2015, 4, 662-680; doi: 10. 3390/antiox4040662 antioxidants issn 2076-3921

Yüklə 0,72 Mb.
Pdf görüntüsü
ölçüsü0,72 Mb.
  1   2   3

Antioxidants 20154, 662-680; doi:10.3390/antiox4040662 



ISSN 2076-3921 



Identification and Antioxidant Activity of the Extracts of 

Eugenia uniflora Leaves. Characterization of the  

Anti-Inflammatory Properties of Aqueous Extract on Diabetes 

Expression in an Experimental Model of Spontaneous Type 1 

Diabetes (NOD Mice) 

Nayara Simon Gonzalez Schumacher 


, Talita Cristina Colomeu 


, Daniella de Figueiredo 


Virginia de Campos Carvalho 


, Cinthia Baú Betim Cazarin 


, Marcelo Alexandre Prado 


Laura Maria Molina Meletti 


 and Ricardo de Lima Zollner 



  Laboratory of Translational Immunology, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas,  

Rua Vital Brazil, 300, Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-888 Campinas-SP, Brazil;  

E-Mails: nayaraschumacher@yahoo.com.br (N.S.G.S.); talitacolomeu@yahoo.com.br (T.C.C.); 

daniellafig@gmail.com (D.F.); vi.carvalho28@hotmail.com(V.C.C.) 


  Department of Food and Nutrition, School of Food Engineering, University of Campinas  

(FEA-Unicamp), Rua Monteiro Lobato, 80, Cidade Universitária Zeferino Vaz,  

13083-862 Campinas-SP, Brazil; E-Mails: cinthiabetim@gmail.com (C.B.B.C.); 

marcelo.prado@reitoria.unicamp.br (M.A.P.) 


  Agronomic Institute of Campinas, Theodureto de Almeida Camargo, 1500, Vila Nova,  

13012-970 Campinas-SP, Brazil; E-Mail: lmmm@iac.sp.gov.br 


  Department of Internal Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas, Rua Tessália 

Vieira de Camargo, 126, Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13083-887 Campinas-SP, Brazil 

  These authors contributed equally to this work. 

*  Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: zollner@unicamp.br;  

Tel.: +55-19-3289-3709; Fax: +55-19-3521-8925. 

Academic Editors: Antonio Segura-Carretero and David Arráez-Román 

Received: 17 June 2015 / Accepted: 8 September 2015 / Published: 9 October 2015 


Abstract:  Medical  and  folklore  reports  suggest  that  Eugenia  uniflora  (E.  uniflora)  is  a 

functional food that contains numerous compounds in its composition, with anti-inflammatory, 

antioxidant and anti-diabetic effects. In the present study, we investigated the best solvents 

(water,  ethanol  and  methanol/acetone)  for  extracting  bioactive  compounds  of  E.  uniflora 



Antioxidants 2015




leaves,  assessing  total  phenols  and  the  antioxidant  activity  of  the  extracts  by  

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH),  Ferric  Reducing  Antioxidant  Power  (FRAP),  

2,2′-Azinobis  (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic  acid)  (ABTS)  and  Oxygen  Radical 

Absorbance Capacity (ORAC) assays, identifying hydrolysable tannins and three phenolic 

compounds  (ellagic  acid,  gallic  acid  and  rutin)  present  in  the  leaves.  In  addition,  we 

evaluated the incidence of diabetes, degree of insulitis, serum insulin, hepatic glutathione 

and tolerance test glucose in non-obese diabetic (NOD) mice. Our results suggest that the 

aqueous extract presents antioxidant activity and high total phenols, which were used as a 

type  1  diabetes  mellitus  (DM-1)  treatment  in  NOD  mice.  We  verified  that  the  chronic 

consumption of aqueous extract reduces the inflammatory infiltrate index in pancreatic islets, 

maintaining  serum  insulin  levels  and  hepatic  glutathione,  and  reducing  serum  lipid 

peroxidation as well as the risk for diabetes. 

Keywords: Eugenia uniflora; type 1 diabetes mellitus; NOD mice; antioxidant 


1. Introduction 

The Eugenia L. genus belongs to the family Myrtaceae and has more than 500 species, of which 400 

are native to Brazil and are used as medicinal plants. Eugenia uniflora (E. uniflora), popularly known as 

Surinam cherry, belongs to this genus and is found in regions with tropical and subtropical climates, 

where it is prized for its fruit [1]. Due to the therapeutic activities of E. uniflora tea, made from its leaves, 

this plant has been studied for its effectiveness in treating various diseases and its application in folk 

medicine as an antioxidant, hypotensive, anti-inflammatory and hypoglycemic agent [2]. 

The  main  mechanism  of  action  of  antioxidants  include  radical  scavengers  and  suppressors  that 

neutralize or eliminate reactive oxygen species (ROS)/nitrogen (RNS) and the binding of metal ions, 

which  are  necessary  for  the  production  of  oxidizing  species  [3].  Antioxidants  may  be  classified  as 

endogenous (glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase) and also as exogenous from 

our diet, such as Vitamins A, C and E, minerals and flavonoids, among others [4]. The presence of these 

endogenous or exogenous components may be essential for the complex control of oxidative stress and 

cell damage. Phenolic compounds derived from plant sources are widely studied antioxidant compounds 

and act in the neutralization of free radicals, helping to control the oxidative stress that occurs in the 

pancreatic  islets  of  diabetic  rats  [4].  These  compounds  are  divided  into:  phenolic  acids, 

phenylpropanoids,  flavonoids,  condensed  and  hydrolyzed  tannins  [5,6].  Metabolic  diseases,  such  as 

diabetes mellitus, are characterized by a decrease in endogenous antioxidants in the body, leading to an 

increase  in  free  radicals.  Thus,  dietary  supplementation  with  antioxidant  compounds  (present  in  

E. uniflora leaves) in diabetes may constitute a support strategy for diabetes treatment. 

NOD mice are used as an experimental DM-1 model because they spontaneously develop a similar 

disease to that observed in humans. Diabetes onset in NOD mice starts between the 12th and 24th weeks 

of life. Polydipsia, polyuria, high glycosuria, hyperglycemia and insulin deficiency are observed in these 

animals, accompanied by a rapid loss of weight [7,8]. Among mechanisms proposed to break immune 

tolerance in DM-1, the genetic predisposition of an individual, together with environmental factors such 

Antioxidants 2015




as stress and diet, seems to contribute to the inflammatory autoimmune response. As such, researchers 

continue to search for potential new drugs present in medicinal plants. Thus, the aim of the present work 

was  the  identification  of  phenolic  compounds  with  antioxidant  and  anti-inflammatory  properties  in  

E. uniflora leaf extract, with a view to their use in the treatment of inflammatory diseases, such as type 1 

diabetes mellitus. 

2. Experimental Section 

2.1. Extraction of Phenolic Compounds in the Eugenia uniflora Leaves 

Samples  selected  to  compose  this  project  are  not  on  the  list  of  endangered  species,  according  to 

IBAMA-CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora). 

The identification of samples was performed by the Agronomic Institute of Campinas.  

E.  uniflora  leaves  were  dried  in  a  circulating  air  oven  at  50  °C/48  h,  ground  and  stored  under 

refrigeration at 8 °C, and then submitted to a process for extracting phenolic compounds, using three 

different solvents at the same concentration (0.04 mg/mL), i.e., water, ethanol and methanol/acetone.  

The aqueous extract was prepared using 1 g of sample and 25 mL of water in an autoclave system for  

20 min/121 °C, according to our previous study [9]. The tea made by the process of autoclaving was 

filtered and stored at 8 °C. The ethanol extract was adapted from Spagolla et al. (2009) [10]. One gram 

of sample was suspended in 15 mL of 60% ethanol and maintained for 1 h at 70 °C. The sample was 

filtered, the supernatant suspended in 10 mL of 60% ethanol in the residue and the material was extracted 

again  for  1  hour.  The  sample  was  stored  at  8  °C.  The  preparation  of  methanol/acetone  extract  was 

adapted from Larrauri et al. (1997) [11]. One gram of sample was suspended in 10 mL of 50% methanol 

at  room  temperature  (24  °C),  for  60  min.  The  sample  was  then  centrifuged  at  9948×  g  for  

20  min/22  °C.  The  supernatant  was  added  to  10  mL  of  70%  acetone  for  another  60  min,  at  room 

temperature, and the sample was centrifuged again. The supernatants of the three prepared extracts were 

filtered and stored at 8 °C for further chemical analysis. 

2.2. Chemical Analysis 

2.2.1. Determination of Antioxidant Activity of Extracts 

Extracts  (aqueous,  ethanol  and  methanol/acetone)  of  E.  uniflora  were  submitted  to  four  different 

assays  for  antioxidant  activity  analysis  at  an  initial  concentration  of  0.04  g/mL.  DPPH  radical  

scavenging [12]; capacity to reduce metal iron FRAP [13,14]; inhibition of free radical ABTS [11,15] 

and by peroxyl radical capture ORAC [16]. 

2.2.2. Determination of Total Phenolic Compounds 

Total phenolic compounds in the extracts were determined by the Folin-Ciocalteu method with some 

modifications [17]. Gallic acid was used to construct the standard curve for phenol analysis, varying the 

concentrations  from  0.016  to  0.1  mg/mL.  The  absorbance  was  read  using  a  spectrophotometer 

(Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) at 725 nm, and the results were expressed 

as gallic acid equivalents (GAE mg/g sample). 

Antioxidants 2015




2.2.3. Identification of Hydrolysable Tannins 

The qualitative analysis of tannin was determined by Viana et al. (2012) [18]; 2 mL of each extract 

were added in 5 mL of distilled water and 100 μL of 2% ferric chloride. The presence of tannins was 

determined by the precipitate color and formation, where green precipitates indicate condensed tannins 

and blue hydrolysable tannins. 

The quantification of hydrolysable tannins was determined according to Brune et al. (1992) [19] with 

some  modifications  by  Schons  and  Macedo  et  al.  (2011)  [20],  using  the  ferric  ammonium  reagent  

FAS-reagent.  The  standard  curve  was  performed  using  tannic  acid  (Sigma,  Aldrich,  St.  Louis,  MO, 

USA)  at  concentrations  between  0.01  and  0.4  mg/mL;  after  15  min,  the  absorbance  of  the  reaction 

product was read using a spectrophotometer (Spectramax 190) at 578 nm. Results were expressed as 

tannic acid equivalent (mg of tannic acid/g sample). 

2.3. Chromatographic Analysis (HPLC) 

Validation  methodology  employed  the  external  standards  of  the  Food  Analysis  Laboratory,  

FEA-Unicamp. The extracts were diluted in 80% methanol and additional identification of antioxidant 

flavonoids-gallic acid, vanillic acid, ellagic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, kaempferol, resveratrol, 

quercetin,  catechin,  epicatechin  and  rutin,  were  performed  using  the  standard  stock  solution  

(10  mg/mL  HPLC  grade)  to  obtain  a  5-point  calibration  curve.  The  HPLC  system  used  was  HPLC 

(Agilent Technologies 1100, Santa Clara, CA, USA), coupled to a diode array detector (DAD) (Agilent 

G1315B) with a flow rate of 0.70 mL/min, at room temperature. The chromatographic column used in 

the reversed-phase was the Eclipse XBB-C18 (Agilent Technologies). Detection was performed at 210, 

254, 300 and 340 nm for the identification of phenolic compounds. The mobile phase consisted of 1% 

orthophosphoric acid in ultrapure water (A) and 100% acetonitrile (B). The elution gradient used was as 

follows: 0 min: 95% A and 5% B, 10 min: 75% A and 25% B, 25 min: 60% A and 40% B, followed by 

a linear increase of solvent A until 35 min. Phenolic compounds were identified in the chromatograms 

of the injected samples and compared with the phenolic standards used, with regard to relative retention 

time (RT), peak area percentage and spectral data. 

2.4. Biological Assays: NOD Mice Treatment with E. uniflora Leaves 

2.4.1. Experimental Design 

Female NOD mice used in this study were obtained from the Multidisciplinary Center for Biological 

Research, University of Campinas (Cemib-Unicamp) [21]. Procedures involving animals and their care 

were  conducted  in  accordance  with  guidelines  and  recommendations  established  by  the  Brazilian 

Committee for Animal Experimentation—COBEA (protocol: 2824-1). 

All animals were treated from the 4th until the 26th week of life, and body weight and fasting blood 

glucose levels were monitored weekly, beginning at 10th week of life until the end of the protocol, using 

glucometer strips (Medisense Optium


, Abbott Diabetes Care Inc., Alameda, CA, USA). 

The experimental group consisted of 57 mice fed on a chow diet (Labina-Purina, Paulínia, Brazil) 

kept under specific pathogen free (SPF) conditions, with controlled light, temperature and humidity in 

Antioxidants 2015




the  Laboratory  of  Translational  Immunology  (LTI)  facilities.  The  groups  were  divided  into:  Group 

composed of 27 NOD mice  treated with autoclaved aqueous extract of E. uniflora leaves ad libitum  

(0.06 g/100mL of filtered water standards established by the IC50-DPPH analysis). Based on previous 

trials of antioxidant activity and microbiological control, it was established that the aqueous extract of 

exchanges would offer animals every two days. For each new leaf extract, the DPPH technique was 

performed to determine the concentration to be used. The second experimental group was classified as 

untreated, and composed of 30 NOD mice. Thus, from these groups, a third subgroup was designated as 

the acute diabetic group, and composed of untreated and treated mice that became diabetic during the 

time of protocol study. In addition to the experimental design, another 36 NOD female and 12 BALB/c 

mice (healthy control mice that do not develop diabetes) [22] were used for glucose tolerance test. 

2.4.2. Diagnosis of Acute Diabetes and Animal Sacrifice 

At the end of 26 weeks or mice diabetes onset (blood glucose above 250 mg/dL for two consecutive 

days), the animals were sacrificed by intraperitoneal anesthesia (ketamine hydrochloride: 150mg/kg and 

xylazine hydrochloride: 10mg/kg, both Vetbrands, Paulínia, Brazil) and peripheral blood was collected 

by cardiac puncture for serum separation. Liver was removed and homogenized in 5% trichloroacetic 

acid (TCA) and frozen at −80°C to further analysis of reduced glutathione (GSH). After this procedure, 

the  pancreas  was  removed  and  included  into  capsules  containing  tissue  freezing  medium  (Triangle 

Biomedical  Sciences,  Durham,  NC,  USA),  frozen  in  liquid  nitrogen  and  stored  at  −80  °C  for  

histological analysis. 

2.4.3. Histological Analysis 

The fixed pancreas were submitted to cryosections (Cryostat CM 1850, Leica Biosystems, Wetzlar, 

Germany)  for  morphological  analysis  of  pancreatic  islets  and  insulitis  degree  classification 

(inflammatory cell infiltration). A series of 15 consecutive cuts of 5 μm were placed on silanized slides 

(Methacryl-oxypropyl-Methoxysilane, Sigma). The slide numbers 1, 15, 16, 30, 31 and 45 were stained 

using hematoxylin and eosin technique (HE) and analyzed by optical microscopy (Nikon


 Eclipse 80i, 

Tokyo, Japan) to count pancreatic islets and for classification of the insulitis. 

The analysis of the islets was carried out according to the criteria established by Signori et al. (1989) [23], 

and  adapted  by  Ventura  et  al.  [24],  where  grade  0  is  characterized  by  absence  of  inflammatory  cell 

infiltrate, grade 1 was less than 25%, grade 2 when the islet has a cell infiltration of between 25% and 

80%,  grade 3  represents  higher  than  80%  and  less  than  100%,  while  islets  completely  overtaken  by 

cellular  infiltration  are  classified  as  islets  grade  4  (Figure  1).  The  insulitis  index  was  determined 

according to Leiter (2001) [25], considering 300 islets/group (5 mice/group). 

2.4.4. Detection of Serum Insulin Levels 

Serum insulin was determined by rat/mouse insulin ELISA kit, according to the instructions of the 

manufacturer (Millipore


, Billerica, MA, USA). After four hours of fasting, mice were sacrificed and 

their  whole  blood  removed  by  cardiac  puncture  and  serum  separation.  Absorbance  was  read  on  a 

Antioxidants 2015




spectrophotometer  (Spectramax  190)  at  450  nm  and  590  nm,  and  the  curve  drawn  using  four  

parameters analysis. 


Figure 1. Representative image of pancreatic islets of NOD mice at different grades of cell 

infiltration. (A) Grade 0 (0%); (B) Grade 1 (<25%); (C) Grade 2 (25%–80%); (D) Grade 3 

(>80%) and (E) Grade 4 (100%). 

2.4.5. Glucose Tolerance Test 

The glucose tolerance test (GTT) was performed according to Andrikopoulos et al. (2008) [26], with 

some modifications. Mice (15–28 weeks old) were divided into the following groups: NOD mice treated 

for one month with E. uniflora aqueous extract (n = 12), untreated NOD mice (n = 12), acute diabetic 

NOD mice (n = 12) and BALB/c (healthy control mice), which do not develop diabetes (n = 12). The 

animals were fasted for 4 hours, followed by dosing of glucose at time 0 (blood sample from the caudal 

vein) using measuring strips (Medisense Optium


, Abbott Diabetes Care Inc. Alameda, CA, USA). After 

measuring at time 0, 25% glucose was administered by intraperitoneal injection (1 g/kg/weight), and 

blood  samples  were  collected  at  10,  30,  60,  90  and  120  min  followed  by  the  glucose  quantified  at  

each time. 

2.4.6. Reduced Glutathione Analysis 

Protein  concentration  and  reduced  glutathione  (GSH)  of  liver  homogenates  were  determined 

according to the Hartree (1972) [27] and Faure and Lafond (1995) [28], respectively. Standard curves 

(2.5–500 nmol/mL), 100 μL of Tris/EDTA buffer (1mM Tris/2 mM EDTA) and 20 μL of reactive DTNB 

10 mM (5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) were used in GSH analysis. Absorbance was read at 412 nm 

in a spectrophotometer (Spectramax 190). The calculation of glutathione was made by determining the 

glutathione/total protein ratio and the result was expressed as nmol GSH/mg protein. 



Antioxidants 2015




2.4.7. Determination of Serum Antioxidant Activity and Lipid Peroxidation Assay 

Serum antioxidant activity in NOD mice was determined by the inhibition of free radical ABTS and 

the results were expressed as μM trolox/g sample [11,15]. 

The concentration of lipid peroxidation product or thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 

was determined in the serum of NOD mice, according to Ohkawa et al. (1979) [29] with modifications [30]. 

The samples were mixed with 8.1% sodium dodecyl sulphate (SDS) plus working reagent (TBA, 20% 

acetic acid, and 5% sodium hydroxide). After heating at 95°C for 60 min, the samples were maintained 

in an ice-bath for 10 min, and centrifuged at 10,000 g for 10 min. The supernatant was read at 532 nm 

in Synergy HT, Biotek microplate reader (Winooski, VT, USA). The results are expressed as μmol MDA 

equivalents mL/serum). 

2.5. Statistical Analysis 

The  results  were  expressed  as  mean  values  ±  standard  error  (SE)  and  were  analyzed  using  the 

GraphPad software, version 6.0 (San Diego, CA, USA). All data were submitted to the normality test. 

Water consumption data were analyzed by Student T-test analysis. Other comparisons were performed 

by one-way ANOVA of variance with Tukey post-test and Kruskal-Wallis test with Dunn’s post-test. 

The  statistical  differences  were  represented  by  letters;  the  same  letters  located  on  top  of  the  bars 

correspond  to  the  absence  of  statistical  difference,  whereas  different  letters  represent  statistical 

difference among the groups. p < 0.05 was taken as indicative of statistical significance. 

3. Results 

3.1. Chemical Analysis 

DPPH  analysis  (%  scavenge)  shows  a  higher  percentage  of  radical  sequestration  with  statistical 

difference  between  aqueous  (39.9  ±  1.9)  and  methanol/acetone  (27.6  ±  2.0)  (p  =  0.0061)  and  no 

difference with ethanol extract (34.2 ± 1.5). However, in the FRAP assays (μM FeSO


/ g sample), the 

aqueous extract presented a higher antioxidant activity (95.0 ± 5.9) compared with ethanol (64.2 ± 1.9) 

(p = 0.0017), but similar to that of methanol/acetone (80.0 ± 1.9). Using the ABTS assays (μM trolox/g 

sample), the aqueous extract demonstrated a higher antioxidant activity (35,792 ± 1044), followed by 

methanol/acetone (28,960 ± 760) and ethanol extract (24,775 ± 612), with statistical difference between 

the  aqueous  and  ethanol  extracts  (p  =  0.0012).  The  ORAC  assays  (μM  trolox/g  sample)  did  not 

demonstrate  any  statistical  difference  between  the  aqueous  (1118  ±  83),  ethanol  (1021  ±  1)  and 

methanol/acetone  (1001  ±  119)  extracts.  The  total  phenolic  compound  analysis  (mg  GAE/g  sample) 

showed a higher concentration in the aqueous extract (73.3 ± 1.0), compared with the ethanol extract 

(44.8 ± 0.8) (p = 0.0005), but no difference from the methanol/acetone extract was seen (64.8 ± 1.1). 

Hydrolyzed tannins were identified in the three extracts of E. uniflora leaves using the qualitative 

method.  The  quantitative  method  (mg  tannic  acid/g  sample)  showed  that  ethanol  extracted  greater 

amounts  of  hydrolysable  tannins  (167.7  ±  1.5),  in  comparison  with  the  aqueous  (154.5  ±  3.2)  and 

methanol/acetone (154.1 ± 4.2) extracts. There was a statistical difference only between the ethanol and 

methanol/acetone extracts (p = 0.0196). 

Antioxidants 2015

Yüklə 0,72 Mb.

Dostları ilə paylaş:
  1   2   3

Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə