A dissertation submitted in fulfilment of the requirement for the degree of doctorate of science in the department of biochemistry and microbiology, faculty of science and

2.16  Problem statement 
The  diseases  associated  with  platelet  aggregation  are  among  the  leading  causes  of 
death  in  the  world  today;  these  include  heart  attacks,  stroke,  pulmonary  hypertension 
and  angina  pectoris.  Antiplatelet  aggregation  therapy  treatment  and  prevention  has 

 
 
 
2-69 
 
undergone  dramatic  changes  and  improvement  over  the  years.  Various  synthesized 
drugs  have  been  formulated  for  the  treatment  of  diseases  associated  with  platelet 
aggregation  which  have  been  shown  to  be  effective,  but  are  unfortunately  not  without 
side  effects.  These  problems  have  created  the  need  to  formulate  new  drugs  with 
improved  clinical  safety  and  efficacy  at  a  reduced  cost.  This  study  aims  to  investigate 
the  antiplatelet  aggregation  activities  of  betulinic  acid  and  derivatives  from  Melaleuca 
bracetata var. revolution gold. 
2.17  Aims and objectives 
2.17.1  Aims 
This  project  aims  to  extract  and  isolate  betulinic  acid  from  Melaleuca  bracteata  var. 
revolution gold, and synthesize some of its derivatives, which will be evaluated for their 
antiplatelet  aggregation,  anti-inflammatory  activities  and  possibly  determine  the 
apparent mechanism of action. 
2.17.2  Objectives 
The objectives of this study are to: 
      Collect and identify Melaleuca bracteta var. revolution gold 
Extract, isolate and characterize betulinic acid 
Synthesize betulinic derivatives 
Investigate the antithrombin properties of the compounds 
Investigate  the  antiplatelet  aggregation  activities  of  the  compounds  using  blood 
platelets from Wistar rats 
Investigate the anti-inflammatory activities of the compounds 
Investigate the mechanisms of action of the compounds 
     Evaluate  the  cytotoxicity  potential  of  the  compounds  using  human  hepatocellular   
carcinoma (HepG2) and human embryonic kidney (HEK293) 

 
 
 
2-70 
 
2.18   Research hypothesis 
 Pentacyclic triterpenes have platelet aggregation inhibitory potential, therefore Betulinic 
acid and its derivatives exhibit anti platelet aggregation activities. 
 
 

 
 
 
3-71 
 
Chapter three 
3. 
Materials and methods 
The  materials  used for  this  research  work  are  listed  below  and  a brief methodology  is 
also  given.  The  full  details  of  reagent  preparations  and  the  methodology  used  are 
presented in Appendix A and B respectively. 
3.1 
Materials 
3.1.1 
List of equipment 

  Incubator (Labcom) 

  Rotor evaporator (Heidolph
—
Laborota 4000) 

  pH meter (Hanna Instruments) 

  Centrifuge- 5404R Eppendorf (Merck) 

  Platform shaker - Labcon (Polychem supplies) 

  BiotekElx 808 UI plate reader (Biotek Instrument Suppliers) 

  U-bottom 96-well plate (Sigma)  

  Spectrophotometer
—
Spekol 1300 (Polychem supplies) 

  Barnstead or Electothermal digital melting point apparatus (Thermo Scientific) 

  Dissecting set (Laboratory and Scientific Equipment Company (PTY) (Lasec) 

  Columns of different sizes (Merck) 

  Nuclear magnetic resonance (Bruker) 

  Infrared spectroscopy (Perkin Elmer)  

  Ulta-violet visible spectroscopy ( Perkin Elmer)  

  Grinder
—
IKA (Werek) 

  Microwave oven 
–
 Defy model DMO 353 

  Light microscope 
 
 

 
 
 
3-72 
 
3.1.2 
Chemicals and reagents (see Appendix  A for reagent details) 
The chemical solvents and regents for this project were all of analytical grade. 
3.1.2.1 
Chemicals supplied by sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA  
Deuterated  dimethyl  sulfoxide  d
6
,  deuterated  Chloroform,  Thrombin,  Adenosine 
diphosphate,  Citric  acid,  Methanol,  Ethyl  acetate,  Glucose,  Epinephrine,    Dextrose, 
Trizma HCl, 2-Thiobarbituric acid, Ferric chloride, Ferrozine (Benzenesulfonic acid, 4,4'-
(3-(2-pyridinyl)-1,2,4-triazine-5,6-diyl)  bis-  disodium  salt),  n
–
hexane,  Ferrous  chloride, 
Acetic  anhydride,  Mercury  (II)  chloride,  Potassium  iodide,  Potassium  persulfate,  and 
Potassium ferrocyanide. 
3.1.2.2 
Chemicals supplied by Merck, Darmstadt, Germany 
Glacial  acetic  acid,  calcium  chloride,  hydrochloric  acid,  tri-Sodium  citrate,  sodium 
hydroxide, sodium chloride, silica gel 60 0.040-0.063 mm (230-400 mesh ASTM), silica 
gel  60  0.063-0.200  mm  (70-230  mesh  ASTM),  sulphuric  acid  silica  gel  60  0.2-0.5 mm 
(30-70  mesh  ASTM),  acid  purified  sand,  chloroform,  hexane,  ethylacetate,  TLC 
aluminium sheets 20x20 cm, and Silica gel 60 F254. 
3.1.2.3 
Chemicals supplied by other sources 

  disodium hydrogen phosphate (Lab. Consumables and Chemical Supplies) 

  dipotassium hydrogen phosphate (Associated Chemical Enterprises) 

  ammonium solution (NT Supplies) 

  ethylenediaminetetra-acetic acid (Associated Chemical Enterprises) 

  S-2238 (Chromogenix) (Instrumentation Laboratory Company) 

  sodium dihydrogen phosphate (Lab. Consumables and Chemical Supplies) 
3.2 
Methods (see Appendix B for details)   
3.2.1 
Collection and identification of plants 
The  leaves  of  Melaleuca  bracteata  var.  revolution  gold  were  harvested  from  trees 
growing  around  the  University  of  Zululand,  KwaDlangezwa  campus,  South  Africa. 

 
 
 
3-73 
 
These  leaves  were  taken  to  the  Department  of  Botany,  University  of  Zululand  for 
identification  and  voucher  specimen  (VN  0256)  was  deposited  at  the  University 
herbarium.  
3.2.2 
Extraction and isolation of betulinic acid 
The  method  described  by  Habila  and  colleagues  (2011)  was  used  to  extract  betulinic 
acid from Melaleuca bracteata var. revolution gold. The leaves were allowed to air dry at 
room temperature  and  then  extracted by cold maceration in  dichloromethane (1.5 w/v) 
at  room  temperature  (5L  X  3)  for  24  hours.  The  combined  filtrate  was  concentrated 
under  a  reduced  pressure  by  using  the  rotator  evaporator  at  40 
o
C  and  allowed  to  air 
dry at room temperature, yielding 0.6 % of the crude extract. The mass  obtained from 
the  crude  extract  was  washed  with  n-hexane  (80  %)  twice  to  remove  oily  materials. A 
portion (5 g) of the residue was subjected to chromatographic separation on a silica gel 
(60-120 mesh) column (20 x 5.5 cm) and eluted with a gradient of hexane/ethyl acetate 
(8:2  to  7:3)  for  the  isolation  of  betulinic  acid.  Eighty  fractions  of  eluates  (20  ml)  were 
collected and monitored with thin-layer chromatography. Similar fractions containing the 
desired  compound  were  combined.  These  were  further  concentrated  by  a  rotator 
evaporator  at  40 
o
C  and  recrystallized  in  methanol.  The  isolated  compound  was 
characterized by spectral analysis (NMR, IR and MS). 
3.2.3 
Preparation of betulinic derivatives 
The  method described  by  Adrine  et  al  (2012)  was  adopted,  with  slight  modification,  to 
synthesize  acetyl  derivatives  of  BA  (Figure  3.1).  A  portion  of  betulinic  acid  (2  g)  was 
mixed with pyridine (10 ml) and acetic anhydride (12 ml) in  a round bottom flask. This 
mixture was then refluxed in a fume cupboard for 8 hours at 40 
0
C. Distilled water (25 
ml)  was  used  to  terminate  the  reaction.  The  mixture  was  stirred  for  45  minutes  and 
filtered. The filtrate was rinsed with HCl (12 %) to remove pyridine and then air-dried at 
room  temperature.  The  compound  was  purified  by  subjecting  it  to  chromatographic 
separation  on  silica  gel  (60  x  120  mesh)  columns  (20  x  5.5  mm)  and  by  using  the  n-
hexane and acetyl acetate solvent system (8:2 to 7:3) to elute. A total of 50 fractions of 

 
 
 
3-74 
 
eluates  (20  ml)  were  collected  and  similar  fractions  (based  on  thin-layer 
chromatography)  were  combined  and  concentrated  in  vacuo  at  40 
o
C.  The  compound 
was recrystallized in methanol to form a yellowish powder.  The spectral analysis (NMR, 
IR, and MS) was used to confirm the compound.  
O
H
3
C
O
CH
3
O
HO
CH
3
CH
3
CH
3
H
CO
2
H
H
CH
3
H
3
C
H
3
C
CH
2
H
O
CH
3
CH
3
CH
3
H
CO
2
H
H
CH
3
H
3
C
H
3
C
CH
2
H
OH
O
Acetic anhydride
BA
BAA
Pyridine
 
Figure 3.1: Schematic diagram for synthesis of BAA 
3.2.4 
Isolation of betulinic and oleanolic acid  
The  method  described  by  Habila  et  al.,  2011  was  followed,  with  slight  modification,  to 
extract a mixture of betulinic and oleanolic acid from Melaleuca bracetata var. revolution 
gold. The leaves (600 g) were allowed to air dry and were extracted by cold maceration 
in ethyl acetate at room temperature (5L X 3) for 72 hours. The filtrate was concentrated 
on a rotator evaporator at 40
o
C and dried at room temperature (25 
o
C) to yield 8 % of 
the  crude  extract.  The  crude  extract  was  defatted  using  n-hexane.  The  crude  extract 
(6g)  was  then  subjected  to  chromatographic  separation  on  silica  gel  (60x120  mesh) 
columns (20 x 5.5 cm) and solvent system hexane/ethylacetate (8:2 to 7:3). A total of 46 
fractions of eluates (2 ml) were collected. Similar fractions were combined by monitoring 
with  thin-layer  chromatography.  This  fraction  was  concentrated  and  recrystallized  with 
methanol. Spectral analysis (NMR, IR, and MS) was carried out on the compounds for 
confirmation.   
3.2.5 
Preparation of betulinic and oleanolic acids derivatives 
The  method  described  by  Andrine  et  al.,  2012,  as  modified  and  described  in  section 
3.2.3 above, was employed to prepare the acetyl derivatives of the two acids mixtures 
(Figure 3.2). The spectral analysis (NMR, IR, MS) was carried out on the compound for 

 
 
 
3-75 
 
confirmation.  
 
Figure 3.2: Schematic diagram for synthesis of BAA/OAA from BA/OA 
3.2.6 
Structural elucidation 
All  NMR  experiments  were  conducted on  a 400  MHz  Bruker  Ultrashield  spectrometer. 
BA  and  the  BA/OA  mixture  were  dissolved  separately  in  a  mixture  (1:2)  of  deuterated 
chloroform  and  methanol-d4,  whereas  BAA  and  BAA/OAA  were  separately  dissolved 
separately in deuterated chloroform. Infrared spectra were recorded with a PerkinElmer 
Spectrum  FTIR  spectrophotometer.  Mass  data  was  run  on  the  Agilent  1100  series 
LC/MSD trap system Electrospray ionization. All solvents and reagents were purchased 
from  Sigma-Aldrich  and  were  used  as  received.  Melting  points  were  recorded  on  an 
Electrothermal (Thermoscientific) digital melting point apparatus and were uncorrected 
3.2.7 
Experimental animals 
Ethical  clearance  (UZREC  171110-030  PGD  2014/53;  see  Appendix    D)  for 
experimental animals was obtained from the Research Animal Ethic Committee (RAEC) 
of  the  University  of  Zululand.  The  guidelines  for  the  proper  care  of  animals  and 
conducting of animal experiments were followed.  Sprague
–
Dawley rats (9 weeks, 230- 
260  kg)  of  both  sexes  were  collected  from  the  animal  house  in  the  Department  of 
Biochemistry  and  Microbiology,  University  of  Zululand.  The  animals  were  housed  in 
C
H
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CO
2
H
CH
3
C
H
3
H
H
H
HO
O
O
CH
3
O
C
H
3
N
C
H
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CO
2
H
CH
3
C
H
3
H
H
H
O
O
O
H
Oleanolic acid (OA)
+
C
H
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CO
2
H
H
H
H
H
HO
CH
2
C
H
3
C
H
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CO
2
H
H
H
H
H
O
CH
2
C
H
3
O
O
H
3-

-acetonyloleanolic acid  (OAA)
+
Betulinic acid  (BA)
3-

-acetonylbeutilinic acid (BAA)

 
 
 
3-76 
 
standard  cages  and  were  maintained  under  standard  environmental  conditions  (room 
temperature,  with  12:  12  light:  dark  cycle),  having  access  to  normal  pellet  feeds  and 
drinking water. 
3.2.8 
In vitro antiplatelet aggregation study 
3.2.8.1 
Preparation of compounds and derivatives for anti-platelet aggregation 
study 
Various  concentrations  of  the  compounds  (1  mg/ml,  3  mg/ml,  5  mg/ml  and  10  mg/ml) 
were prepared by dissolving the compounds and their derivatives in a 1 % DMSO that 
contained a few drops of tween 20. 
3.2.8.2 
Preparation of blood platelets 
The blood platelets were obtained  according to the method described by Tomita et  al. 
(1983),  with  slight  modification.  Eight  Sprague-Dawley  rats  were  sacrificed  by  cervical 
dislocation,  and  blood  (5  ml)  was  collected  surgically  from  the  abdominal  aorta  and 
mixed (5:1 v/v) with an anticoagulant (acid-dextrose anticoagulant, 0.085 mM citric acid, 
2 % dextrose). The blood was centrifuged at 1200 rpm for 15 minutes and at 2200 rpm 
for  3  minutes  consecutively.  The  supernatant  was  collected  and  centrifuged  again  at 
3200 rpm for 15 minutes. The supernatant was discarded and the sediment (platelets) 
re-suspended  in  5  ml washing  buffer  (PH  6.5).  The  washed  platelets  were  centrifuged 
again  at  3000  rpm  for  15  minutes  and  the  supernatant  discarded.  The  platelets  were 
suspended  in  a  buffer  (at  pH  7.4,  containing  0.14  M  NaCl,  15  mM  Tris-  HCl,  5  mM 
glucose). The working solution was prepared by further diluting (1:10) the platelets with 
resuspending buffer and supplementary calcium chloride (0.4 ml, 10 µl CaCl
2
). 
3.2.8.3 
Anti-platelet aggregation evaluation  
The  method  of  Mekhfi  and  co-workers  (2004)  was  used,  with  slight  modification.  The 
antiplatelet aggregation activity of the  compounds and their derivatives was separately 
tested on collagen (10 µg/ml), thrombin (5 µg/ml), ADP (10 µg/ml), and epinephrine (10 
µg/ml)  induced  platelet  aggregation.  The  platelets  (200  µl)  and  20  µl  of  the  different 
concentrations  of  the  compounds  and  derivatives  (1,  3,  5  and  10  mg/ml)  were 

 
 
 
3-77 
 
separately pipetted into 96-well micro plates and pre-incubated at 37 
o
C for 5 minutes. 
The  agonist  (20  µl)  was  then  added  to  the  mixture  to  induce  platelet  aggregation. 
Platelet aggregation inhibitory activity of the compounds  was determined by the Biotek 
plate  reader  by  following  the  changes  in  absorption  at  415  nm  for  20  minutes  at  30 
second intervals. DMSO (1 %) served as a negative control, whereas aspirin served as 
the positive control. 
3.2.9 
Antithrombin activity (chromogenic: S2238) 
The method described by Rob et al., (1997) was adopted, with slight modification.  The 
various  test  compounds  (1,  3,  5,  10  mg/ml)  were  prepared  for  antithrombin  activity  by 
separately  solubilizing  them  in  5  %  DMSO.  These  were  then  diluted  to  a  final 
concentration of 1 % DMSO  with a Tris-HCl buffer (175 mM NaCl, 50 µl Tris-HCl, 7.5 
mM  EDTA,  pH  7.4).    A  portion  (50  µl)  from  the  prepared  solution  was  then  added  to 
thrombin  (10  µl)  in  96-well  plates.  The  mixture  was  left  for  10  minutes  at  room 
temperature  before  adding  chromogenic  substrate  (190  µl;  0.76  M).  The  reaction  was 
read  at  412  nm  for  8  minutes  at  1  minute  intervals  using  the  Biotek  ELx  808  UI  plate 
reader. DMSO (2 % v/v) in saline solution was used as a negative control.  
3.2.10  Determination of calcium levels in cytosol 
The level of calcium in cytosol was determined with Fura-2/AM following the method of 
Kim et al., (2006). The platelets were incubated with 5 µM of Fura-2/AM for 30 minutes 
at  37 
o
C  and  then  washed.  The  Fura-2-loaded,  washed  platelets  were  pre-incubated 
with the compounds (1, 3, 5 and 10 mg/ml) for 3 minutes at 37 
o
C in the presence of 1 
mM CaCl
2. 
The Platelets were stimulated to aggregate with thrombin for 5 minutes. The 
Fluorescence  Spectrofluorometer  was  used  to  measure  the  fluorescence  signals  from 
the  platelet  suspension.  The  fluorescence  emission  was  determined  at  510  nM,  with 
continuous excitation at 340nM and 380nM and changing every 0.5s. 
 
 

 
 
 
3-78 
 
The following formula was used to determine the Ca
2+
: 
Ca
2+
 in cytosol= 224nM x (F-Fmin) / (Fmax-F) 
224nM was the dissociation constant of the Fura-2-Ca
2+
 complex, while F minimum and 
F maximum represent the fluorescence level of intensity at very low and high intensity 
concentrations  and  Ca
2+
  concentrations  respectively.  Fmax  was  given  a  fluorescence 
intensity at 510 nm of the Fura-2- Ca
2+
 complex after the platelet suspension containing 
1 mM of CaCl
2
 had been solubilized by Triton X-100 (0.1 %). Fmin was the fluorescence 
intensity at 510nm of the Fura-2-Ca
2+
 complex after the platelet suspension containing 
20  mM  Tris/3  mM  of  EDTA  had  been  solubilized  by  Triton  X-100  (0.1%).  F  was  the 
fluorescence intensity of the Fura-2-complex at 510 nm after the stimulation of platelet 
suspension containing 1 mM CaCl
2
 with thrombin, with and without the compounds. 
3.2.11  ATP release assay 
Platelets  were  pre-incubated  for  3  minutes  with  various  concentrations  of  the 
compounds (1, 3, 5 and 10 mg/ml) and were then stimulated to aggregate by collagen 
following the method of PaI et al., (2011). The reaction was terminated and the samples 
were centrifuged. The supernatants were then used for the assay. The ATP release was 
measured in an Luminometer (Biotek plate reader ELx808) using the ATP assay kit. 
3.2.12  Determination of phosphodiesterase activity 
The  phosphodiesterase  inhibitory  activity  of  the  compounds  was  determined  by 
following  the  method  of  Razzell  (1963),  with  slight  modification.  The  reaction  mixtures 
consist  of 
50  μl  of 
0.5  mM  p-Nph-
5′
-TMP, 
100  μl 
of  0.1  M  TrisHCl  (pH  8.9), 
25  μl  of 
various concentrations (0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml,  1 mg/ml)  of the  compound and 
25 μl
 of 
the enzyme. The mixture was then incubated at 37°C for 15 minutes. The reaction was 
stopped with 50 μl of 
0.2  N  NaOH.   Absorbance  was  read  at  400  nm and percentage 
inhibition of the enzyme calculated. Caffeine served as a positive control.  
 
 

 
 
 
3-79 
 
3.2.13  Tail bleeding time assay 
Rat  tail  bleeding  time  was  measured  by  following  the  method  of  Wang  et  al.,  (2004), 
with  slight  modification.  Twenty  Sprague-Dawley  rats  were  divided  into  four  groups  of 
five  each.  Groups  one  to  four  were  administered  with  the  compounds  (10  mg/kg,  50 
mg/kg,  and  250  mg/kg)  and  aspirin  (40  mg/kg)  respectively,  and  after  2  hours  the 
animals  were  anaesthetized  with  sodium  pentobarbital  (50  mg/kg).  Anesthetized  rats 
were  placed  on  a  hotplate  and  the  tails  thermostated  at  37
o
C.  The  bleeding  time  was 
assessed  by  amputating  5mm  of  the  tail  tip  with  a  scalpel  and  was  blotted  onto  filter 
paper  every  30  seconds  until  the  paper  no  longer  stained  with  blood.  The  period 
between amputation and when bleeding stopped was taken as bleeding time. 
3.2.14  Cytotoxity test 
The  MTT  [3-(4,  5-dimethylthiazol-2yl)-2-5-diphenyltetrazoliumbromide]  cytotoxicity 
proliferation assay was used to measure the toxicity of betulinic acid and its derivatives 
by determining the absorbance of the cells in a culture (Mosman, 1983). The cells which 
were  used for this assay are the  human embryonic kidney cells (HEK293) and  human 
hepatocellular  carcinoma  cells  (HepG2).  The  cells  were  cultured  in  a  25  cm
2
  flask  to 
confluence,  which  was  then  trypsinised  and  plated  into  48-well  plates,  a  2.5  x  10
4 
seeding density per well and incubated overnight at 37 
o
C. Two exposure periods of 24 
hours  and  48  hours  were  chosen  to  determine  the  toxicity  of  betulinic  acid  and  its 
derivatives along with the positive control containing the cultured cells and the medium. 
The negative control contained the medium and samples. The percentage cell growths 
were calculated against the medium as a triplicate reading mean ± SD. The results were 
stated  as  concentrations  to  reduce  the  absorbance  of  treated  cells  by  50  %  with 
reference  to  the  control  (untreated  cells)  or  cancer  cell  growth  inhibitor  (D
50
)  and  the 
lethal dose IC
50
 values (µg/ml) of the compound derived from the growth curve. 
3.2.15  Anti- acetylcholine esterase activity of betulinic acid and its derivate 
The effects of the betulinic acid and its derivatives on acetylcholinesterase activity were 
determined using acetylthiocholine kits based on manufacturer (sigma-Aldrich, St Louis, 

 
 
 
3-80 
 
MO, USA) procedure.  
3.2.16  Iron (Fe

Kataloq: bitstream
bitstream -> Issn 2409-0255 (Print) issn 2410-1427 (Online)
bitstream -> A review of international experience
bitstream -> Yeni və orijinal nəticə və metodların təqdim edilməsi
bitstream -> 1. nsan inki afı Orqanizmin qurulu u 3
bitstream -> &&3&5B&&&&&Si&ER5ettiRE2
bitstream -> Dövlət Statistika Komitəsinin məlumatına Təranə Həsənova bəzən abortlardan
bitstream -> Hamlet İsaxanlı Təsisçi və Rektor
bitstream -> Stimularea electrică funcţională Radu Breahnă, Irina Turtureanu
bitstream -> Udc 616. 12-009. 72-056. 52-008. 9-092: 612. 018 Adipocytokine changes in patients with stable angina and obesity
bitstream -> L. A. MƏMMƏdov, E.Ç. ƏKBƏrov, H.Ə. ƏKBƏrov