36. Đzolasyon ve Tanımlama Esasları

36. Đzolasyon ve Tanımlama Esasları 

# 

Gıda mikrobiyolojisinde izole edilen bir bakterinin tanımlanması çoğu kez  önemlidir. Bir gıda 

maddesinden izole edilen bakterinin gerçekten Salmonella olup olmadığının belirlenmesi gereklidir. Buna 

göre ürün imha edilebilir ya da güvenli bir şekilde pazarlanabilir. 

# 

Ne olduğu hiç bilinmeyen bir izolatın tanımlanması ile belirli bir cins ya da tür olup olmadığının 

belirlenmesindeki yöntemler ve yaklaşımlar oldukça farklıdır. Örneğin, izolatın Salmonella olup 

olmadığının incelenmesindeki uygulamalar ile izolatın ne olduğunun araştırılmasındaki uygulamalar 

farklıdır. 

# 

Tanımlamada basit ve yaygın olarak morfolojik analizler ve biyokimyasal testler uygulanmaktadır. Faj 

tiplendirmesi ve genetik esaslı testler, ancak gelişmiş laboratuvarlarda ve genellikle bilimsel araştırma 

amacıyla kullanılmaktadır. Bu kitabın kapsamında sadece basit morfolojik ve biyokimyasal testler  

verilmiştir. 

# 

Morfolojik analizler temel olarak, koloni morfolojisi ve mikroskobik morfoloji olarak 2 şekilde yapılır. 

Koloni şekli ve büyüklüğü ile basit boyanmış ve Gram boyanmış kültürlerin mikroskobik morfolojisi bazı 

analizlerde çok önemli olabilmektedir. Đzolata doğrudan Gram boyama uygulanarak hem morfolojisi hem 

de Gram reaksiyonu belirlenebilirse de, prensip olarak morfolojinin belirlenmesi amacıyla basit boyama 

testi uygulanmalıdır. Bunun nedeni Gram boyamada morfolojilerin yeterince ayrıntılı olarak 

görülemeyebilmesidir. Burada kastedilen çubuk ve kok farkı değil, pleomorfizm ve kokobasil gibi özel 

morfolojilerdir. Flagella boyama ile bakterinin hareketli olup olmadığı belirlenebilirse de, yarı katı 

besiyerinde (yumuşak agar) ya da çukur lamda hareket tespiti daha kolaydır. 

# 

Basit biyokimyasal testler genel olarak 3 şekilde yapılır; 

#

-Đndol testi örneğinde olduğu gibi sonucu pozitif ve negatif olarak değerlendirilen testler: Tanımlamada 

en yaygın kullanılan testler bunlardır. 

#

-Belirli bir maddenin hangi derişimine kadar gelişme olduğunun saptanması: Burada değinilen "madde", 

mutlaka inhibitör olmak zorunda değildir, %50 Glikoz Broth ortamında sadece ozmofilik/ozmotolerant 

mayalar gelişebilir. 

#

-Koloni rengi, koloni zon rengi, sıvı besiyerinde renk değişimi, floresan ışıma gibi gözle yapılan 

değerlendirmeler: Bunlar koloni morfolojisi gibi değil, doğrudan temel biyokimyasal testler olarak 

değerlendirilir. 

# 

Sonucu pozitif ya da negatif olarak alınan testlerdeki değerlendirmeler test edilen bakteri türünün daha 

önce denenen yüzlerce suşu içinde yüzde kaçının bu reaksiyonu pozitif olarak verdiği ile ilişkilidir. 

Örneğin, E. coli suşlarının %100'ü VP testinde pozitif sonuç verirken, Citr. Freundii için laktoz testi 

sonucunda suşların %50'si pozitif; %50'si negatif sonuç vermektedir. Buna göre VP testi pozitif olarak 

elde edilen bir izolatın E. coli olma olasılığı varken, laktoz testi için sonuç ne olursa olsun Citr. freundii 

olup olmadığı konusunda tahminde bulunmak mümkün değildir. 

# 

Basit biyokimyasal testlere yönelik değerlendirmeler spektrofotometrik okuma ve bilgisayar destekli 

programlar ile ya da çoğu uygulamada olduğu gibi gözle yapılır. Nümerik taksonomik yaklaşımlar da 

tanımlamada her zaman geçerlidir. 

# 

Basit biyokimyasal testlerde günlük uygulanan test için pozitif ve negatif sonuç veren 2 bakterinin şahit 

olarak teste dahil edilmesi, ayrıca aşılanmamış bir Besiyeri tüpünün ya da Petri kutusunun da şahit olarak 

denemeye dahil edilmesi gereklidir. Bunun en tipik örneği üre testi için verilmektedir. Üre testi 

yapılırken, 4 adet Urea Broth besiyeri hazırlanır. Bunlardan birincisine bakteri aşılanmaz ve inkübasyon 

sonunda orijinal portakal kırmızısı renk izlenir (şahit). Đkincisine test edilen kültür (test), üçüncüsüne 

negatif sonuç için E. coli ve dördüncüsüne pozitif sonuç için Proteus spp. inoküle edilir. Bu 4 tüpün 

beraberce inkübasyonu ve renk değerlendirilmesi sonucunda test kültürünün üre reaksiyonu belirlenir. 

# 

# 

Saf Kültür Tekniği 

# 

Tanımlanacak kültürün saf olarak elde edilmesi tanımlama testlerine geçmeden önceki en önemli 

aşamadır. Bir diğer deyiş ile saf kültür elde edilmesi tüm tanımlama testleri öncesinde yapılmış olmalıdır. 

# 

Saf kültür, standart bir Petri kutusundaki katı besiyerinde gelişen koloniden elde edilir. Buna izolat da 

denilir. Saf kültür elde etmek için izolasyon sırasında izole edilecek koloninin yakın çevresinde başka 

koloni olmamalıdır. 

# 

Đzolasyonda öze kullanılacak ise kısa saplı olanların tercih edilmesi gerekir. Bunun nedeni el ile daha 

rahat kullanılabilmesi ve sadece istenen noktaya dokundurma kolaylığıdır. Yaklaşık 5 cm boyunda boş 

küçük tüplere birer birer olmak kaydı ile kürdan (Japon tipi olarak bilinen) koyulup, pamuklanarak 

otoklavlanması ile de iyi bir izolasyon gereci elde edilir. Sterilize edilmiş kürdan tüpten çıkartılır, 

koloniye değdirilir, içinde 2 mL kadar besiyeri bulunan kısa tüplerin içine bırakılır. 

# 

Kürdan kullanımında, elle tutulan ucu asla tüpteki besiyerine temas etmemelidir. Đkinci olarak kürdan, 

içinde besiyeri olan tüple birlikte sterilize edilmemelidir. Bunun nedeni tahta kürdanın besiyerini 

emmesidir. Eğer kürdan ve besiyeri beraberce sterilize edilecekse kürdanın besiyerine temas 

etmemesi sağlanmalıdır. 

# 

Test edilen kültürde beklenmedik sonuçlar alınıyorsa öncelikle kültürün saf olup olmadığı kontrol 

edilmelidir. Örneğin, Salmonella kuşkusu ile selektif bir besiyerinden izole edilen tipik bir koloniye 

izolasyon aşamasında ya da daha sonra E. coli bulaşırsa, uygulanan testler sırasında hem Salmonella 'ya 

hem de E. coli 'ye yönelik olarak pozitif sonuçlar alınacaktır. 

# 

Bu gibi şüpheli durumlarda kültür paralel olarak hedef mikroorganizma için selektif besiyerine hem de 

CASO Agar genel bir besiyerine öze ile tek koloni oluşturacak şekilde sürülür, inkübasyona bırakılır. 

Genel besiyerinde morfolojik olarak farklı koloniler varsa kontaminasyon olduğu açıktır. Kolonilerin 

hepsi aynı morfolojide ise, bu kontaminasyon olmadığının göstergesi değildir. 

# 

Laktoz test sonucunu gösteren selektif besiyerine sürme yapılarak, örneğin, laktoz negatif muhtemel 

Salmonella kolonisi ile laktoz pozitif herhangi bir bakteri (E. coli) kolaylıkla ayrılabilse de laktoz negatif 

olan Proteus vulgaris kontaminasyonu bu şekilde ayırt edilemez. 

# 

Bu gibi sorunlarla karşılaşmamak için Doğru Laboratuvar Teknikleri (Good Laboratory Practice) 

uygulamalarına özen gösterilmelidir. Bu konuda 02. Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı; Genel Kurallar 

bölümünde açıklayıcı bilgi bulunmaktadır. 

## 

Đzolasyonda 1:100 Oranı 

# 

Standart Petri kutusundan izolasyon için 100 koloni esas alınır. Bu sayıda standart 1–2 mm çaplı koloni 

Petri kutusu içinde düzgün olarak dağılmış ise farklı renkteki bir koloni diğerleri içinden kolaylıkla fark 

edilerek kontaminasyon olmaksızın güvenle izole edilebilir. Bu kural, özellikle 100 renkli koloni içinde 1 

renksiz koloni için geçerlidir. 150 renkli koloni içinde 1 renksiz koloninin fark edilerek bunun izolasyonu 

önemli ölçüde deneyim gerektirir. 

# 

Bu durumda, örneğin, E. coli O157:H7 analizinde CT–SMAC Agar besiyerinde gelişebilen refakatçi 

floradan renkli koloni oluşturanlar, renksiz koloni oluşturan E. coli O157:H7'nin varlığını maskeleyebilir 

ve sonuç "E. coli O157 serotipi yoktur" şeklinde sahte negatif olarak alınabilir. 

# 

Bu şekilde sahte negatif sonuçlar gıda sanayisinde yapılan analizlerde –özellikle katı besiyeri 

selektivitesindeki yetersizliğe bağlı olarak- sıklıkla alınmaktadır. 

# 

Refakatçi flora baskılanmasına yönelik olarak yapılacak uygulamaların büyük çoğunluğunun hedef 

mikroorganizmayı da etkileyeceği açıktır. Halofil, ozmofil, termofil vb. grupların analizinde sadece hedef 

mikroorganizmanın bu özelliği ile refakatçi flora baskılanmaktadır. Örneğin, ozmofil maya analizinde 

(bakınız; 17.03. Bölüm) %50 glikoz konsantrasyonu zaten bu grubun gelişimi için gerekli iken, 

refakatçi floranın bu derişimdeki glikozda gelişimi tümüyle mümkün değildir. 

# 

Bu örnek tümüyle sıra dışı olup, çok ender birkaç mikroorganizma için geçerlidir. Oysa, gıda 

mikrobiyolojisindeki analizlerin büyük çoğunda hedef mikroorganizma analizi sırasında refakatçi flora 

baskılaması önemli ölçüde görülür. Çok tipik bir örnek olmak üzere Listeria analizinde laktobasiller gerek 

zenginleştirme gerek selektif katı besiyerinde gelişebilirler. 

# 

Selektif zenginleştirme aşamasında ya da selektif katı besiyerinde refakatçi floranın baskılanması, 

besiyeri geliştirme çalışmalarının temellerinden birisidir. 

# 

Gıdaların mikrobiyolojik analizinde sahte negatif sonuçlardan olabildiğince kaçınmak için, özellikle 

yoğun refakatçi flora varlığı olan gıdalardaki patojen analizlerinin Singlepath kitleri ile yapılması ayrı bir 

önem taşımaktadır. 

###