A dissertation submitted in fulfilment of the requirement for the degree of doctorate of science in the department of biochemistry and microbiology, faculty of science and

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANTI-PLATELET AGGREGATION ACTIVITY OF MELALEUCA BRACTEATA 
VAR.REVOLUTION GOLD DERIVED BETULINIC ACID AND ITS DERIVATIVES 
 
BY 
 
OSUNSANMI FOLUSO OLUWAGBEMIGA (Msc UNILAG) 
201200147 
 
A DISSERTATION SUBMITTED IN FULFILMENT OF THE REQUIREMENT FOR THE 
DEGREE OF DOCTORATE OF SCIENCE IN THE DEPARTMENT OF 
BIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY, FACULTY OF SCIENCE AND 
AGRICULTURE, UNIVERSITY OF ZULULAND, KWADLANGEZWA, SOUTH AFRICA 
 
SUPERVISOR:  PROF A.R. OPOKU              CO-SUPERVISOR: PROF F.O SHODE 
 
 
NOVEMBER 2015

 
 
 
1-1 
 
DECLARATION 
The experimental work described in this dissertation was conducted in the Department 
of  Biochemistry  and  Microbiology,  Faculty  of  Science  and  Agriculture,  University  of 
Zululand,  from  January  2013  to  November  2015,  under  the  supervision  of  Prof.  A.R. 
Opoku and co-supervision of Prof. F.O. Shode 
This study represents the original work by the author which has not been submitted in 
any  form to another  University.  Any  use  of  the  work  of others  has  been properly  cited 
and acknowledged in the text.  
I, Osunsanmi Foluso Oluwagbemiga firmly declare the above statement to be true.  
 
 
--------------------------------------------------------  
Foluso Oluwagbemiga Osunsanmi 
 
 
--------------------------------------------------------  
Prof. A.R. Opoku  
 
 
--------------------------------------------------------  
Prof. F.O. Shode  
 

 
 
 
1-2 
 
DEDICATION 
This  research  work  is  dedicated  to  the  Almighty  God,  my  beloved  late  father  Deacon 
David  Olanrewaju  Osunsanmi,  my  mother  Mrs  Benedicta  Omolara  Osunsanmi,  my 
dearest  wife  Mrs  Adesola  Sekinat  Osunsanmi  and  my  children  Obanioluwa  and 
Olaloluwa. 
 
 

 
 
 
1-3 
 
ACKNOWLEDGEMENTS 
I am deeply grateful to the Almighty God who has kept me alive to the completion of this 
study. 
I would like to express my gratitude to my supervisor, Prof A. R. Opoku for his guidance, 
love, encouragement and patience throughout this work. 
I  am  indebted  to  my  co-supervisor  Professor  F.  O.  Shode  for  his  scientific  guidance, 
support and encouragement during this research work. 
I wish to express my thanks to Prof Basson, Dr A. Kappo, Dr A.R Mosa and other staff 
members  of  the  Department  of  Biochemistry  and  Microbiology,  University  of  Zululand 
for their support, and to the Research Office of the University of Zululand for funding this 
research work.  
I am forever grateful to my parents (Late Deacon David Olanrewaju Osunsanmi and Mrs 
Bendeicta  Omolara  Osunsanmi)  for  their  moral  and  financial  support  throughout  this 
work;  my  dearest  wife  (Mrs  Adeshola  Sekinat  Osunsanmi)  for  her  love  and 
encouragement;  my  children  (Obanioluwa  and  Olaoluwa)  for  their  patience  and 
understanding; and my siblings (Dr (Mrs) Oluwaseyi Modupe Ajayi,  Engineer Akinyemi 
Olabode  Osunsanmi,  Dr  (Mrs)  Monisola  Itohan  Ikhile,  Engineer  Oluwafemi  Sunday 
Osunsanmi  and  Mr  Temidayo  Oluwasola  Osunsanmi)  for  their  prayers  and  financial 
assistance.  
I would like to thank Dr Ogunyinka
’s
 family for their encouragement and support. I would 
also  like  to  thank  my  friends:  Rexwhite  Enakrire,  Rekha  Dunpall,  Wole  Durodolu,  Pst 
Babatunji  Oyinloye,  Wole  Aremu,  Zanele  Dube,  Kayode  Oki,  Pst  Charles  Akappo,  Pst 
and  Mrs  Foli,  Dr  and  Pst  (Mrs)  Adetiba,  Dr  and  Mrs  Muyiwa  Olowe,  John  Luke,  Mr 
Albert  Ikhile,  Pst  and  Pst  (Mrs)  Johnny,  Pst  and  Pst  (Mrs)  D.O  Adelaja,  Pst  and  Pst 
(Mrs) Tom Mensah, Prof and Dr (Mrs) Dapo Longe and host of others for their prayers 
and support throughout this research work. 
 
 

 
 
 
1-4 
 
LIST OF ABBREVIATIONS 
 
12-KETE               12-ketoeicosatetraenoic acid 
AD                         Alzheimer’s disease 
 
ADP                      Adenosine diphosphate 
ATP                      Adenosine triphosphate 
BA                        Betulinic acid 
BAA                      3-
β acetylbetulinic acid
 
CaCl
2
                    Calcium chloride 
COX-1                  Cyclooxgenase 1 
COX-2                  Cyclooxgenase 2 
DMSO                   Dimethyl sulfoxide 
EDTA                    Ethylenediaminetetra-acetic acid 
EETs                     Epoxyeicosatrienoic acids 
Factor II                 Prothrombin 
Factor VII              Proconvertin factor 
Factor XI               Plasma thromboplastin antecedent 
Factor XIII             Fibrin stabilizing factor 
Factor XIIIa           Fibrin stabilizing factor A 
Fctor X                  Stuart- Power factor 
FLAP                     5-lipoxygenase-activating protein 
GPIb/IX                 Platelet glycoprotein GPIb/IX complex 
H
2
SO
4
                   Sulfuric acid 

 
 
 
1-5 
 
HEK293                 Human embryonic kidney cells 
HEPG2                  Human hepatocellular carcinoma cells 
HETEs                   Hydroxyeicosatetraenoic acids 
HPETE                  Hydroxyperoxyeicosatetraenoic acid 
HSC                      Human stem cell 
IC50                      Inhibitory concentration with 50% 
IR                          Infra-red Spectroscopy 
LD                         Lethal dose 
LOX                       Lipoxygenase  
 LT                         Leukotriene 
MK                         Megarkaryocytes 
MS                         Mass Spectroscopy 
MTT                      3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide 
NaCl                     Sodium chloride 
NMR                     Nuclear magnetic resonance spectroscopy 
NMR                     Nuclear Magnetic Resonance 
OA                        Oleanolic acid 
OAA                      3-
β acetyloleanolic acid
 
PDE                      Phosphodiesterase 
PG                         Prostaglandin 
RANTES               Regulated on Activation Normal T Expressed and Secreted 
ROS                       Reactive oxygen species  
SOD                      Superoxide dismutase 
TPO                      Thrombopoetin  

 
 
 
1-6 
 
 TXA
2
                    Thromboxane A
2 
VWf                       Von Willebrand factor  
WHO                     World Health Organisation 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
1-7 
 
ABSTRACT 
Abnormal  Platelet aggregations  are  implicated  in  the  onset  of  cardiovascular  diseases 
which  are  the  leading  cause  of  death  and  disability  globally.  Management  of 
pathological  platelet  aggregation  with  medicinal  plants  is  a  promising  approach  in 
treatment of cardiovascular diseases. 
In this study, betulic acid (BA) and a mixture of betulinic acid and oleanolic acid (BA/OA) 
isolated  from  Melaleuca  bracteata  leaf  extract  and  their  acetyl  derivatives  (3-
β 
acetylbetulinic  acid)  (BAA),  (3-
β  acetylbetulinic  acid  and  3
-
β  acetyloleanolic  acid 
mixture)  (BAA/OAA)  were  investigated  for  their  antiplatelet  aggregation,  anti-
inflammatory,  anticoagulant,  anti-oxidant  and  cytotoxicity  activity.  The  compound 
structures  were  confirmed  through  spectral  nuclear  magnetic  resonance  (NMR),  mass 
(MS)  and  infrared  (IR)  spectroscopy  data  analysis.  The  antiplatelet  aggregation 
activities  of  the  compounds  were  evaluated  against  four  agonists  (thrombin,  collagen, 
adenosine  diphosphate  and  epinephrine)  used  separately  to  induce  platelet 
aggregation.  The  ability  of  the  compounds  to  separately  inhibit  the  hydrolysis  of 
chromogenic  substrate  was  used  for  antithrombin  activity  of  the  triterpenoids.  The 
release of ATP and calcium mobilization from the cytosol, as platelets aggregate,  was 
investigated  using  a  commercial  kit  and  Fura  2/AM  respectively.  The  anti-
acetylcholinesterase activity of the triterpenes was also investigated using a commercial 
kit.  The compounds were fed to rats  and the tail bleeding time was used to determine 
the ex vivo anticoagulation activity of the triterpenoids. The anti-inflammatory activity of 
the  triterpenes  was  investigated  using  the  cotton  pellet-induced  granuloma  model  in 
rats. The homogenates from the granuloma tissues were used to determine the effect of 
the test compounds on catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities.  The 
in  vitro  effect  of  the  triterpenes  on  cyclooxygenase  COX-1  and  COX-2  activity  was 
investigated.  The  3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium  bromide  (MTT) 
cytotoxicity  assay  was  used  to  investigate  the  cytotoxic  effect  of  the  triterpenoids 
against carcinoma (HEPG2) and human embryonic (HEK293) cell lines.  
All  the  test  compounds  exhibited  significant  anti-platelet  aggregation  activity,  albeit  to 

 
 
 
1-8 
 
different  degrees  of  efficacy.  BAA  showed  the  highest  antiplatelet  aggregation  activity 
regardless of the agonists. Coupled with its anti-platelet aggregation activity, BAA also 
exhibited  significant  anti-inflammatory,  antithrombin,  acetylcholinesterase  inhibition, 
phosphodiesterase inhibition, calcium mobilization inhibition, inhibition of the release of 
ATP  from  dense  granules,  anticoagulant,  cyclooxgensase  (COX-2)  activity  inhibition, 
and iron chelating activities. BAA also significiantly stimulates SOD and CAT activity. In 
addition to the efficacy, the weak cytotoxicity of triterpenoids indicated their safety as an 
antiplatelet agent. 
It was concluded that BAA could be served
 
as a template for the synthesis of safer anti-
platelet agent. 
 
 

 
 
 
1-9 
 
                     CONTRIBUTION TO KNOWLEDGE 
Publications 

  Osunsanmi, F.O., Soyinbe, O.S. Ogunyinka, I.B.,Mosa, R.A.,Ikhile, M.I.,  Ngila, 
J.C.,  Shode,  F.O.,    Opoku,  A.R.  (2015).  Antiplatelet  aggregation  and  cytotoxic 
activity  of  betulinic  acid  and  its  acetyl  derivative  from  Melaleuca  bracteata. 
Journal of Medicinal Plant Research. 9(22): 647-854. 

  Penduka, D., Gasa, N.P., Hlongwane, M.S., Mosa, R.A., Osunsanmi, F.O., and 
Opoku, A.R. (2015). The antibacterial activities of some plant-derived triterpenes. 
Afri J tradit Complement Altern Med. 12(6):180-188. 

  Soyinbe, O.S. Myeni, C.B., Osunsanmi, F.O., Lawal, O.A., Opoku, A.R. (2015). 
Antimicrobial  and  efflux  pumps  inhibitory  activities  of  Eucalyptus  grandis 
essential  oil  against  respiratory  tract  infectious  bacteria.  Journal  of  Medicinal 
Plant Research, 9(10): 343-348. 

  Osunsanmi,  F.O.,  Soyinbe,  O.S.  Ogunyinka,  I.B.,  Mosa,  R.A.,  Ikhile,  M.I.,  
Ngila, J.C., Shode, F.O.,  Opoku, A.R. (2015). 
 
Antiplatelet Aggregation Activity of 
Betulinic  Acid,  Oleanolic  Acid,  Maslinic  Acid  and  derivatives  from  Medicinal 
Plants.  Afri  J  tradit  Complement  Altern  Med.  12(6):180-188.  (Editorial 
consideration) 

  Osunsanmi  F.  Oluwagbemiga,  Soyingbe,  O.S,  Shode  E.A,  Rebamang,  A.M 
and  Opoku  A.R.  Antioxidant  and  cytotoxic  activity  of  Betulinic  acid  and 
derivatives  from  Melaleuca  bracteata  var  revolution  gold.  Journal  of  Natural 
Products (Manuscript in preparation).  
Osunsanmi F. Oluwagbemiga, Opoku A.R, Soyingbe,  O.S,  Antiplatelet activity 
of  betulinic  acid  and  betulinic  acetate  extracted  from  Melaleuca  bracteata  var. 
revolution gold is involved in the suppression of intracellular calcium mobilization 
and  ATP  release.  African  journal  of  Pharmacy  and  Pharmacology  (Manuscript 
in preparation). 
 
 

 
 
 
1-10 
 
Conferences 

  Osunsanmi,  F.O.,  Soyinbe,  O.S.,  Shode,  F.O.,  Opoku,  A.R.  Antiplatelet 
Aggregation  Activity  of  Betulinic  Acid,  Oleanolic  Acid,  Maslinic  Acid  and 
derivatives  from  Medicinal  Plants.  SAAB  Symposium,  12-16  January  2015. 
Venda, South .Africa.  

  Osunsanmi, F.O., Soyinbe, O.S. Ogunyinka, I.B., Mosa, R.A., Ikhile, M.I.,  Ngila, 
J.C., Shode, F.O., Opoku, A.R.  Antiplatelet aggregation and cytotoxic activity of 
betulinic acid and its acetyl derivative from Melaleuca bracteata var. revelovtion 
gold.  Global  summit  on  Herbal  and  Natural  remedies.  October  26-27,  2015, 
Chicago, USA. 

  Osunsanmi,  F.O.,  Shode,  F.O.,  Opoku,  A.R.  Anti-inflammatory  activity  of 
betulinic  acid  and  its  acetyl  derivative  from  Melaleuca  bracteata.  SAAB 
Symposium, 10-13 January 2016. Free State, South .Africa.  
 
 

 
 
 
1-11 
 
Table of Contents 
ACKNOWLEDGEMENTS 
1-3
 
LIST OF ABBREVIATIONS 
1-4
 
ABSTRACT 
1-7
 
CONTRIBUTION
 
TO
 
KNOWLEDGE
 
1-9
 
CHAPTER ONE 
1-20
 
1.
 
I
NTRODUCTION
 
1-20
 
1.1S
TRUCTURE OF THE THESIS
 
1-21
 
CHAPTER TWO 
1-22
 
2.
 
L
ITERATURE REVIEW
 
2-22
 
2.1
 
Platelet structure 
2-23
 
2.2
 
Platelet activation 
2-25
 
2.3
 
Platelet receptors 
2-26
 
2.3.1
 
Collagen receptors 
2-27
 
2.3.2
 
Platelet CD148 receptors 
2-29
 
2.3.3
 
C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) 
2-29
 
2.3.4
 
Platelet integrin αII
b
β
3
 receptor 
2-29
 
2.3.5
 
Integrin α
v
β
3
 
2-30
 
2.3.6
 
P2Y1 receptors 
2-30
 
2.3.7
 
P2Y12 receptors 
2-30
 
2.3.8
 
P2X1 receptors 
2-31
 
2.3.9
 
Thromboxane (TXA
2
) receptors 
2-31
 
2.3.10
 
Prostaglandin E
2
 (PGE
2
) receptors 
2-31
 
2.3.11
 
Prostaglandin I
2 
(PGI
2
) 
2-32
 
2.3.12
 
Thrombin receptors 
2-32
 
2.3.13
 
Eph kinases 
2-32
 
2.3.14
 
Gas 6 (growth arrest-specific gene 6) 
2-33
 
2.3.15
 
P-selectin receptors 
2-33
 
2.4
 
Platelet aggregation 
2-35
 
2.5
 
Hemostatic system 
2-37
 

 
 
 
1-12 
 
2.6
 
Acetylcholinesterase 
2-39
 
2.7
 
Phosphodiesterase 
2-42
 
2.8
 
Inflammation 
2-45
 
2.8.1
 
Cyclooxygenase (COX-1 and COX-2) 
2-46
 
2.9
 
Reactive oxygen species 
2-48
 
2.9.1
 
Antioxidants 
2-50
 
2.10
 
Treatment of platelet aggregation 
2-52
 
2.10.1
 
Aspirin 
2-52
 
2.10.2
 
Clopidogrel 
2-54
 
2.10.3
 
Dipyridamole 
2-55
 
2.10.4
 
Ticlopidine 
2-56
 
2.10.5
 
Cilostazol 
2-57
 
2.10.6
 
Sarpogrelate 
2-58
 
2.10.7
 
GPIIb/IIIa Receptors Antagoinst 
2-59
 
2.10.8
 
Picotamide 
2-59
 
2.10.9
 
Beraprost 
2-60
 
2.10.10
 
Trapidil 
2-61
 
2.11
 
Recent developments in platelet aggregation inhibitors 
2-61
 
2.12
 
Medicinal plants in traditional medicine 
2-62
 
2.13
 
Triterpenoids 
2-63
 
2.14
 
Betulinic acid 
2-65
 
2.15
 
Melaleuca bracteata 
2-66
 
2.15.1
 
Scientific classification of Melaleuca bracteata 
2-67
 
2.15.2
 
Some other Melaleuca genuses 
2-67
 
2.15.3
 
Economic importance of Melaleuca bracteata var. revolution gold 
2-68
 
2.16
 
Problem statement 
2-68
 
2.17
 
Aims and objectives 
2-69
 
2.17.1
 
Aims 
2-69
 
2.17.2
 
Objectives 
2-69
 
2.18
 
Research hypothesis 
2-70
 

 
 
 
1-13 
 
CHAPTER THREE 
2-71
 
3.
 
M
ATERIALS AND METHODS
 
3-71
 
3.1
 
Materials 
3-71
 
3.1.1
 
List of equipment 
3-71
 
3.1.2
 
Chemicals and reagents (see Appendix  A for reagent details) 
3-72
 
3.2
 
Methods (see Appendix B for details) 
3-72
 
3.2.1
 
Collection and identification of plants 
3-72
 
3.2.2
 
Extraction and isolation of betulinic acid 
3-73
 
3.2.3
 
Preparation of betulinic derivatives 
3-73
 
3.2.4
 
Isolation of betulinic and oleanolic acid 
3-74
 
3.2.5
 
Preparation of betulinic and oleanolic acids derivatives 
3-74
 
3.2.6
 
Structural elucidation 
3-75
 
3.2.7
 
Experimental animals 
3-75
 
3.2.8
 
In vitro antiplatelet aggregation study 
3-76
 
3.2.9
 
Antithrombin activity (chromogenic: S2238) 
3-77
 
3.2.10
 
Determination of calcium levels in cytosol 
3-77
 
3.2.11
 
ATP release assay 
3-78
 
3.2.12
 
Determination of phosphodiesterase activity 
3-78
 
3.2.13
 
Tail bleeding time assay 
3-79
 
3.2.14
 
Cytotoxity test 
3-79
 
3.2.15
 
Anti- acetylcholine esterase activity of betulinic acid and its derivate 
3-79
 
3.2.16
 
Iron (Fe
2+
) chelation 
3-80
 
3.2.17
 
Anti-inflammatory evaluation 
3-80
 
3.2.18
 
In vitro cyclooxygenase (COX-1 and COX-2) inhibition assay 
3-82
 
3.2.19
 
Superoxide dismutase (SOD) activity 
3-82
 
3.2.20
 
Catalase activity 
3-83
 
3.2.21
 
Statistical analysis 
3-83
 
CHAPTER FOUR 
3-84
 
4.
 
R
ESULTS
 
4-84
 
4.1
 
Compound Identification 
4-84
 
4.2
 
Cytotoxicity assay 
4-90
 

 
 
 
1-14 
 
4.3
 
Anti-thrombin activity 
4-91
 
4.4
 
The Anti-Platelet aggregation studies 
4-92
 
4.5
 
ATP Assay 
4-97
 
4.6
 
The Anti-acetylcholinesterase activity 
4-97
 
4.7
 
Phosphodiesterase inhibitory activity 
4-99
 
4.8
 
Calcium levels in cytosol 
4-100
 
4.9
 
Tail Bleeding time (ex vivo) 
4-101
 
4.10
 
Anti-inflammation activity 
4-102
 
4.11
 
Cyclooxygenase evaluation 
4-103
 
4.12
 
Superoxide Dismutase activity 
4-104
 
4.13
 
Catalase activity 
4-105
 
4.14
 
Iron chelation 
4-106
 
4.15
 
The microscopic pictures of platelet aggregation treated with isolated compounds
 
4-107
 
CHAPTER FIVE 
4-109
 
5.
 
D
ISCUSSION
 
5-109
 
CHAPTER SIX 
5-116
 
6.
 
C
ONCLUSION
 
6-116
 
6.1
 
Recommendation for further studies 
6-116
 
R
EFERENCES
 
6-117
 
 
APPENDICES 
A
PPENDIX 
A 
6-152
 
A
PPENDIX 
B 
6-153
 
A
PPENDIX  
C 
6-158
 
A
PPENDIX  
D 
6-195
 
 
 
 

 
 
 
1-15 
 
LIST OF TABLES 
Table 4.1: 
13
C-NMR (100 MHz) spectral data for 1 and 2 .......................................... 4-87
 
Table 4.2:  13C-NMR (100 MHz) spectral data for samples 3 and 4 .......................... 4-89
 
Table 4.3: The IC
50 
(µg/ml) of betulinic acid and 3-
β acetylbetu
linic acid on HEK293 and 
HEPG2 cells ............................................................................................ 4-90
 
Table 4.4: The IC
50
 values of antithrombin activity in the isolated compounds........... 4-92
 
Table  4.5:  The  IC50  values  of  betulinic  acid  and  3-
β  acetylbetulinic  on  platelet 
aggregation inhibition .............................................................................. 4-92
 
Table  4.6:  The  IC
50
  values  of  percentage  phosphodiesterase  inhibition  of  the 
compounds .............................................................................................. 4-99
 
 
 
 

 
 
 
1-16 
 

Kataloq: bitstream
bitstream -> Issn 2409-0255 (Print) issn 2410-1427 (Online)
bitstream -> A review of international experience
bitstream -> Yeni və orijinal nəticə və metodların təqdim edilməsi
bitstream -> 1. nsan inki afı Orqanizmin qurulu u 3
bitstream -> &&3&5B&&&&&Si&ER5ettiRE2
bitstream -> Dövlət Statistika Komitəsinin məlumatına Təranə Həsənova bəzən abortlardan
bitstream -> Hamlet İsaxanlı Təsisçi və Rektor
bitstream -> Stimularea electrică funcţională Radu Breahnă, Irina Turtureanu
bitstream -> Udc 616. 12-009. 72-056. 52-008. 9-092: 612. 018 Adipocytokine changes in patients with stable angina and obesity
bitstream -> L. A. MƏMMƏdov, E.Ç. ƏKBƏrov, H.Ə. ƏKBƏrov