, 

etnobotânicos  e  farmacológicos.  Revista 

Brasileira  de  Plantas  Medicinais  2014,  16

607. [CrossRef] 

11

 

Queiroz,  J. M.  G.;  Suzuki, M.  C. M.;  Motta, 



A.  P.  R.;  Nogueira,  J.  M.  R.;  Carvalho,  E.  M. 

Aspectos  populares  e  científicos  do  uso  de 

espécies  de  Eugenia  como  fitoterápico. 

Revista Fitos 20159, 73. [CrossRef] 

12

 



Costa,  D.  P.;  Santos,  S.  C.;  Seraphin,  J.  C.; 

Ferri, P. H. Seasonal variability of essential oils 

of  Eugenia  uniflora  Leaves.  Journal  of  the 

Brazilian  Chemical  Society  2009,  20,  1287. 

[CrossRef] 

13

 

Oliveira,  R.  N.;  Dias,  I.  J.  M.;  Câmara,  C.  A. 



G.  Estudo  comparativo  do  óleo  essencial  de 

Eugenia  punicifolia  (HBK)  DC.  de  diferentes 

localidades de Pernambuco. Revista Brasileira 



de Farmacognosia 200515, 39. [CrossRef] 

14

 



Chaieb, K.; Hajlaoui, H.; Zmantar, T.; Kahla-

Nakbi,  A.  B.;  Rouabhia,  M.;  Mahdouani,  K.; 

Bakhrouf,  A.  The  chemical  composition  and 

biological  activity  of  clove  essential  oil, 



Eugenia  caryophyllata  (Syzigium  aromaticum 

L.  Myrtaceae):  a  short  review.  Phytotherapy 



Research 200721, 501. [CrossRef] 

15

 



Moreno, P. R. H.; Lima, M. E. L.; Sobral, M.; 

Young,  M.  C.  M.;  Cordeiro,  I.;  Apel,  M.  A.; 

Limberger, R. P.; Henriques, A. T. Essential oil 

composition  of  fruit  colour  varieties  of 



Eugenia  brasiliensis  Lam.  Scientia  Agricola 

200764, 428. [CrossRef] 

16

 



Senna,  L.  M.;  Souza,  G.  R.;  Bizzo,  H.  R.; 

Moreira,  D.  L.  Composição  volátil  das  folhas 

de Eugenia racemulosa O. Berg. (Myrtaceae). 

Revista  Brasileira  de  Farmácia  2011,  92,  51. 

[Link] 


17

 

Donato,  A.  M.;  Morretes,  B.  L.  Anatomia 



foliar 

de 


Eugenia 

brasiliensis 

Lam. 


(Myrtaceae) proveniente de áreas de restinga 

e  de  floresta.  Revista  Brasileira  de 



Farmacognosia 200717, 426. [CrossRef] 

18

 



Azeredo, C. M. O.; Santos, T. G.; Maia, B. H. 

L.  N.  S.;  Soares,  M.  J.  In  vitro  biological 

evaluation  of  eight  different  essential  oils 

against  Trypanosoma  cruzi  with  emphasis  on 



Cinnamomum 

verum 

essential 

oil. 

Complementary & Alternative Medicine 2014

14, 309. [CrossRef] 

19

 



Xavier,  M.  N.;  Alves,  J.  M.;  Carneiro,  N.  S.; 

Souchie, E. L.; Silva, E. A. J.; Martins, C. H. G.; 

Ambrosio, M. A. L. V.; Egea, M. B.; Alves, C. C. 

F.; Miranda, M. L. D. Composição química do 

óleo  essencial  de  Cardiopetalum  calophyllum 

Schltdl.  (Annonaceae)  e  suas  atividades 

antioxidante,  antibacteriana  e  antifúngica. 

Revista  Virtual  de  Química  2016,  8,  1433. 

[CrossRef] 



Carneiro, N. S. et al. 

 

 



Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

1391 

 

20



 

Adams,  R.  P.;  Identification  of  essential  oil 



componentes 

by 

gas 

chromatography 

quadrupole  mass  spectroscopy,  Allured:  Card 

Stream I L, 2007. 

21

 

Esperandim, V. R.; Ferreira, D. S.; Rezende, 



K.  C.  S.;  Magalhães,  L.  G.;  Souza,  J.  M.; 

Pauletti, P. M.; Januário, A. H.; Laurentz, R. S.; 

Bastos,  J.  K.;  Símaro,  G.  V.;  Cunha,  W.  R.; 

Silva, M. L. A. In vitro antiparasitic activity and 

chemical  composition  of  the  essential  oil 

obtained  from  the  fruits  of  Piper  cubeba



Planta Medica 201379, 1653. [CrossRef] 

22

 



Cordeiro, M. W. S.; Cavallieri, A. L. F.; Ferri, 

P.  H.;  Naves,  M.  M.  V.  Características  físicas, 

composição  químico-nutricional  dos  óleos 

essenciais  da  polpa  de  Caryocar  brasiliense 

nativo  do  estado  de  Mato  Grosso.  Revista 

Brasileira  de  Fruticultura  2013,  35,  1127. 

[CrossRef] 

23

 

Sousa, R. M. F.; Morais, S. A. L.; Vieira, R. B. 



K.; Napolitano, D. R.; Guzman, V. B.; Moraes, 

T. S.; Cunha, L. C. S.; Martins, C. H. G.; Chang, 

R.; Aquino, F. J. T.; Nascimento, E. A.; Oliveira, 

A.  Chemical  composition,  cytotoxic,  and 

antibacterial activity of the  essential oil from 

Eugenia calycina Cambess. leaves against oral 

bacteria. Insdustrial Crops and Products 2015



65, 71. [CrossRef] 

24

 



Lima, B. G.; Tietbohl, L. A. C.; Fernandes, C. 

P.;  Cruz,  R.  A.  S.;  Botas,  G.  S.;  Santos,  M.  G.; 

Silva-Filho,  M.  V.;  Rocha,  L.  Chemical 

composition 

of 

essential 



oils 

and 


anticholinesterasic activity of Eugenia sulcata 

Spring  ex  Mart.  Latin  American  Journal  of 



Pharmacy 201231, 152. [Link] 

25

 



Estevam, E. B. B.; Miranda, M. L. D.; Alves, 

J. M.; Egea, M. B.; Pereira, P. S.; Martins, C. H. 

G.;  Esperandim,  V.  R.;  Magalhães,  L.  G.; 

Bolela, A. C.; Cazal, C. M.; Souza, A. F.; Alves, 

C.  C.  F.  Composição  química  e  atividades 

biológicas  dos  óleos  essenciais  das  folhas 

frescas  de  Citrus  limonia  Osbeck  e  Citrus 

latifolia Tanaka (Rutaceae). Revista Virtual de 

Química 20168, 1842. [CrossRef] 

26

 



Bakkali,  F.;  Averbeck,  S.;  Averbeck,  D.; 

Idaomar, M. Biological effects of essential oils 

–  a  review.  Food  and  Chemical  Toxicology 

200846, 446. [CrossRef] 

27

 



Sartorelli,  P.;  Santana,  J.  S.;  Guadagnin,  R. 

C.; Lago, J. H. G.; Pinto, E. G.; Tempone, A. G.; 

Stefani,  H.  A.;  Soares,  M.  G.;  Silva,  A.  M.  In 

vitro  trypanocidal  evaluation  of  pinane 

derivatives  from  essential  oils  of  ripe  fruits 

from 

Schinus 

terebinthifolius 

Raddi 


(Anacardiaceae). Química Nova 201235, 743. 

[CrossRef] 

28

 

Silva, L. E.; Reis, R. A.; Moura, E. A.; Amaral, 



W.; Sousa, Jr. P. T. Plantas do gênero Xylopia

composição 

química 

potencial 



farmacológico.  Revista  Brasileira  de  Plantas 

Medicinais 201517, 814. [CrossRef] 

29

 



Affonso, R. S.; Rennó, M. N.; Slana, G. B. C. 

A.;  França,  T.  C.  C.  Aspectos  químicos  e 

biológicos do óleo essencial de cravo da índia. 

Revista  Virtual  de  Química  2012,  4,  146. 

[CrossRef] 

30

 

De  Pieri,  F.  A.  Atividade  sinérgica  entre 



terpenos obtidos do gênero Copaifera sobre o 

agente  etiológico  da  Doença  de  Chagas. 



Revista  Virtual  de  Química,  2012,  4,  343. 

[CrossRef] 

31

 

Escobar,  P.;  Leal,  S.  M.;  Herrera,  L.  V.; 



Martinez,  J.  R.;  Stashenko,  E.  Chemical 

composition  and  antiprotozoal  activities  of 

Colombian  Lippia  spp  essential  oils  and  their 

major  componentes.  Memórias  do  Instituto 



Oswaldo Cruz 2010105, 184. [CrossRef] 

32

 



Siqueira,  C.  A.  T,;  Oliani,  J.;  Sartoratto,  A.; 

Queiroga,  C.  L.;  Moreno,  P.  R.  H.;  Reimão,  J. 

Q.; Tempone, A. G.; Fischer, D. C. H. Chemical 

constituents of the volatile oil from leaves of 



Annona  coriácea  and  in  vitro  antiprotozoal 

activity.  Revista  Brasileira  de  Farmacognosia 



201121, 33. [CrossRef] 

33

 



Borges,  A.  R.;  Aires,  J.  R.  A.;  Higino,  T.  M. 

M.;  Medeiros,  M.  G.  F.;  Citó,  A.  M.  G.  L.; 

Lopes,  J.  A.  D.;  Figueiredo,  R.  C.  B.  Q. 

Trypanocidal  and  cytotoxic  activities  of 

essential  oils  from  medicinal  plants  of 

northeast of Brazil. Experimental Parasitology 



2012132, 123. [CrossRef] 

34

 Magalhães, 

L. 


G.; 

Souza, 


J. 

M.; 


Wakabayashi,  K.  A.  L.;  Laurentiz,  R.  S.; 

Vinholis, A. H. C.; Rezende, K. C. S.; Símaro, G. 

V.; Bastos, J. K.; Rodrigues, V.; Ferreira, D. S.; 

Crotti, A. E. M.; Cunha, W. R.; Silva, M. L. A. In



 

 

Carneiro, N. S. et al. 



 

 

 



1392 

Rev. Virtual Quim. |Vol 9|  |No. 3|  |1381-1392| 

 

vitro  efficacy  of  the  essential  oil  essential  oil 

of  Piper  cubeba  L.  (Piperaceae)  against 

Schistosoma  mansoni.  Parasitology  Research 

2012110, 1747. [CrossRef] 

35

 



Marreiro,  R.  O.;  Bandeira,  M.  F.  C.  L.; 

Almeida, M. C.; Coelho, C. N.; Venâncio, G. N.; 

Conde, N. C. O. Avaliação da citotoxicidade de 

um  enxaguatório  bucal  contendo  extrato  de 



Libidibia férreaBrazilian Research in Pediatric 

Dentistry  and  Integrated  Clinic  2014,  14,  34. 

[CrossRef] 

36

 

Alves,  R.  T.;  Regasini,  L.  O.;  Funari,  C.  S.; 



Young,  M.  C.  M.;  Rimoldi,  A.;  Bolzani,  V.  S; 

Silva,  D.  H.  S.;  Albuquerque,  S.;  Rosa,  J.  A. 

Trypanocidal  activity  of  Brazilian  plants 

against epimastigote forms from Y and Bolivia 

strains  of  Trypanosoma  cruzi.  Revista 

Brasileira  de  Farmacognosia  2012,  22,  528. 

[CrossRef] 

37

 

Estevam, E. B. B.; Silva, E. M.; Miranda, M. 



L.  D.;  Alves,  J.  M.;  Pereira,  P.  S.;  Silva,  F.  G.; 

Esperandim,  V.  R.;  Martins,  C.  H.  G.; 

Ambrosio,  M.  A.  L.  V.; Tófoli, D.;  Junior, L.  R. 

A.;  Alves,  C.  C.  F.  Avaliação  das  atividades 

antibacteriana,  tripanocida  e  citotóxica  do 

extrato 


hidroalcoólico 

das 


raízes 

de 


Tradescantia  sillamontana  Matuda  (Veludo 

Branco)  (Commelinaceae).  Revista  Brasileira 



de  Plantas  Medicinais  2016,  18,  415. 

[CrossRef] 



 

Document Outline

  • Abstract
  • Resumo
  • 1. Introdução
  • 2. Parte Experimental
  • 3. Resultados e Discussão
  • 4. Conclusão
  • Referências Bibliográficas


Поделитесь с Вашими друзьями:


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2019
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə