Thermodynamic, kinetic and structural basis for recognition and repair of abasic sites in

A
B
Figure 1. (a) Dependencies of the initial rate of APE1-catalyzed cleavage of
[
3
H]AP DNA (3.5 U A
260
/ml) on the concentration of ss d(pA)
10
(1) and ss
d[(pT)
7
pR(pT)
6
] (2). The activity of APE1 in the absence of inhibitors was
taken as 100%. (b) Lineweaver–Burk plot of the dependence of the initial
rate of APE1-catalyzed accumulation of the acid-soluble short [
3
H]DNA
product on the concentration of [
3
H]AP DNA at different concentrations of
d(pT)
10
: 0
mM (1), 1.6 mM (2) and 7.8 mM (3) d(pT)
10
.
5136
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 17
Downloaded from https://academic.oup.com/nar/article/32/17/5134/1334164 by guest on 16 February 2023

---

Additive interaction of APE1 with nucleotide units of
deoxyribooligonucleotides
The formation of the primary complex between APE1 and
DNA was analyzed using the SILC approach (6,7). The
Gibbs free energy characterizing complex formation can be
expressed as a sum of the
DG


values for individual contacts
(40,41):
DG


= DG


1
+ DG


2
+    + DG


n
, where
DG


i
= RT ln
K
d
i
,
K
d
i
indicating the contribution of an individual contact.
Hence, the overall
K
d
value characterizing the complex
formation is the product of the
K
d
values for all individual
contacts:
DG


= RTlnK
d
= RTln K
d1
· K
d2
·    · K
d
n
½

K
d
= K
d1
· K
d2
·    · K
d
n
:
Interactions between APE1 and DNA were found to be
additive not only at the level of individual strands of the
duplex but also at the level of individual units of a long
DNA. Table 1 shows that the minimal ligands of APE1 are
orthophosphate (P
i
;
K
I
= 360 mM) and deoxynucleotide mono-
phosphates (dNMPs) (
K
I
165 mM). Thus, dNMPs interact
with the active center of APE1 recognizing free nucleotides
through both nucleoside and phosphate groups, with the latter
making the major contribution.
To assess the additivity of APE1 interactions with ODNs,
the data in Table 1 were analyzed as logarithmic dependencies
of
K
I
(or
K
d
= K
I
) for d(pN)
n
versus the number of mononu-
cleotide units
n (Figure 2A). The linear log-dependencies for
ss d(pN)
n
(1 <
n < 10) provide evidence of the additivity of
DG


for the interaction of 9–10 individual d(pN)
n
units with
APE1. This number of nucleotide units of ss d(pN)
n
interacting
within the globule of APE1 agrees well with previously pub-
lished results that are characteristic of APE1 (43,44) and other
DNA-binding enzymes of 30–40 kDa (6,7,31).
Values of
f, the increase in APE1 affinity for various d(pN)
n
for a unit increase in their length, were evaluated from the
slopes of the linear parts of these curves [Figure 2A;
f(d(pC)
n
)
= 1.53, f(d(pT)
n
)
= 1.58, f(d(pG)
n
)
= 1.62,
f(d(pA)
n
)
= 1.66]. The monotonic increase in K
d
, reflecting
interactions between the enzyme and one unit of ss DNA,
equals the reciprocal of the
f factor (K
I
= 1/f = 0.60–65 M).
Thus, the
K
I
values characterizing the affinity of the APE1
active center for nonspecific dNMPs (165
mM) are 3.6–
3.9
· 10
3
-fold lower than the
K
I
(0.60–0.65 M) characterizing
the enzyme interaction with any of the additional 8–9 nt of an
extended ODN. The interaction of APE1 with all units of
homo-d(pN)
n
is additive and the
K
d
(or
K
I
) values for any
ODN can be obtained by multiplying
K
d
for the minimal
ligand (dNMP) with
K
d
= 1/f for each of the mononucleotide
units:
K
d
pN
ð
Þ
n


= K
d
dNMP
ð
Þ
½
 · 1=f
½

n
1
1 <
n < 10
ð
Þ:
Uracil DNA glycosylase (UDG) (28), Topo I (32,33) and the
template-binding sites of many DNA polymerases (24,25,45)
interact with DNA not only through weak electrostatic
Table 1. Affinity of APN for minimal ligands, their derivatives, ss and ds homo-deoxy ODNs
a
Ligand
IC
50
(
mM)
K
I
(
mM)
b
Ligand
IC
50
(
mM)
K
I
(
mM)
b
Ligand
IC
50
(
mM)
K
I
(
mM)
b
NaH
2
PO
4
1080
360
D-ribose
>0.5 M
>0.17 M
d(pR)
75
25
dAMP
495
165
dTMP
490
163.3
dCMP
490
163.3
Interlink phosphate (calculated)
N/A
100 or 264
c
d(pF)
177
59.0
dGMP
500
166.6
ss ODNs
d(pA)
2
150
50
d(pT)
2
350
116.6
d(pC)
2
420
140
d(pT)
3
200
66.7
d(pC)
3
180
60
d(pA)
4
100
33.3
d(pT)
4
135
45
d(pC)
5
65
21.7
d(pA)
6
51.6
17.2
d(pT)
6
74
24.6
d(pC)
7
30
10
d(pA)
8
7.5
2.5
d(pT)
8
25
8.3
d(pC)
9
14
4.7
d(pA)
10
5.0
1.66
d(pT)
10
7.5
2.5
d(pC)
10
10
3.33
d(pT)
11
7.5
2.5
d(pC)
11
10
3.33
d(pA)
12
5.4
1.7
d(pT)
12
7.5
2.5
d(pC)
13
10
3.33
d(pA)
14
5.3
1.7
d(pT)
14
7.5
2.5
d(pT)
15
7.7
2.57
d(pA)
16
5.1
1.66
d[(pF)
3
pT]
34
11.7
d(pG)
2
306
102
d[(pF)
5
pT]
15.6
5.2
d(pG)
4
115
38.3
d[(pF)
7
pT]
6.9
2.3
d(pG)
6
43
14.4
d[(pF)
9
pT]
3.0
1.0
d(pG)
8
16.3
5.4
ds ODNs
d(pA)
2
 d(pT)
2
110
36.6
d(pA)
8
 d(pT)
8
28.0
9.3
d(pA)
14
 d(pT)
14
1.0
0.33
d(pA)
4
 d(pT)
4
80
26.6
d(pA)
10
 d(pT)
10
1.0
0.33
d(pA)
16
 d(pT)
16
1.0
0.33
d(pA)
6
 d(pT)
6
35.5
11.8
d(pA)
12
 d(pT)
12
1.1
0.36
d(pA)
20
 d(pT)
20
1.0
0.33
N/A, not applicable.
a
Standard error in experimentally determined
K
I
and IC
50
values was 10–30%; mean of three to four measurements are given.
b
K
I
values shown in bold were determined directly, others were calculated from the respective IC
50
values.
c
K
I
values for internucleotide phosphates were calculated from the log-dependencies for d(pN)
n
(264 mM) and for d[(pF)
n
pT] (100 mM) by extrapolation of the lines to
n
= 0 (Figure 1).
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 17
5137
Downloaded from https://academic.oup.com/nar/article/32/17/5134/1334164 by guest on 16 February 2023

---

interactions with internucleotide phosphates but also through
weak hydrophobic or van der Waals interactions with nucleo-
bases. However, the affinities of other enzymes, such as Fpg
(30,31) or EcoRI (27), for any d(pN)
n
does not depend on the
relative hydrophobicity of the nucleobases, indicating that
these enzymes essentially do not contact the DNA bases
but mainly interact with the sugar–phosphate backbone. In
the case of APE1, the increase in affinity for d(pN)
n
proceeds
along with the increase in the relative hydrophobicity of the
bases (C
< T < G < A, cf. the respective f values above).
Extrapolation of the dependencies of log
f versus the relative
hydrophobicity of the bases to zero hydrophobicity gives an
Table 2. Affinity of APE1 for hetero-deoxy ODNs and their duplexes
a
Code
Sequence
K
I
(exp.) (
mM)
b
K
I
(calc.) (
mM)
c
K
I
(ss):
K
I
(ds)
K
I
(specific):
K
I
(nonspecific)
Nonspecific ss heterooligonucleotides
ss dp(CTCCCTTCCT)
3.1
– 0.3
3.3
– 0.3
N/A
N/A
ss dp(CTCACACACT)
2.6
– 0.3
2.9
– 0.3
N/A
N/A
ss dp(GAAGAGAAGA)
2.2
– 0.4
1.9
– 0.2
N/A
N/A
ss dp(
CTAGTCA A CA)
d
2.6
– 0.3
2.4
– 0.3
N/A
N/A
Nonspecific and specific ss and ds homo-ODNs containing one irregular nucleotide
14C8
ss d[(pT)
7
pC(pT)
6
]
2.5
– 0.3
2.6
– 0.3
3.0
ds d[(pT)
7
pC(pT)
6
]
d(pA)
14
0.83
– 0.1
N/D
14G8
ss d[(pT)
7
pG(pT)
6
]
3.0
– 0.3
2.6
– 0.3
2.0
ss/ss
= 6.4–7.7
ds d[(pT)
7
pG(pT)
6
]
d(pA)
14
1.5
– 0.2
N/D
ds/ds
= 6.4–11.5
14R8
ss d[(pT)
7
pR(pT)
6
]
0.39
– 0.2
0.38
– 0.4
3.0
ds d[(pT)
7
pR(pT)
6
]
d(pA)
14
0.13
– 0.15
N/D
ss/ss
= 5.0–6.0
14F8
ss d[(pT)
7
pF(pT)
6
]
0.5
– 0.1
N/D
3.0
ds/ds
= 2.0
ds d[(pT)
7
pF(pT)
6
]
d(pA)14
0.16
– 0.03
N/D
Nonspecific and specific ss and ds heterooligonucleotides
24A8
ss dp(
CTAGTCA A CACTGTCTGTGGATAC)
2.1
– 0.3
2.5
– 0.3
e
4.2
ds dp(
CTAGTCA A CACTGTCTGTGGATAC)
0.5
– 0.1
0.8
– 0.2
f
ss/ss
= 6.0
24R8
ss dp(
CTAGTCA R CACTGTCTGTGGATAC)
0.35
– 0.3
0.39
– 0.3
e
2.7
ds/ds
= 3.8
ds dp(
CTAGTCA R CACTGTCTGTGGATAC)
0.13
– 0.05
0.12
– 0.2
f
N/A, not applicable, N/D, not determined.
a
Mean
– SE of three measurements are given.
b
K
I
values shown in bold were determined directly, others were calculated from the respective IC
50
values.
c
Calculated
K
I
values were estimated from Equation 1 using the following factors:
K
d
[P
i
]
= 264 mM, e = 1.51, h
C
= 1.01, h
T
= 1.05, h
G
= 1.07, h
A
= 1.10.
d
The italicized sequence of the decanucleotide corresponds to the 5
0
-sequence within long oligonucleotides 24A8 and 24R8 (the variable nucleotide in the eighth
position is shown in bold).
e
Since the DNA-binding site of APE1 contains 10 nucleotide-binding subsites,
K
I
values for ss 24A8 and 24R8 were calculated for the decamers GTCAACACTG and
GTCARCACTG, respectively.
f
The
K
I
values for ds 24A8 and ds 24R8 were calculated by simple division of the calculated
K
I
for ss 24A8 and ss 24R8 by an average value of a ratio of
K
I
(ss)/
K
I
(ds)
= 3.0, calculated using six values from this table.
Table 3. Affinities of APE1 for ORNs and their duplexes
a
Ligand
IC
50
(
mM)
a
K
I
(
mM)
Ligand
IC
50
(
mM)
b
K
I
(
mM)
Ligand
IC
50
(
mM)
b
K
I
(
mM)
ss ORNs
AMP
1120
373
UMP
5620
1873
CMP
1340
447
(pA)
2
789
263
(pC)
2
949
316
(pA)
3
597
199
(pA)
4
550
183
(pU)
4
2100
700
(pC)
4
641
214
(pA)
6
300
100
(pU)
6
1129
339
(pC)
6
361
120
(pA)
8
110
36.7
(pU)
8
534
178
(pC)
8
212
70.8
(pA)
9
80.7
26.9
(pU)
9
475
158
(pA)
10
80
26.7
(pU)
10
471
157
(pC)
10
134
44.7
(pA)
12
90
30
(pU)
11
477
159
(pC)
14
114
38
(pA)
16
90
30
(pU)
16
455
158
ds ORNs
(pU)
4
(pA)
4
405
135
(pA)
4
d(pT)
4
22.7
7.59
(pU)
6
(pA)
6
49.8
16.6
(pA)
6
d(pT)
6
64.1
21.4
(pU)
9
(pA)
9
50
16.7
(pA)8
d(pT)
8
18.93
6.3
(pU)
10
(pA)
10
30
10
(pA)
10
d(pT)
10
7.5
2.5
(pA)
11
d(pT)
11
7.5
2.5
(pU)
16
(pA)
16
30
10
(pA)
16
d(pT)
16
7.5
2.5
a
Error in directly determined
K
I
(shown in bold) and IC
50
values was 10–30%; means of three to four measurements are given.
b
K
I
values not in bold were calculated from the respective IC
50
values.
5138
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 17
Downloaded from https://academic.oup.com/nar/article/32/17/5134/1334164 by guest on 16 February 2023

---

estimate of the increase in affinity of enzymes for DNA due to
electrostatic interactions with a single internucleotide phos-
phate group. Consequently, it is termed the electrostatic (
e)
factor (6,7). For APE1 interacting with ss DNA, we found that
e
= 1.51 (Figure 3). As a measure of base hydrophobicity, the
retention time of respective nucleosides during the isocratic
elution from a reverse-phase column was used, as described
previously (46). Given the additive character of interactions of
the structural elements of d(pF) and the bases of d(pN)
n
to the
DNA affinity of APE1, a factor of increase in affinity due to
hydrophobic interactions of the enzyme with a single base
(
h factor) can be estimated as h
= f/e. For APE1, h = 1.01,
1.05, 1.07 and 1.1 for d(pC)
n
, d(pT)
n
, d(pG)
n
and d(pA)
n
,
respectively. Thus, the interaction of APE1 with each nucleo-
tide unit of ss ODNs is a superposition of weak electrostatic
and hydrophobic or van der Waals interactions with the
individual structural elements and can be described as
K
d
d pN
ð
Þ
n


= K
d
P
i
½  · e
n
h
c
C
· h
t
T
· h
g
G
· h
a
A
1
where
K
d
[P
i
] is the
K
d
value for the minimal orthophosphate
ligand, and the numbers of C, T, G and A bases in d(pN)
n
are
c,
t, g and a, respectively. Experimentally measured K
I
values
can be compared with the values calculated using Equation 1
for several hetero-d(pN)
n
(Table 2), and it was found that
experimental and calculated
K
I
values coincide within
experimental error.
Interestingly, this expression describes the interaction of ss
(or ds) DNA with any of the sequence-independent enzymes
investigated so far, as well as the interaction of nonspecific
DNA with most sequence-dependent enzymes (6,7). Different
enzymes differ only in the values of
e and h
N
factors. For
example,
e factors for DNA polymerases and UDG are 1.52
and 1.35, respectively, whereas for Fpg and EcoRI they are
equal to 1 (
h
N
= 1) (24,27,30). APE1 mostly interacts with the
sugar–phosphate backbone of DNA (
e
= 1.51) and its hydro-
phobic or van der Waals interactions with nucleobases are less
significant (
h
= 1.01–1.1).
Interaction of APE1 with the sugar–phosphate backbone
of oligonucleotides
To confirm the predominant interactions of APE1 with the
DNA backbone, and to estimate the contribution of the back-
bone structural units to the formation of weak additive contacts
between APE1 and ODNs, we synthesized abasic oligomers,
d[(pF)
n
pT], where F is a tetrahydrofuran analogue of deoxy-
ribose (Table 1). Since a d(pF) monomer has higher affinity for
the active center of APE1 (
K
I
= 59 mM) than dNMPs (165 mM),
the log-dependence for d[(pF)
n
pT] is shifted upward from
nonspecific d(pN)
n
, but the slope of this line was slightly
lower that that for d(pC)
n
(Figure 2); the factor
f
= 1.50
differs very little from the electrostatic factor
e
= 1.51
found for different homo-d(pN)
n
as described above. Thus,