S h o rt c o n t r I b u t I o n

---

Appl Microbiol Biotechnol (2004) 63: 564

–566

DOI 10.1007/s00253-003-1453-x

S H O RT C O N T R I B U T I O N

R. Haas . O. Tsivunchyk . K. Steinbach . E. v. Löw .

K. Scheibner . M. Hofrichter

Conversion of adamsite (phenarsarzin chloride)

by fungal manganese peroxidase

Received: 4 July 2003 / Revised: 11 August 2003 / Accepted: 7 September 2003 / Published online: 16 October 2003

# Springer-Verlag 2003

Abstract Fungal manganese peroxidase was found to

convert the persistent chemical warfare agent adamsite

(phenarsarzin chloride) in a cell-free reaction mixture

containing sodium malonate, Mn

2+

ions, and reduced

glutathione. The organo-arsenical compound disappeared

completely within 48 h accompanied by the formation of a

more polar metabolite with a clearly modified UV

spectrum. Thus, As(III) in the adamsite molecule was

oxidized by manganese peroxidase to As(V) which added

dioxygen and released chloride.

Introduction

Organo-arsenical compounds are highly poisonous (blis-

tering agents) and were produced as chemical warfare

agents (CWA) by several countries (Franke et al.

1994

).

Some of these compounds

—above all aromatic derivatives

such as Pfiffikus (phenylarsin chloride) or Clark (diphe-

nylarsin chloride)

—are persistent in the environment and

thus have been found in former production, assembly, and

storage sites of CWA.

There are only a few reports dealing with the biological

conversion of organo-arsenical compounds. The bacterial

hydrolysis of Lewisite I has been shown to yield 2-

chloroarsinoxide which is a less toxic metabolite (Mulbry

and Rainina

1998

). We have recently demonstrated that

the fungal enzyme manganese peroxidase (Mn peroxidase)

is capable of converting several organo-arsenical CWA in

a cell-free reaction system comprising manganese ions

(Mn

2+

), sodium malonate, and reduced glutathione (GSH)

(Haas et al.

2003

).

Mn peroxidase is thought to be a key enzyme in the

biodegradation of lignin by higher fungi (basidiomycetes),

which secrete the biocatalyst into their microenvironment

(Hatakka

2001

, Hofrichter

2002

). There, Mn peroxidase

oxidizes Mn

2+

, which is ubiquitous in all lignocelluloses

and soils, into highly reactive Mn

3+

. The latter is stabilized

by organic acids (e.g. oxalate), also secreted by fungi, via

the formation of chelate complexes, which are small

enough to diffuse into the tight lignocellulosic complex.

Mn

3+

-chelates act in turn as low-molecular-mass redox

mediators which oxidize aromatic lignin moieties (War-

iishi et al.

1992

). In addition to lignin, the Mn peroxidase

system also attacks other persistent organic substances,

including several organopollutants, e.g. nitro- and haloaro-

matic compounds as well as polycyclic aromatic hydro-

carbons (PAH) (Collins and Dobson

1996

, Hofrichter et al.

1998

, VanAken et al.

1999

).

In the present study, we report on the conversion of

phenarsazin chloride (adamsite)

—a particularly recalci-

trant aromatic CWA

—by isolated Mn peroxidase. Since

this compound cannot be analyzed by the standard

R. Haas (

*)

Office of Environmental Investigation and Research,

Stadtwaldstrasse 45a,

35037 Marburg, Germany

e-mail: [e-mail]

O. Tsivunchyk

Yanka Kupala, Grodno State University,

Ozheshko Ulica 22,

230023 Grodno, Republic of Belarus

K. Steinbach

Department of Chemistry, Philipps University of Marburg,

Hans-Meerwein-Str.,

35037 Marburg, Germany

O. Tsivunchyk . E. v. Löw

Institute of Immunology, Philipps University of Marburg,

Pilgrimstein 2,

35037 Marburg, Germany

K. Scheibner

JenaBios GmbH,

Löbstedter Strasse 78,

07749 Jena, Germany

M. Hofrichter

Unit of Environmental Biotechnology, International Graduate

School Zittau,

Markt 23,

02763 Zittau, Germany

---

gaschromatographic method (Haas et al.

1998

), a specific

HPLC method has been developed.

Material and methods

Enzyme and reagents

Manganese peroxidase (Mn peroxidase) from the South American

sulfur tuft Nematoloma (Hypholoma) frowardii was obtained from

JenaBios (Jena, Germany) as freeze-dried powder and dissolved in

water prior to use. Mn peroxidase activity was measured by

following the formation of Mn

3+

-malonate complexes at 270 nm

(

ε

270

=11.53 mM

−1

cm

−1

; Wariishi et al.

1992

). Glutathione (GSH),

malonic acid, and manganese chloride (MnCl

2

·4 H

2

O) were

purchased from Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen, Germany).

Adamsite was a gift from the Hazard Control GmbH (Versuchsfeld

Trauen, Faßberg, Germany).

Reaction mixture

The cell-free reaction solution consisted of sodium malonate

(50 mM, pH 4.5), MnCl

2

(2 mM), GSH (5 mM), methanol p.a.

(17.5 vol. %, to dissolve the organo-arsenical compunds), adamsite

(382.3 µM=90 mg l

−1

) and Mn peroxidase (3 U ml

−1

). The reaction

was carried out in 20-ml vials containing 5.7 ml of the reaction

solution at 24°C without shaking or stirring. Samples containing the

same reaction mixture, but lacking Mn peroxidase, served as

controls. All experiments were done in duplicate. After 2, 4, 8, 24,

48, 72 and 144 h, samples (0.5 ml) were taken from the reaction

solution, mixed with 0.5 ml methanol, transferred into 1.4-ml HPLC

vials, and stored at

−20°C until analysis.

In a control experiment, we checked whether methanol stopped

the enzymatic reaction. This was necessary because each HPLC

analysis lasted 75 min and the vials were stored in the auto-sampler

for up to 20 h prior to measurement. Thus, 1 h after starting the

reaction, two control vials containing the complete reaction solution

were mixed with methanol to give a final concentration of 50 vol.%.

The adamsite concentration was measured in these samples after 2,

24, 36 and 48 h. A second control experiment was done under the

conditions described above but using heat-inactivated Mn peroxi-

dase (boiled for 10 min).

High performance liquid chromatography

A specific HPLC method was developed for the detection of

adamsite and its metabolite. A Gynkotek HPLC system (Germering,

Germany) consisting of following components was used: M 480

pump, GT-103 degaser, GINA 50 autosampler, UVD 340-S diode

array detector (2 nm spectral resolution) and a Gynkosoft V 5.50

data acquisition and controlling system. The system was equipped

with a Nucleosil 120 RP-18 column (5 µm, 3×250 mm, with

precolumn 3×10 mm; Fa. Macherey-Nagel, Düren, Germany),

which was adjusted to 20°C with a STH 585 column oven.

Separations were run using a stepwise gradient of 20

–100%

methanol [20% (0 min), 20

–80% (45 min), 80–100% (1 min),

100% (20 min)] in deionized water with a constant flow rate of

0.5 min/min. Eluted substances were detected at 210 and 230 nm;

UV spectra were recorded in a range from 190 to 400 nm.

HPLC-MS analyses for the identification of the adamsite

metabolite were done under the same HPLC conditions, but using

a mass spectrometric coupling (with the electrospray method) for the

detection (TSQ 700, Finnigan MAT, Bremen, Deutschland).

Results

Mn peroxidase rapidly converted adamsite in the reaction

solution (Fig.

1

). About 45% of the initial adamsite

disappeared within the first hour of incubation and 23 h

later, more than 95% of the compound was converted;

after 48 h, only traces of adamsite (<0.1 mg l

−1

) were still

detectable. Controls without Mn peroxidase did not show

any decrease in the adamsite concentration throughout the

entire experiment (144 h). Simultaneous with the disap-

pearance of adamsite, a polar metabolite was formed in

Mn-peroxidase-containing samples that eluted earlier than

adamsite (Fig.

2

). The possible metabolite was colorless

but its UV spectrum showed some changes in spectral

behavior relative to the original adamsite (Fig.

3

). Thus,

the metabolite lost the absorption maximum at 350 nm and

showed only a shoulder in the range between 320 and

350 nm. In addition, the three other absorption maxima of

the original adamsite (at 306, 280, and 228 nm) were

shifted towards shorter wavelengths (303, 273, and

218 nm, respectively) (Fig.

3

).

Both control experiments showed that the reaction was

enzymatic. Heat-inactivated Mn peroxidase did not

convert adamsite and the reaction stopped after the

addition of methanol (50 vol. %); the concentration of

both adamsite and the formed metabolite remained stable

in this methanolic solution over a period of at least 48 h.

This finding confirms the earlier observation that methanol

or other organic solvents (e.g. acetonitrile, N,N-dimethyl-

formamide) at a concentration of 50 vol. % completely

inhibit the activity of Mn peroxidase (Hofrichter 1999,

unpublished result).

Additional investigations with coupled HPLC-MS did

not result in interpretable mass spectra of the adamsite

metabolite, which may be attributed to its high polarity.

565

Fig. 1 Time course of the disappearance of adamsite (circles) and

the formation of a polar metabolite (diamonds) in an enzymatic

reaction mixture containing manganese peroxidase, sodium mal-

onate, MnCl

2

, glutathione and H

2

O

2

. IU HPLC integration units.

Experiments were carried out in duplicate; the standard deviation

was <5%

---

566

Discussion

The fungal enzyme Mn peroxidase was found to be

capable of converting the organo-arsenical CWA adamsite

in vitro. The conversion resulted in the formation of a

stable, polar metabolite with a clearly modified UV

spectrum.

The metabolite formed in the course of the conversion

of adamsite showed a considerably shorter retention time

of 8.5 min in the HPLC elution profile than the original

compound, i.e. the metabolite possesses a noticeably

higher polarity. Although the UV spectrum of the

metabolite was changed, it was still similar to that of

adamsite. Thus, the incorporation of polar groups (e.g. of a

phenolic hydroxyl groups) into the aromatic ring system of

the molecule can be ruled out, since otherwise more

drastic changes in the spectrum would be expected.

Instead, we propose that the trivalent arsenic [As(III)] in

the adamsite molecule was oxidized by Mn peroxidase

into As(V) resulting in the spontaneous release of chloride

and the incorporation of dioxygen. A similar reaction has

been reported for the oxidation of other organo-arsenical

CWA by concentrated peroxides (e.g. H

2

O

2

) (Franke et al.

1994

).

The present results confirm our previous findings that

fungal Mn peroxidase is a potent biocatalyst to convert

hazardous organopollutants (Fritsche et al.

2000

). Future

studies will need to clarify whether this enzymatic system

reduces the acute toxicity of organo-arsenical compounds

and can be applied to removing CWA from the environ-

ment (Pointing

2001

).

References

Collins PJ, Dobson ADW (1996) Oxidation of fluorene and

phenanthrene by Mn(II) dependent peroxidase activity in

whole cultures of Trametes (Coriolus) versicolor. Biotechnol

Lett 18:801

–804

Franke S, Koehler KF, Zaddach H (1994) Chemie der Kampfstoffe.

Munster

Fritsche W, Scheibner K, Herre A, Hofrichter M (2000) Fungal

degradation of explosives: TNT and related nitroaromatic

compounds. In: Spain JC, Hughes JB, Knackmuss H-J (eds)

Nitroaromatic compounds and explosives. Lewis, Boca Raton,

Florida, pp 213

–237

Haas, R, Krippendorf A, Schmidt TC, Steinbach K, v.Löw E (1998)

Chemisch-analytische Untersuchung von Arsenkampfstoffen

und ihren Metaboliten. UWSF

—Z. Umweltchem Ökotox

10:289

–293

Haas R, Scheibner K, Hofrichter M (2003) Enzymatische Umset-

zung von Arsenkampfstoffen durch das Pilzenzym Mangan-

Peroxidase. UWSF

—Z. Umweltchem Oekotox, in press

Hatakka A (2001) Biodegradation of lignin, In: Hofrichter M,

Steinbüchel A (eds) Biopolymers, vol 1. Lignin, humic

substances and coal. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, pp

129

–180

Hofrichter M. (2002) Review: lignin conversion by manganese

peroxidase (Mn peroxidase). Enzyme Microb Technol 30:454

–

466

Hofrichter M, Scheibner K, Schneegaß I, Fritsche W (1998)

Enzymatic combustion of aromatic and aliphatic compounds

by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii. Appl

Environ Microbiol 64:399

–404

Mulbry W, Rainina E (1998) Biodegradation of chemical warfare

agents. ASM News 64:325

–331

Pointing SB (2001) Feasibility of bioremediation by white-rot fungi.

Appl Microbiol Biotechnol 57:20

–33

VanAken B, Godefroid LM, Peres CM, Naveau H, Agathos SN

(1999) Mineralization of

14

C-U-ring labeled 4-hydroxylamino-

2,6-dinitrotoluene by manganese-dependent peroxidase of the

white-rot basidiomycete Phlebia radiata. J Biotechnol 68:159–

169

Wariishi H, Valli K, Gold MH (1992) Manganese(II) oxidation by

manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete

chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelator. J Biol

Chem 267:23688

–95

Fig. 2 HPLC elution profiles of the adamsite-containing reaction

solution after 0, 8 and 24 h of incubation at 24°C. As the

concentration of adamsite declined, that of a more polar metabolite

increased accordingly

Fig. 3 UV spectra of the original adamsite (dotted line) and the

metabolite formed as the result of manganese peroxidase activity

(solid line)

---

Document Outline

• Sec1
• Sec2
• Sec3
• Sec4
• Sec5
• Sec6
• Fig1
• Sec7
• Bib1
• CR1
• CR2
• CR3
• CR4
• CR5
• CR6
• CR7
• CR8
• CR9
• CR10
• CR11
• CR12
• Fig2
• Fig3