A dissertation submitted in fulfilment of the requirement for the degree of doctorate of science in the department of biochemistry and microbiology, faculty of science and



Yüklə 3,8 Mb.
Pdf görüntüsü
səhifə10/10
tarix27.08.2017
ölçüsü3,8 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
A1. Resuspending buffer (pH 7.4) 
8.18  g  of  0.14  M  NaCI;  2.36  g  of  15mM  Tris-HCI  and  0.9  g  of  0.005  M  glucose  were 
dissolved and made up to 1000 ml with distilled water. 
A2. Washing buffer (pH 6.5) 
32.77 g of 0.113 M Nacl; 3.053 g of 4.3 mM Na2HPO4; 3.741 g of 4.3 mM of K2HPO4; 
14.64 g of 24.4 mM of NaH2PO4; 5.45 g of 5.5 mM glucose; and 1.86 g of 1 mM EDTA 
were dissolved in 5000 ml of distilled water. 
A3. Tris buffer (Ph 7.4) containing EDTA and NaCl 
7.88g of 50 mM Tris-HCI; 2.79 g of 7.5 mM EDTA; and 10.227 g of 175 mM NaCI were 
dissolved and made up to 1000 ml with distilled water. 
A4. ADA (acid dextrose 

 anticoagulant) 
100 g of dextrose; 68.296 g Citric acid and 124.95 g trisodium citrate were dissolved in 
5000 ml of distilled water.  
A5. Phosphate buffer (pH 6.6, 0.2M) 
18 ml of 0.2 M KOH and 50 ml of 0.2 M KH2PO4 were mixed and made up to 100ml 
with distilled water.
 
A6. Homogenisation buffer pH 7.0 
87.65g of of 250 mM of sucrose, 1 crushed protease inhibitor tablet and 7.88g of Tris-
HCl (50 mM) were mixed together and  made up to 100 ml with distilled water. 
 
 

 
 
 
6-153 
 
A
PPENDIX 

B. Details of some methodologies 
B1. Extraction and isolation of betulinic acid 
The leaves of Melaleuca bracteata var. revolution gold were plucked from the stuck and 
allowed  to  air  dry  at  room temperature.  The  leaves  (500  g)  were  weighed  in  a  beaker 
and  were  then  extracted  by  cold  maceration  in  dichloromethane  (1.5  w/v)  at  room 
temperature  (5L  X  3)  for  24  hours.  The  combined  filtrate  was  concentrated  under 
reduced pressure by using a rotator evaporator at 40 
o
C and allowed to air dry at room 
temperature,  yielding  0.6  %  of  the  crude  extract.  The  mass  obtained  from  the  crude 
extract  was  defatted  with  n-hexane.  A  portion  (5  g)  of  the  residue  was  subjected  to 
chromatographic separation on silica gel (60-120 mesh) columns (20 x 5.5 cm) and was 
eluted  with  a  gradient  of  hexane/ethyl  acetate  (8:2  to  7:3)  for  the  isolation  of  betulinic 
acid.  Eighty  fractions  of  elutes  (20  ml)  were  collected  and  monitored  with  thin-layer 
chromatography. The TLC plates (aluminium sheets 20 cm × 20 cm) were first viewed 
under ultraviolent light, before being developed by spraying them with 10% H
2
SO

and 
then  dried  with  a  hot  dryer.  Similar  fractions  containing  the  desired  compound  were 
combined. These were further concentrated by using a rotator evaporator at 40 
o
C and 
recrystallized  in  methanol.  The  isolated  compound  was  characterized  with  spectral 
analysis (NMR, IR and MS).  
B2. Synthesis of acetyl derivative 
The  betulinic  acid  isolated  from  Melaleuca  bracteata  was  dissolved  in  a  conical  flask 
containing  pyridine  (10  ml)  and  acetic  anhydride  (12  ml).  The  mixture  was  refluxed 
under a fume cupboard for 8 hours at 40° C. The reaction was stopped by transferring 
the  mixture  into  beakers  containg  250  ml  of  water.  This  was  then  filtered  using 
Whatman  No.  1  filter  paper.  The  filtrate  was  air  dried  and  weighed  to  calculate  the 
percentage  yield.  The  acetylate  compound  was  confirmed  using  spectral  analysis 
(NMR, IR and MS). 
B3. Chelating activity of Fe
2+ 

 
 
 
6-154 
 
The various concentrations (0 -.5 mg/100 ml CH3OH) of the compounds 5mM ferrozine 
and 2mM FeCl
2
 were prepared. Test tubes were set up in triplicate for each compound. 
One  milliliter  of  compound  was  diluted  with  3.75  ml  of  distilled  water  and  then  mixed 
with 0.2 ml of ferrozine and 0.1ml of FeCl
2
. The mixture then stood for 10 minutes and 
mixed at intervals. The mixture was read at 562 nm to determine their chelating activity. 
EDTA  and  citric  acid  served  as  a  positive  control  and  distilled  water  served  as  the 
negative control. The percentage chelating activity of the compounds was calculated as; 
 % chelating activity = [1-At/Ac] x100 
At is the absorbance of treated sample whereas Ac is absorbance of control. 
The IC
50
 of the compounds was calculated using statistical package origin 6.1  
B4. MTT cell proliferation assay 
MTT  (5  mg/ml)  was  prepared  with  a  phosphate  buffer.The  cells  were  cultured  in  a  25 
cm
2
 flask to confluency and trysinsed. They were then pipetted into a 48-wells plate at 
specific  seeding  densities  (2.5  x  10

cells  per  well).  The  cells  were  incubated  for  24 
hours  at  37°C  and  fresh  medium  (MEN  +  Glutmax  +  antibiotic)  was  added.  The 
compounds were then added in triplicate and further incubated for 4 hours. The medium 
was removed and replaced with complete medium (MEM + Glutmax + antibiotics + 10 
%  Fetal  bovine  serum).  After  48  hours  the  complete  medium  was  replaced  with  MTT 
(200 
μl) and 
the 
cell culture  medium (200 μl)  w
as  incubated  for  another  4  hours.  The 
MTT  and  cell  culture  medium  was  removed  from  the  48-wells  plate  after  the  4  hours. 
The  reaction  in  each  plate  was  stopped  by  DMSO  and  dissolved  in  formazan  crystal. 
The  absorbance  of  mixture  on  the  plates  was  read  at  570  nm  using  the  Biotek  plate 
reader  ELx808  IU.  The  graph  of  the  cell  survivial  was  plotted  against  compound 
concentrations.  The  LC50  (Lethal  concentration  at  50  %  cytotoxicity  mortality)  was 
calculated by regression analysis using the QED statistics program. 
 
 

 
 
 
6-155 
 
B5. chromogenic substrate 
The  chromogenic  substrate  (0.008  M)  was  prepared  with  distilled  water  and  various 
concentrations  of  compounds  (1-5  mg/ml)  were  prepared  with  tris  buffer.  A  96-wells 
plate  was  used  and  the  experiment  was  triplicated.  Compounds  (50  µl)  and  10  µl  of 
thrombin  (30  U/ml)  were  incubated  in  corresponding  wells  for  10  minutes  at  25  °C. 
Chromogenic substrate (190 µl) was then added and changes in absorbance at 415 nm 
for 4 minutes at 12 second intervals were read by using the Biotek plate reader ELx808 
IU.  DMSO  (1  %)  served  as  a  negative  control.  The  percentage  antithrombin  was 
calculated using the following formula; 
%  Antithrombin activity = [1-At/Ac] x100 
At is the absorbance of treated sample and Ac is the absorbance of control. 
The IC
50
 of the compounds was calculated using the statistical package Origin 6.1.   
B6. Acetylcholinesterase assay 
Different concentrations of the compounds (0.25, 0.5, 1.0 mg/ml) were prepared for anti-
acetylcholinesterase studies. The acetylcholinesterase assay kit was used following the 
instructions  described  by  the  manufacturer.  The  acetylcholinesterase  inhibitory  activity 
of the compound was calculated using the following formula;  
AChE Activity (units/L) =          (A412) final 

 (A 412) initial × n × 200  
  
                                                      (A 412) calibrator 

 (A412) blank 
 
(A412) finial = absorbance measurement after 10 minutes of incubation of the samples 
at room temperature 
(A412) intial = absorbance measurement after 2 minutes of incubation of the samples at 
room temperature 
n = the dilution factor (10, 20 and 100) 

 
 
 
6-156 
 
200  =  the  equivalent  activity  (units/L)  of  the  Calibrator.  When  assayed,  it  is  read  at  2 
minutes and 10 minutes.  
(A412) calibrator = the absorbance of the calibrator at 10 minutes 
(A412) blank = absorbance of the blank at 10 minutes 
B7. Cotton pellet-induced granuloma 
The  anti-inflammatory  activity  of  the  compound  was  investigated  by  the  cotton  pellet- 
induced granuloma model. Twenty Sprague-Dawley rats (220 ± 20 g) were divided into 
four  groups  of five  rats  each  and allowed  to  acclimatize for  5  days.  The  animals  were 
pre-administered with the compounds thirty minutes before interscapular implantation of 
(20  mg)  pre-weighed  sterile  cotton  pellets.  The  rats  were  anesthetized  prior  to 
implantation of the cotton pellets. Inflammation was induced by making an intrascapular 
incision and then implanting the (20 mg) sterilized cotton pellet subcutaneously between 
the  scapulae  of  each  rat.  The  incisions  were  covered  with  medical  plaster  in  order  to 
secure the implanted cotton pellets.  
The  compounds  were  orally  administered  to  the  animals  in  the  respective  groups  for 
seven consecutive days, starting from the day of sterilized cotton pellet implantation. On 
the  eighth  day,  the  rats  were  anaesthetized  and  the  implanted  cotton  pellets  were 
carefully dissected out. These were made free from extraneous tissues. The wet pellets 
were  separately  weighed  and  dried  in  an  oven  at  60 
o
C  for  24  hours.  The  differences 
between the dry and wet pellets were taken as measurements of the formed granuloma 
weight. The anti-proliferation effects of the compounds were compared with the control. 
The percentage inflammation inhibition was calculated using the following formula: 
% inhibition = (Wc 

Wt/ Wc) x 100 
Wc = the pellet weight of the control group rats  
Wt = the pellet weight of drug treated rats  
The dried cotton pellets were digested and the hydrolysate  was used to investigate the 
catalase and superoxide dismutase (SOD) activity of the compounds 

 
 
 
6-157 
 
B8. COX activity 
The COX activity of the homogenate was determined using  the  COX activity assay kit 
(it
em  NO.  760151,  Cayman  chemical)  following  the  manufacturer’s  instruction
s.  The 
reaction mixture, consisting of 
assay buffer (120 μl), homogenate or COX standard (40 
μl), heme (10 μl)
, and either inhibitor of COX-1 or  COX-
2 (40 μl)
,  were pipetted into a 
96-wells tray. This mixture was incubated for 5 mintes at room temperature. Colorimeter 
substrate (20 μl) was then added to the mixture along with arachidonic acid (20 μl) to 
intiate  the  reaction.  The  mixture  was  further  incubated  for  5  minutes  at  room 
temperature.  The  oxidation  of  calorimeter  substrate  was  read  at  590  nm  using  Biotek 
plate  reader  ELx808  IU.  The  experiment  was  triplicated  and  the  percentage  of  COX 
inhibition was calculated using the following formula: 
% Inhibition =   Total COX activity - COX activity × 100 
                       
                                    Total COX activity 
B9. Determination of SOD content 
The various concentrations (0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10 mg/ml) of diethyl ether were 
prepared and absorbances were read at  420 nm using the Biotek plate reader ELx808 
IU. These values were used to plot the standard curve.   
0
5
10
15
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
 Concentration (mg/ml)
A
b
s
o
rb
a
n
c
e
 (
n
m
)
 
Figure B1: Calibration curve of SOD concentration (mg/ml) against absorbance (nm). 
 

 
 
 
6-158 
 
A
PPENDIX  

C.Spectra  
C1. Spectra for BA 
 
Figure C1.1a: 
1
H-NMR spectrum of BA 

 
 
 
6-159 
 
 
Figure C1.1b: 
1
H-NMR spectrum of BA 

 
 
 
6-160 
 
 
Figure C1.2a: 
13
C-NMR spectrum of BA 

 
 
 
6-161 
 
 
Figure C1.2b:
13
C-NMR spectrum of BA 

 
 
 
6-162 
 
 
Figure C1.3a: IR spectrum of BA 
 

 
 
 
6-163 
 
 
Figure C1.3b: IR spectrum of BA 

 
 
 
6-164 
 
 
Figure C1.4a: Mass spectroscopy of BA 
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 315 
 165 
 393 
 195 
 472 
 299 
 540 
Peak True - sample "1:1", peak 21, at 1379.8 s

 
 
 
6-165 
 
 
Figure C1.4b: Mass spectroscopy of BA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 315 
 165 
 393 
 195 
 472 
 299 
 540 
Peak True - sample "1:1", peak 21, at 1379.8 s

 
 
 
6-166 
 
 
Figure C2.1a: 
1
H-NMR spectrum of BAA  

 
 
 
6-167 
 
 
Figure C2.1b:  
1
H-NMR spectrum of BAA 

 
 
 
6-168 
 
 
 Figure C2.2: 
13
C-NMR spectrum of BAA 

 
 
 
6-169 
 
 
Figure C2.3a: IR spectrum of BAA 
 

 
 
 
6-170 
 
 
Figure C2.3b: IR spectrum of BAA 

 
 
 
6-171 
 
 
Figure C2.4a: Mass spectroscopy of BAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 178 
 147 
 163 
 135 
 451 
 499 
 352 
 327 
 477 
 390 
 519 
 426 
 310 
 212 
 192 
 262 
 244 
 289 
Peak True - sample "2:1", peak 29, at 799.9 s

 
 
 
6-172 
 
 
Figure C2.4b: Mass spectroscopy of BAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 517 
 210 
 312 
 365 
 341 
 133 
 167 
 493 
 244 
 327 
 450 
 415 
 386 
 185 
 276 
 475 
 254 
Peak True - sample "2:1", peak 26, at 738.5 s

 
 
 
6-173 
 
 
Figure C3.1a: 
1
H-NMR spectrum of BA/OA 

 
 
 
6-174 
 
 
Figure C3.1b: 
1
H-NMR spectrum of BA/OA 
 

 
 
 
6-175 
 
 
Figure C3.2a: 
13
C-NMR spectrum of BA/OA 

 
 
 
6-176 
 
 
Figure C3.2b: 
13
C-NMR spectrum of BA/OA 

 
 
 
6-177 
 
 
 
Figure C3.3a: IR spectrum of BA/OA 

 
 
 
6-178 
 
 
Figure C3.3b: IR spectrum of BA/OA 

 
 
 
6-179 
 
 
Figure C3.4a: Mass spectroscopy of BA/OA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 123 
 355 
 427 
 327 
 390 
 452 
 278 
 463 
 302 
 485 
 142 
 409 
 265 
 505 
 221 
 315 
 168 
 201 
 372 
 231 
 252 
 540 
Peak True - sample "3:1", peak 25, at 1417.4 s

 
 
 
6-180 
 
 
Figure C3.4b: Mass spectroscopy of BA/OA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 178 
 161 
 134 
 315 
 224 
 118 
 280 
 465 
 190 
 397 
 247 
 371 
 333 
 420 
 481 
 509  527 
 261 
 434 
 202 
Peak True - sample "3:1", peak 16, at 1294.4 s

 
 
 
6-181 
 
 
Figure C3.4c: Mass spectroscopy of BA/OA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 123 
 355 
 427 
 327 
 390 
 452 
 278 
 463 
 302 
 485 
 142 
 409 
 265 
 505 
 221 
 315 
 168 
 201 
 372 
 231 
 252 
 540 
Peak True - sample "3:1", peak 25, at 1417.4 s

 
 
 
6-182 
 
 
Figure C4.1: 
1
H-NMR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-183 
 
 
Figure C4.2a: 
13
C-NMR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-184 
 
 
Figure C4.2b: 
13
C-NMR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-185 
 
 
Figure C4.3a: IR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-186 
 
 
Figure C4.3b: IR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-187 
 
 
Figure C4.3b: IR spectrum of BAA/OAA 

 
 
 
6-188 
 
 
Figure C4.4a: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 129 
 115 
 284 
 185 
 171 
 143 
 241 
 456 
 198 
 255 
 338 
 423 
 213 
 539 
 446 
 378 
 158 
 517 
 317 
 396 
 483 
 223 
 359 
Peak True - sample "4:1", peak 8, at 1284.9 s

 
 
 
6-189 
 
 
Figure C4.4b: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 145 
 506 
 538 
 313 
 416 
 183 
 125 
 298 
 253 
 216 
 448   475 
 197 
 323 
 166 
 492 
 270 
 395 
 342 
 380 
Peak True - sample "4:1", peak 9, at 1444.8 s

 
 
 
6-190 
 
 
Figure C4.4a: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 129 
 115 
 284 
 185 
 171 
 143 
 241 
 456 
 198 
 255 
 338 
 423 
 213 
 539 
 446 
 378 
 158 
 517 
 317 
 396 
 483 
 223 
 359 
Peak True - sample "4:1", peak 8, at 1284.9 s

 
 
 
6-191 
 
 
Figure C4.4b: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 145 
 506 
 538 
 313 
 416 
 183 
 125 
 298 
 253 
 216 
 448   475 
 197 
 323 
 166 
 492 
 270 
 395 
 342 
 380 
Peak True - sample "4:1", peak 9, at 1444.8 s

 
 
 
6-192 
 
 
Figure C4.4c: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 129 
 115 
 284 
 185 
 171 
 143 
 241 
 456 
 198 
 255 
 338 
 423 
 213 
 539 
 446 
 378 
 158 
 517 
 317 
 396 
 483 
 223 
 359 
Peak True - sample "4:1", peak 8, at 1284.9 s

 
 
 
6-193 
 
 
Figure C4.4d: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 149 
 112 
 425 
 332 
 383 
 458 
 410 
 369 
 270 
 133 
 448 
 507 
 527 
 314 
 203 
 495 
 236 
 283 
 166 
 183 
Peak True - sample "4:1", peak 7, at 1181 s

 
 
 
6-194 
 
 
Figure C4.4d: Mass spectroscopy of BAA/OAA 
 
 
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
 281 
 191 
 133 
 249 
 265 
 499 
 393 
 172 
 204 
 412 
 526 
 224 
 360 
 309 
 115 
 470 
 155 
 323   349 
 432 
 482 
Peak True - sample "4:1", peak 4, at 438.1 s

 
 
 
6-195 
 
A
PPENDIX  

D.  Ethics Clearance 
 
 
 
 
 
 
 
 


Yüklə 3,8 Mb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə