A dissertation submitted in fulfilment of the requirement for the degree of doctorate of science in the department of biochemistry and microbiology, faculty of science and



Yüklə 3,8 Mb.
Pdf görüntüsü
səhifə7/10
tarix27.08.2017
ölçüsü3,8 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

2+
) chelation 
The  iron  chelation  effect  of  the  compounds  was  determined  by  following  the  method 
described by Decker and Welch (1990), with slight modification. In a beaker, 0.5 ml of 
compounds (0 - 5 mg/ml in methanol), were separately mixed with 0.05 ml of FeCl
2
 (2 
mM)  and  1.6  ml  of  dilute  water.    After  45  seconds,  the  reaction  was  intiated  by  the 
addition of 0.1 ml of ferrozin (5 mM). The mixture was further shaken and kept at room 
temperature (25 
o
C) for 10 minutes. The absorbance of the mixture was read at 562 nm. 
Citric acid and EDTA were used as positive controls. 
3.2.17  Anti-inflammatory evaluation 
3.2.17.1  Cotton pellet-induced granuloma test 
The proliferation phase of inflammation was investigated using the cotton pellet-induced 
granuloma model (Penn and Ashfor, 1963). Twenty Sprague-Dawley rats were divided 
into four groups of five rats each and allowed to acclimatize for 5 days (Figure 3.3). The 
animals were pre-administered with the compounds thirty minutes before interscapular 
implantation of pre-weighed (20 mg) sterile cotton pellets.  

 
 
 
3-81 
 
 
Figure 3.3: Animal model chart for inflammation evalution 
The  rats  were  anesthetized  (diethyl  ether)  prior  to  cotton  pellet  implantation. 
Inflammation was induced by making an intrascapular incision and then implanting the 
sterilized cotton pellet (20 mg) subcutaneously between the scapulae on each rat. 
The different concentrations of the compounds dissolved with DMSO (1 ml) were orally 
administered  to  the  animals  in  the  respective  groups  for  seven  consecutive  days, 
starting from the day of sterilized cotton pellet implantation. On the eighth day, the rats 
were  anesthetized  and  the  implanted  cotton  pellets  were  carefully  dissected  out.  The 
cotton  pellets  were  made  free  of  extraneous  tissue.  The  wet  pellets  were  separately 
weighed  and  dried  in  an  oven at  60 
o
C for 24  hours. The  differences  between  the  dry 
and wet pellets were taken as measurements of the formed granuloma weight. The anti-
proliferation effects of the compounds were compared with the control.  
Percentage inhibition was calculated using the following formula: 
% inhibition = ( Wc 

Wt/ Wc) x 100 
Wc = pellet weight of the control group rats  

 
 
 
3-82 
 
Wt = pellet weight of drug treated rats.  
The  dried  cotton  wool  pellets  were  digested  and  the  hydrolysate  used  to  estimate  the 
catalase and superoxide dismutase (SOD) stimulating potential of the compounds. 
3.2.18  In vitro cyclooxygenase (COX-1 and COX-2) inhibition assay 
The  in  vitro  cyclooxygenase  (COX-1  and  COX-2)  inhibitory  activity  of  various 
concentrations of the compounds and their derivatives were determined using the COX 
assay  kit  based  on  the  manufacturer  (sigma-Aldrich,  St  Louis,  MO,  USA)  procedure. 
This kit measures the peroxide activity of  cyclooxygenase (COX).   COX is also  known 
as  prostaglandin  H  synthase  (PGHS),  this  is  a  bifunctional  enzyme  showing  both 
cyclooxygenase  and  peroxidase  activities.  COX  converts  arachidonic  acid  to  a 
hydroperoxy  endoperoxide  (prostaglandin  G2;  PGG2)  and  the  peroxide  component 
reduces the endoperoxide to the corresponding alcohol (Furse et al., 2006). There are 
two  isoforms  of  COX:  COX-1  is  expressed  in  a  variety  of  cell  types  and  is  involved  in 
normal  cellular  homeostasis,  whereas  COX-2  is  responsible  for  the  biosynthesis  of 
prostaglandins  under  acute  inflammatory  conditions  (Bakhle,  2001).  This  inducible 
COX-2 is believed to be the target enzyme for the anti-inflammatory activity of NSAIDS. 
Unless otherwise stated the percentage inhibition of the compound on each parameter 
was calculated as: 
% inhibition = (1-(At/Ac))x 100 
Where At is the absorbance of the compounds and Ac is the absorbance of the control. 
3.2.19  Superoxide dismutase (SOD) activity 
The effects of various concentrations of compounds and the derivatives on  superoxide 
dismutase  activity  were  determined  using  the  SOD  kit, 
based  on  the  manufacturer’s
 
(sigma-Aldrich,  St  Louis,  MO,  USA)  procedure.  SOD  catalyses  the  breakdown  of 
superoxide anions into hydrogen peroxide and molecular oxygen. It is one of the most 
important  antioxidant  enzymes.  The  SOD  Assay  kit-WST  allows  very  convenient  SOD 
assaying by utilizing Dojindo’s highly water soluble tetrazolium salt.
 

 
 
 
3-83 
 
3.2.20  Catalase activity 
The  effects  of  various  concentrations  of  compounds  and  their  derivatives  on  catalase 
activity  were  determined  using  the  catalase  assay  kit, 
based  on  the  manufacturer’s 
procedure.  Catalase  is  an  antioxidant  enzyme  ubiquitously  present  in  mammalian  and 
non-mammalian cells. It catalyses the breakdown of hydrogen peroxide  into water and 
oxygen.  
3.2.21  Statistical analysis 
All  assays  were  performed  in  triplicates  and  data  expressed  as  a  mean  ±  SD.  Anova 
(one  way)  and  the 
post  hoc  Dunnett’s  test
s  were  used  to  analyse  the  data  using 
Graphpad prism, version 5.03. The statistical significance was given as P< 0.05.  
 

 
 
 
4-84 
 
Chapter four 
4. 
Results 
Betulinic  acid  and  a  mixture  of  betulinic  and  oleanolic  acids  (isolated  from  
bracetacta), along with their prepared acetyl derivatives, were screened for antiplatelet 
aggregation activities. The results obtained are presented below. 
4.1 
Compound Identification 
The  isolated  compounds  and  their  derivatives  were  identified  and  their  structures 
established through spectral NMR (1H and 13C), IR, MS analysis (Appendix  C) and by 
comparison with literature values (Habila et al., 2013).  
BA  (Figure  4.1)  Colourless  crystal;  mp  315-316 
o
C;  IR  (KBr)  v
max 
  3456,  2920,  2851, 
1724 cm
-1
; m/z (ESI) 455.2 (M
+
-
1); δH (400 MHz, CDCl

and CH
3
OD): 4.59 (1H, s), 4.46 
(1H, s), 3.10 (2H, d), 2.13 (2H, dd), 1.80 (2H, s), 1.45 (8H, m), 1.38 (11H, m), 0.80-1.17 
(21H, m); δC (100 MHz, CDCl

and CH
3
OD): see Table 4.1. 
BAA (Figure 4.2) white powder; mp 258-260 
o
C; IR (KBr) v
max 
 3424, 2919, 2851, 1724, 
1692, 1642, 1240 cm
-1
; m/z (ESI) 496.8 (M
+
-
1); δH (400 MHz, CDCl
3
): 4.71 (1H, s), 4.59 
(1H, s),  4.45 (1H, m), 2.98 (1H, m), 2.25 (1H, d), 2.15 (1H, d), 1.94 (5H, d), 1.59 (9H, 
m), 1.43 (3H, s), 1.40 (4H, m), 1.24 (3H, d), 1.17 (2H, s), 1.00 (8H, m), 0.80 (10H, m); 
δC (100 MHz, CDCl
3
): see Table 4.1. 
 
Figure 4.1: Chemical structure of betulinic acid 

 
 
 
4-85 
 
The presence of hydroxyl groups in the compounds was indicated by the appearance of 
an  absorption  band  between  3424  -  3456  cm
-1
  in  the  IR  Spectra.    The  C-H  stretching 
frequencies  were  observed  around  2851-2920  cm
-1
,  and  the  bands  that  are 
characteristic  of  the  presence  of  carboxylic  acid  in  a  molecule  were  observed  around 
1642 and 1729 cm
-1 
(Mahato and Kundu,1994). The proton NMR spectroscopy further 
confirmed the structure of BA and BAA. The 
I
H NMR spectrum of BA revealed various 
peaks  corresponding  to  the  methyl  groups  at  around  0.80-1.17  ppm  and  terminal 
methylene protons at 4.46

4.59 ppm, which is indicative of the presence of 48 hydrogen 
atoms  in  BA.  As  expected,  the 
I
H  NMR  spectrum  of  BAA  showed  the  presence  of  50 
hydrogen  atoms,  which  agrees  with  the  literature  regarding  previously  reported  values 
(Habila et al., 2011). In 
13
C NMR spectra, the appearance of two additional carbons for 
compound BAA assigned as C-31 and C-32 (Table 4.1) further confirmed the formation 
of BAA. The carboxylic acid carbon assigned as C-28 (Table 4.1) appeared as the most 
deshielded    around  178.8  and  182.2  ppm  for  both  BA  and  BAA  respectively,  which  is 
also in agreement with literature (Habila et al., 2011).
 
Further evidence for the isolation 
of BA and BAA was provided by the ESI-MS spectra  which  showed intense molecular 
ions  corresponding  to  M
+
-1  at  455.2  and  496.8  respectively.  The  calculated  molecular 
weight  for  BA  and  BAA  is  456  (molecular  formula 

  C
30
H
48
O
3
)  and  498  (molecular 
formula 

 C
32
H
50
O
4
) respectively. 
 
Figure 4.2: Chemical structure of 3-
β acetylbetulinic acid
 
 
 

 
 
 
4-86 
 
BA/OA (Figure 4.1, 4.3white powder; mp 290

292 
o
C; IR (KBr) v
max
 3553, 2990, 1739, 
1453, 1374, 1239, 1087 cm
-1
. δH (400 MHz, CDCl

and CH
3
OD): 4.96 (s, 1H), 4.44 (1H, 
s), 4.43 (1H, s), 3.11, 2.73, 1.98, 1.43, 1.29, 0.79-
1.24 (21H, m); δC (100 MHz, CDCl

and CH
3
OD): see Table 4.2. 
BAA/OAA  (Figure  4.2,  4.4)  white  powder;  mp  297-299
o
C;  IR  (KBr)  v
max 
2990,  1739, 
1451,  1373,  1235,  1045  cm
-1
;  δH  (400  MHz,  CDCl
3
):  5.18  (s,  1H),  4.60  (1H,  s),  4.47 
(1H, s), 4.34 (1H, s), 2.88, 2.11, 1.95, 1.93, 1.81, 1.57, 0.72 

 
1.49 (m); δC (100 MHz, 
CDCl
3
): see Table 4.2. 
 
Figure 4.3: Chemical structure of Oleanolic acid 
 
Figure 4.4: Chemical structure of 3-
β acetyloleanolic acid
 
The  isolation  of  the  BA/OA  mixture  from  Melaleuca  bracteata  and  the  synthesis  of 
BAA/OAA mixture were confirmed by the 
1
H, 
13
C NMR and IR spectroscopy. BA and OA 
are isomers and have Rf values of 0.62 and 0.68 respectively. Attempts to obtain each 
as a pure compound were unsuccessful (Ibrahim et al, 2013). The melting point of the 
compounds  mixture  (BA/OA  and  BAA/OAA)  was  also  determined  and  was  consistent 
with previously reported values (Ibrahim et al., 2013). The presence of hydroxyl groups 

 
 
 
4-87 
 
in the compounds was indicated by the appearance of an absorption band around 3553 
cm
-1
 in the IR Spectra. The C-H stretching frequencies were observed around 2990 cm
-
1
, and the bands that are characteristic of the presence of carboxylic acid in a molecule 
were observed around 1739 cm
-1 
(Mahato and Kundu, 1994). The 
I
H NMR spectrum of 
samples  3  and  4  both  revealed  various  peaks  corresponding  to  the  methyl  groups,  at 
around  0.72-1.49  ppm,  and  terminal  methylene  protons,  at  4.34

5.18  ppm.  Further 
confirmation  for  the  isolation  of  sample  1  and  for  the  formation  of  sample  2  was 
provided by 
13
C NMR spectroscopy.  The 
13
C NMR spectra of sample 1 and 2 actually 
showed  that  they  are mixtures. This  is  as  a result  of  the  appearance  of  60  carbons  in 
13
C NMR spectra of sample 1 (30 each for BA and OA as assigned in Table 4.2) and 64 
carbons  in 
13
C  NMR  spectra  of  sample  2  (32  each  for  BAA  and  OAA  as  assigned  in 
Table  4.2),  which  agrees  with  reported  data  for  related  compounds  (Seebacher  et  al., 
2003; Habila et al., 2013). For sample 2 the appearances of four additional carbons in 
the 
13
C spectrum (two each for BAA and OAA), assigned as C-31 and C-32 respectively 
(Table 4.2), further confirmed the formation of BAA/OAA.  
 
Table 4.1: 
13
C-NMR (100 MHz) spectral data for 1 and 2 
Position 
BA (1) 
BAA (2) 

38.4 (CH
2

38.1 

26.5 (CH
2

27.6 

78.4 (CH) 
80.7 

38.5 (C) 
37.5 

55.0 (CH) 
55.1 

17.9 (CH
2

17.8 

33.9 (CH
2

33.9 

40.2 (C) 
40.4 

50.1 (CH) 
50.1 

 
 
 
4-88 
 
10 
36.7 (C) 
37.5 
11 
20.5 (CH
2

20.5 
12 
25.1 (CH
2

25.1 
13 
37.9 (CH) 
38.1 
14 
42.0 (C) 
42.1 
15 
30.2 (CH
2

30.3 
16 
31.9 (CH
2

31.8 
17 
55.8 (C) 
56.1 
18 
46.6 (CH) 
46.6 
19 
48.8 (CH) 
48.9 
20 
150.3 (C) 
150.1 
21 
29.2 (CH
2

29.4 
22 
36.7 (CH
2

36.8 
23 
27.4 (CH
3

27.6 
24 
14.9 (CH
3

15.7 
25 
15.4 (CH
3

15.9 
26 
15.6 (CH
3

16.1 
27 
14.2 (CH
3

14.3 
28 
178.8 (C) 
182.2 
29 
18.8  (CH
3

19.0 
30 
109.3 (CH
2

109.8 
31 

170.8 (C) 
32 

23.4 (CH
3

Data reported in ppm. 

 
 
 
4-89 
 
Table 4.2:  
13
C-NMR (100 MHz) spectral data for samples 3 and 4 
Position  
Sample 3 (BA/OA) 
Sample 4 (BAA/OAA) 

38.5 (BA)   38.7 (OA)  (CH
2

38.1 (BAA)     38.2 (OAA)          

27.3 (BA)   29.2 (OA)  (CH
2

27.7 (BAA)     29.5 (OAA)         

78.2 (BA)   78.2 (OA)  (CH) 
81.2 (BAA)     81.2 (OAA)         

38.7 (BA)   40.2 (OA)  (C) 
38.2 (BAA)    40.5 (OAA)          

55.0 (BA)   55.9 (OA)  (CH) 
55.1 (BAA)     55.2 (OAA)        

17.8 (BA)   18.6 (OA)  (CH
2

18.0 (BAA)     19.0 (OAA)         

33.9 (BA)   32.6 (OA)  (CH
2

34.0 (BAA)     32.1 (OAA)         

40.2 (BA)   39.0 (OA)  (C) 
40.5 (BAA)     38.2 (OAA)        

50.1 (BA)   48.9 (OA)  (CH) 
50.3 (BAA)     49.9 (OAA)         
10 
36.7 (BA)   37.8 (OA)  (C) 
37.0 (BAA)     38.1 (OAA)         
11 
20.5 (BA)   23.7 (OA)  (CH
2

20.7 (BAA)      23.5 (OAA)        
12 
25.1 (BA)   125.10 (OA)  (CH
2

25.3 (BAA)      125.0 (OAA)      
13 
37.9 (BA)   137.8 (OA)  (CH) 
37.6 (BAA)      143.0 (OAA)      
14 
42.0 (BA)   42.1 (OA)  (C) 
42.2 (BAA)      42.3 (OAA)       
15 
30.2(BA)   27.6(OA)  (CH
2

30.4(BAA)       27.7 (OAA)       
16 
31.8 (BA)   23.7 (OA)  (CH
2

32.1 (BAA)      23.5 (OAA)      
17 
55.8 (BA)   46.7 (OA)  (C) 
56.0 (BAA)      46.8 (OAA)      
18 
46.6 (BA)   42.0 (OA)  (CH) 
46.8 (BAA)      42.2 (OAA)       
19 
48.8 (BA)   46.7 (OA)  (CH) 
49.0 (BAA)      46.8 (OAA)       
20 
150.2 (BA)  31.8 (OA)  (C) 
150.5 (BAA)     32.1 (OAA)      
21 
29.2 (BA)   33.9 (OA)  (CH
2

29.5 (BAA)       34.0 (OAA)      
22 
36.5 (BA)   32.6 (OA)  (CH
2

36.9 (BAA)       32.1 (OAA)      

 
 
 
4-90 
 
23 
27.5 (BA)   29.2 (OA)  (CH
3

27.7 (BAA)       29.5 (OAA)      
24 
14.8 (BA)   16.4 (OA)  (CH
3

14.4 (BAA)       16.2 (OAA)      
25 
15.1 (BA)   15.6 (OA)  (CH
3

15.7 (BAA)       15.9 (OAA)      
26 
15.3 (BA)   17.8 (OA)  (CH
3

15.6 (BAA)       18.0(OAA)      
27 
14.1 (BA)   26.2 (OA)  (CH
3

14.4 (BAA)       25.3 (OAA)       
28 
178.6 (BA)  180.2 (OA)  (C) 
178.9 (BAA)     178.9 (OAA)     
29 
18.6 (BA)    33.9 (OA)  (CH
3

19.0(BAA)        34.0 (OAA)       
30 
108.9 (BA)   23.7 (OA)  (CH
2

109.3 (BAA)     23.5 (OAA)      
31 

171.6 (BAA)    171.6 (OAA)    (C) 
32 

23.5 (BAA)      23.5 (OAA)      (CH
3

Data  is  reported  in  ppm.  BA  (Betulinic  acid),  OA  (Oleanolic  acid),  BAA  (Betulinic  acid 
acetate), OAA (Oleanolic acid acetate). 
4.2 
Cytotoxicity assay 
The  cytotoxicity  of  the  compounds  was  investigated  and  the  results  are  presented  in 
Table 4.3. 
Table 4.3: The IC
50 
(µg/ml) of betulinic acid and 3-
β acetylbetulinic acid on HEK293 
and HEPG2 cells  
Compound 
               IC
50
 (µg/ml) 
HEK 293 
HEPG2 
BA   
1027 
448 
BAA 
1051 
672 
BA/OA 
724 
585 
BAA/OAA 
499 
269 
 

 
 
 
4-91 
 
The  cytotoxicity  of  the  compounds  was  investigated  and  the  results  are  presented  in 
Table 4.3. The compounds (BA, BAA, BA/OA and BAA/OAA) displayed poor cytotoxicity 
activity against HEK293 (IC
50
 values of 1027 µg/ml, 1051 µg/ml, 724 µg/ml, 499 µg/ml 
respectively) and HepG2 cell lines (IC
50 
values of 448 µg/ml, 672 µg/ml, 585 µg/ml, 269 
µg/ml respectively). The compounds showed more cytotoxic effects on cancerous cells 
HEPG2 compared with normal cells HEK 293.  BAA (IC
50
 value of 1051 µg/ml) showed 
the weakest cytotoxic effects on normal cells HEK 293, whereas BAA/OAA (IC
50
 value 
of 269 µg/ml) shown the highest cytotoxic effect on cancerous cells.  
4.3 
Anti-thrombin activity 
Chromogenic, S-2238 (H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-p-nitroanilide dihydrochloride) is an 
artificial  substrate  of  thrombin.  The  effect  of  the  test  compounds  in  inhibiting  the 
hydrolysis  of  chromogenic  by  thrombin  was  investigated  and  the  percentage 
antithrombin activity of the compounds is presented in Figure 4.5. 
 
Figure 4.5: Antithrombin activity of the isolated compounds. Data was expressed as 
mean SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 

 
 
 
4-92 
 
 
Table 4.4: The IC
50
 values of antithrombin activity in the isolated compounds 
Compound 
BA 
BAA 
BA/OA  BAA/OAA 
IC
50
 mg/ml 
3.85 
1.25 
4.79 
3.98 
 
The compounds showed significant dose-dependent antithrombin activity. BA exhibited 
the  highest  inhibition  at  10  mg/ml.  BAA  showed  better  antithrombin  activity  than  other 
compounds, with an IC
50
 value of 1.25 mg/ml (Table 4.4). BA  with IC
50
 values of 3.85 
mg/ml    showed  higher  antithrombin activity  when  compared  with  BA/OA  (IC
50
  value of 
4.79  mg/ml).  The  BAA/OAA  mixture,  with  an  IC
50
  value  of  3.98  mg/ml  also  showing 
better antithrombin activity than the BA/OA mixture (IC
50
 value of 4.79 mg/ml).  
4.4 
The Anti-Platelet aggregation studies  
The  anti-platelet  aggregation  activity  of  the  compounds  was  tested  separately  on 
thrombin,  ADP,  collagen,  or  epinephrine  induced  rat  platelet  aggregation.  The  results 
are summarized in Figures 4.6a-d and Table 4.5. 
Table  4.5:  The  IC
50
  values  of  betulinic  acid  and  3-
β  acetylbetulinic  on  platelet 
aggregation inhibition 
Compound 
                                     IC
50 
(mg/ml) 
 
Collagen 
ADP 
Thrombin 
Epinephrine 
BA 
5.45 
11.1 
11.6 
0.78 
BAA 
1.72 
2.72 
2.92 
0.85 
BA/OA 
6.92 
2.38 
2.58 
0.68 
BAA/OAA 
3.38 
2.72 
2.85 
1.18 
Aspirin 
2.98 
2.83 
2.98 
2.9 

 
 
 
4-93 
 
 
Figure 4.6a: Platelet aggregation induced by collagen Data is expressed as mean 
± SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 
 
The  compounds  showed  significant  (p<  0.05)  dose-dependent  activity  in  collagen 
induced platelet aggregation (Figure 4.6a). The compounds also showed higher platelet 
aggregation  inhibition  at  10  mg/ml.  BAA  showed  the  IC
50
  value  (1.72  mg/ml)  in 
comparison  to  BA,  BA/OA  and  BAA/OAA  (with  IC
50
  values  of  5.45  mg/ml,  6.92  mg/ml  
and  3.38  mg/ml  respectively)  (Table  4.5).  The  compound  (BAA)  also  showed  a  better 
IC
50
  value  (1.72  mg/ml)  compared  to  Aspirin  (IC
50 
value  of  2.98).  BAA/OAA  exhibited 
twice the IC
50
 values of BA/OA. 

 
 
 
4-94 
 
 
Figure  4.6b:  Platelet  aggregation  induced  by  ADP  Data  is  expressed  as  mean  ± 
SD.*P < 0.05, **P < 0.01. 
.  
The  results  revealed  that  the  compounds  showed  significant  (p  <  0.05)  dose 
dependence  in  ADP  induced  platelet  aggregation  (Figure  4.6b).  The  compounds  also 
showed  the  highest  platelet  aggregation  inhibitory  activity  at  10  mg/ml.  BAA  showed 
significant (p< 0.01) platelet aggregation inhibitory activity when compared with BA at 10 
mg/ml  (Figure  4.7).  The  compounds  (BAA,  BA/OA  and  BAA/OAA),  with  IC
50
  values  of 
2.72  mg/ml,  2.38  mg/ml  and  2.72  mg/ml  respectively,  showed  better  antiplatelet 
aggregation activity compared to BA (with an IC
50
 value of 11.1 mg/ml). The compounds 
(BAA, BA/OA and BAA/OAA) also showed similar IC
50 
values to Aspirin (Table 4.5). 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə