Specimen collection and handling



Yüklə 42.36 Kb.
PDF просмотр
tarix03.07.2017
ölçüsü42.36 Kb.

www.BioTechniques.com

351


Vol. 48 | No. 3 | 2010

Benchmarks

Specimen collection 

and handling

Forty-five plant specimens representing 

45 different species were collected at the 

University  of  Guelph.  A  0.5-mm  leaf 

tissue sample from each plant was placed 

in  a  2-mL  Eppendorf  tube  (Cat.  no. 

RN2005-GMT;  DOT  Scientific  Inc., 

Burton, MI, USA ) containing 95% ethanol. 

Twenty-five insect specimens representing 

12 species of Trichoptera (caddisflies) and 

Ephemeroptera (mayflies) were collected 

by UV-light trapping from Elora, Ontario, 

Canada. Each individual insect was placed 

in a 2-mL Eppendorf tube containing 95% 

ethanol. Seven older ethanol preserved 

specimens were selected from the archival 

material at the Biodiversity Institute of 

Ontario.

PCR and sequencing 

conditions

Twenty-five–microliter  PCR  reactions  

were composed of 0.5 µL dNTPs (10mM),  

2.5 µL 10× Invitrogen PCR Buffer (200 

mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.4), 1 µL 

50 mM MgCl

2

, 0.5 µL 10 µM each primer 



(Supplementary Table 2), 0.5 µL Invit-

rogen’s Platinum 

Taq DNA polymerase 

(5 U/µL) and 2 µL DNA. Amplification 

was performed for 35 cycles using Eppen-

dorf’s Mastercycler epgradient S thermal-

cycler (Supplementary Table 3). Amplicons 

were  visualized  electrophoretically  on 

an agarose gel. Two microliters of each 

amplicon were subsequently used directly 

for  Sanger  sequencing  using  Applied 

Biosystems’s BigDye Terminator chemistry 

V3.1 (Foster City, CA, USA). Sequencing 

reactions were cleaned using EdgeBio’s 

AutoDTR96 (Gaithersburg, MD, USA) 

and visualized on an ABI 3730xl sequencer 

(Applied Biosystems).

Supplementary Material For:

Direct PCR amplification and 

sequencing of specimens’ DNA from 

preservative ethanol

Shadi Shokralla, Gregory A. C. Singer, and Mehrdad Hajibabaei

Biodiversity Institute of Ontario, Department of Integrative Biology, 

University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada

BioTechniques 48:233-234 (March 2010) doi 10.2144/000113362 

Keywords: DNA extraction; sample preparation; biodiversity; DNA barcoding; museum samples



www.BioTechniques.com

352


Vol. 48 | No. 3 | 2010

Benchmarks



Supplementary Table S1. Freshly collected and old specimens of plant and animal species used for direct PCR and subsequent sequencing of 

different target genes from 95% ethanol preservative. The age of the older animal specimens is indicated in parentheses.

Fresh plant specimens

Specimen #

PCR & sequencing

Acer negundo

ANG09–09

rbcL


Acer saccharinum

ANG26–09


rbcL

Agrimonia striata

ANG16–09

rbcL


Alium Spp

ANG12–09


rbcL

Alliaria petiolata

ANG01–09

rbcL


Buxus sempervirens

ANG19–09


rbcL

Caragana pygmaea

ANG32–09

rbcL


Cardamine hirsuta

ANG45–09


rbcL

Cerastium vulgatum

ANG24–09

rbcL


Chaenomeles japonica

ANG43–09


rbcL

Chelidonium majus

ANG11–09

rbcL


Cornus stolonifera

ANG17–09


rbcL

Daucus carota

ANG08–09

rbcL


Deutzia gracilis

ANG42–09


rbcL

Erythronium americanum

ANG13–09

rbcL


Euonimus europaea

ANG35–09


rbcL

Euonimus sachalinensis

ANG34–09

rbcL


Forzicija europaea

ANG37–09


rbcL

Genista tinctoria

ANG31–09

rbcL


Geum urbanum

ANG10–09


rbcL

Iris versicolor

ANG39–09

rbcL


Lamium purpureum

ANG02–09


rbcL

Ligustrum vulgare

ANG38–09

rbcL


Linaria vulgaris

ANG22–09


rbcL

Liriodendron tulipifera

ANG29–09

rbcL


Magnolia cobus

ANG28–09


rbcL

Malva neglecta

ANG21–09

rbcL


Plantago major

ANG04–09


rbcL

Potentilla simplex

ANG03–09

rbcL


Potentilla sterilis

ANG20–09


rbcL

Prunella vulgaris

ANG07–09

rbcL


Prunus serotina

ANG40–09


rbcL

Prunus virginiana

ANG30–09

rbcL


Ranunculus repens

ANG25–09


rbcL

Rhus aromatica

ANG41–09

rbcL


Ribes uva-crispa

ANG14–09


rbcL

Salix purpurea

ANG18–09

rbcL


Stellaria media

ANG44–09


rbcL

Syringa pekinensis

ANG33–09

rbcL


Taraxacum officinale

ANG06–09


rbcL

Trifolium repens

ANG05–09

rbcL


Trillium grandiflorum

ANG15–09


rbcL

Verbascum thapsus

ANG23–09

rbcL


Vinca major

ANG27–09


rbcL

Xanthocarpos sorbifolium

ANG36–09

rbcL


rbcL: large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase; CO1: cytochrome c oxidase 1; 28S rDNA: large subunit of nuclear ribosomal DNA

www.BioTechniques.com

353


Vol. 48 | No. 3 | 2010

Benchmarks



Supplementary Table S1 (continued). Freshly collected and old specimens of plant and animal species used for direct PCR and subsequent 

sequencing of different target genes from 95% ethanol preservative. The age of the older animal specimens are indicated in the parentheses.

Fresh animal specimens

Ephemeroptera (mayflies)

Leucrocuta jewetti

EPH10–09

CO1, 28S rDNA

Leucrocuta jewetti

EPH17–09


CO1, 28S rDNA

Maccaffertium modestum

EPH05–09

CO1, 28S rDNA

Maccaffertium modestum

EPH14–09


CO1, 28S rDNA

Trichoptera (caddisflies)

Ceratopsyche bronta

TRI13–09

CO1, 28S rDNA

Ceratopsyche bronta

TRI19–09


CO1, 28S rDNA

Ceratopsyche sparna

TRI04–09

CO1, 28S rDNA

Ceratopsyche sparna

TRI23–09


CO1, 28S rDNA

Ceratopsyche Spp

TRI08–09

CO1


Ceratopsyche Spp

TRI20–09


CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche campyla

TRI12–09

CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche campyla

TRI24–09


CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche Spp

TRI01–09

CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche Spp

TRI09–09


CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche Spp

TRI16–09

CO1, 28S rDNA

Cheumatopsyche Spp

TRI18–09


CO1, 28S rDNA

Chimarra obscura

TRI07–09

CO1, 28S rDNA

Chimarra obscura

TRI11–09


CO1, 28S rDNA

Chimarra obscura

TRI21–09

CO1, 28S rDNA

Chimarra Spp

TRI03–09


CO1, 28S rDNA

Chimarra Spp

TRI25–09

CO1, 28S rDNA

Polycentropus cinereus

TRI15–09


CO1, 28S rDNA

Protoptila maculata

TRI06–09

CO1, 28S rDNA

Psychomyia flavida

TRI02–09


CO1, 28S rDNA

Psychomyia flavida

TRI22–09

CO1, 28S rDNA



Older animal specimens

Glassiphonia spp. (10 years)

PAAN3

CO1


Onisimus litoralis (10 years)

PLAM17


CO1

Cicada centipede (7 years)

MARTH7

CO1


Lepeophteirus salmanis (8 years)

PACO2


CO1

Buthidae spp. (7 years)

MARTH3

CO1


Onisimus litoralis (9 years)

PLAM10


CO1

Sylon hippolytes (7 years)

PABA2

CO1


rbcL: large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase; CO1: cytochrome c oxidase 1; 28S rDNA: large subunit of nuclear ribosomal DNA

www.BioTechniques.com

354


Vol. 48 | No. 3 | 2010

Benchmarks



Supplementary Table S2. Primers used for PCR amplification of various genes from different specimens

Sample

Gene

Primer code and sequence (5

-3)



Reference

Mescal liquid

CO1 (130-base, mini-barcode)

LepF-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG

UnivR-GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC

5, 7


Plants

rbcL


rbcLaF-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC

rbcLaR-GTAAAATCAAGTCCACCRCG

9

Caterpillar in mescal and other animals



CO1 (658 base, barcode)

LCO1490-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

HCO2198-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

6

28S rDNA



Mo6-CCCCCTGAATTTAAGCATAT

D3B-TCGGAAGGAACCAGCTACTA

8

Supplementary Table S3. PCR amplification regime used for each gene

Gene

Initial denaturation

Repeat 35 cycles

Final extension

Denaturation

Annealing

Extension

CO1


46°C / 60 s

72°C / 30 s

28S rDNA

95°C / 2 min

94°C / 30 s

58°C / 45 s

72°C / 90 s

72°C / 5 min



rbcL

55°C / 30 s



72°C / 60 s


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2016
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə