A dissertation submitted in fulfilment of the requirement for the degree of doctorate of science in the department of biochemistry and microbiology, faculty of science and


Figure 4.6c: Platelet aggregation induced by thrombin Data is expressed as mean SD. *P



Yüklə 3,8 Mb.
Pdf görüntüsü
səhifə8/10
tarix27.08.2017
ölçüsü3,8 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Figure 4.6c: Platelet aggregation induced by thrombin Data is expressed as mean SD. *P 
< 0.05, **P < 0.01.  
The results showed that the compound exhibited significant (p < 0.05) dose-dependent 
platelet  aggregation  inhibitory  activity  against  thrombin  induced  platelet  aggregation 
(Figure  4.6c).    The  BA/OA  mixture  showed  the  highest  activity  at  10  mg/ml.  The 
compound  (BAA)  showed  better  antiplatelet  aggregation  activity  than  B  (Figure  4.8). 
The  compounds  (BAA,  BA/OA  and  BAA/OAA)  with  IC
50
  values  of  2.92  mg/ml,  2.58 
mg/ml  and  2.85  mg/ml  respectively  exhibited  better  platelet  aggregation  inhibitory 
activity than BA (with an IC
50
 value of 11.6 mg/ml). The compounds (BAA, BA/OA and 
BAA/OAA) have similar IC
50
 values to Aspirin (Table 4.5). 

 
 
 
4-96 
 
 
Figure  4.6d:  Platelet  aggregation  induced  by  epinephrine  Data  is  expressed  as 
mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 
The results showed that the compounds exhibited dose-dependent platelet aggregation 
inhibitory  activity  against  epinephrine  induced  platelet  aggregation  (Figure  4.6d).  The 
BA/OA  mixture  showed  the  highest  inhibitory  activity  at  10  mg/ml  whereas  Aspirin 
showed the lowest platelet aggregation activity at 1 mg/ml. The compounds (BA, BAA, 
BA/OA and BAA/OAA), with IC
50 
values of 0.78 mg/ml, 0.85 mg/ml, 0.68 mg/ml and 1.18 
mg/ml respectively, were better when compared with Aspirin (IC
50
 values of 2.98 mg/ml) 
(Table 4.5).  
 
 

 
 
 
4-97 
 
4.5 
ATP Assay 
The  release  of  ATP  from  the  platelet  granules  as  the  platelet  aggregate  was 
investigated and the results presented in Figure 4.7 
 

Figure 4.7: ATP activity of the isolated compounds Data is expressed as mean ± SD. *P < 
0.05, **P < 0.01.  
It  is  apparent  that  the  compounds  are  significantly  (p  <  0.05)  lower  in  ATP  release 
compared to the control. BAA showed the highest inhibition of ATP release at 1 mg/ml. 
BA/OA showed higher significanceant inhibitory activity than BA at 1 mg/ml. BA/OA also 
showed reverse patterns of ATP release in comparison to BAA/OAA. 
4.6 
 The Anti-acetylcholinesterase activity  
The results of the acetylcholinesterase inhibition activity of the compound are presented 
in Figure 4.8  

 
 
 
4-98 
 
 
 
 

Figure 4.8: Acetylcholinesterase inhibition activity of the compounds Data is expressed 
as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01.  
The  compounds  showed  significant  dose-dependent  acetylcholinesterase  inhibition 
activity.  BAA  showed  the  highest  acetylcholinesterase  inhibition  at  1.0  mg/ml.  BA 
showed  better  activity  than  the  BA/OA  mixtures.  The  BA/OA  and  BAA/OAA  mixtures 
showed similar acetylcholinesterase inhibition activity at 0.25 mg/ml. 
 
 

 
 
 
4-99 
 
4.7 
Phosphodiesterase inhibitory activity 
The  percentage  phosphodiesterase  inhibition  activity  of  the  compounds  presented  in 
Figure  4.9  indicates  a  significant  (p  <  0.05)  dose-dependent  activity.  BAA  showed  the 
highest  inhibitory  activity,  with  an  IC
50
  value  of  1.58  mg/ml,  when  compared  to  other 
compounds (Table 4.6).  BA and BAA, with IC
50
 values of 2.72 mg/ml and 1.58 mg/ml 
respectively,  showed  better  inhibitory  activity  than  the  positive  control,  caffeine  (IC
50
 
values  of  2.98  mg/ml).  BA,  with  an  IC
50 
value  of  2.72  mg/ml,  also  showed  better 
inhibition activity than the BA/OA mixture (3.82 mg/ml). 
 

Figure 4.9: Percentage phosphodiesterase inhibition activity of the compounds Data is 
expressed as mean ±  SD. *P < 0.05, **P < 0.01.  
 
Table  4.6:  The  IC
50
  values  of  percentage  phosphodiesterase  inhibition  of  the 
compounds 

 
 
 
4-100 
 
Compound 
BA 
BAA 
BA/OA  BAA/OAA  Caffeine 
IC
50
 mg/ml 
2.72 
1.58 
3.82 
3.20 
2.98 
 
 
4.8 
Calcium levels in cytosol 
The inhibitory effects of compounds on the release of calcium into cytosol are presented 
in Figure 4.10 
 
Figure  4.10:  The  compound  inhibition  of  Calcium  levels  in  cytosol  Data  is 
expressed as mean ±  SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.  
.  
The  compounds  showed  a  significant  dose  dependent  calcium  level  decrease  in 
cytosol.  BAA  showed  the  highest  inhibition  at  10  mg/ml,  when  compared  with  other 
isolated compounds. BAA also showed better inhibition than EDTA, the positive control. 
BA showed better inhibition than the BA/OA mixtures, at 1 and 3 mg/ml. The BAA/OAA 
mixture showed better inhibition of calcium levels in cytosol than the BA/OA mixture.  
 
 

 
 
 
4-101 
 
4.9 
Tail Bleeding time (ex vivo)   
The ex vivo 
anticoagulant activity of the test compounds was evaluated using the rat’s 
tail bleeding time assay. It is apparent that the compounds prolonged the bleeding time 
(Figure 4.11).   
 
Figure 4.11: Bleeding time for the isolated compounds Data is expressed as mean 
± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 
All  the  compounds  exhibited  significant  dose-dependent  bleeding  times.  BAA  at  250 
mg/kg  showed  the  highest  bleeding  time  in  comparison  to  other  compounds.  Aspirin 
exhibited the longest bleeding time in comparison to all the compounds. 
 
 

 
 
 
4-102 
 
4.10  Anti-inflammation activity 
The anti-inflammatory activity of isolated compounds was presented in Figure 4.12 
 
Figure 4.12: Inflammation evaluation of the isolated compounds. Data is expressed as 
mean SD. *P < 0.05, **P < 0.01.  
The isolated compounds showed significant dose-dependent anti-inflammatory activity. 
BAA  showed  better  anti-inflammatory  activity  in  comparison  to  the  positive  control 
indomethacin. BAA also exhibited the highest inhibition, at 250 mg/kg, when compared 
to other isolated compounds. BAA/OAA showed higher anti-inflammatory activity when 
compared to BA/OA at 50 mg/kg.  
 
 

 
 
 
4-103 
 
4.11  Cyclooxygenase evaluation 
The  percentage  inhibition  of  in-vitro  COX  activity  was  investigated  and  presented  in 
Figure 4.13 
 
.  
Figure 4.13: Percentage COX inhibitory activity of the isolated compounds Data is 
expressed as mean SD. *P < 0.05, **P < 0.01.  
The  compounds  showed  significant  dose-dependent  inhibition  on  both  COX-1  and 
COX-2 when compared to the negative control. The BA and BA/OA mixtures along with 
Indomethacin,  the  positive  control,  showed  better  inhibitory  activity  on  COX-1  than 
COX-2,  whereas  the  BAA  and  BAA/OAA  mixtures  showed  better  inhibitory  activity  on 
COX-2 than COX-1. BAA showed the highest COX 2 inhibition at 250 mg/kg.  
 
 

 
 
 
4-104 
 
4.12  Superoxide Dismutase activity  
The  SOD  stimulatory  activity  of  the  compounds  was  investigated  and  is  presented  in 
Figure 4.14 
 
Figure 4.14: Percentage SOD stimulatory activity of the isolated compounds Data 
is expressed as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 
.  
The  compounds  showed  significant  dose-dependent  SOD  stimulatory  activity.  BAA 
showed better SOD activity when compared to BA at 50 mg/kg. BAA/OAA also showed 
better SOD activity than BA/OA at 50 mg/kg, BAA and BAA/OAA showed similar SOD 
activity to the positive control, indomethacin, at 250 mg/kg, 
 
 

 
 
 
4-105 
 
4.13  Catalase activity  
The catalase stimulatory activity of the compound was investigated and is presented in 
Figure 4.15.    
 
Data is expressed as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 
Figure 4.15: Catalase stimulatory activity of the isolated compounds.  
The  compounds  showed  significant  dose-dependent  catalase  stimulatory  activity.  BAA 
showed  better  catalase  activity  than  BA.  BAA/OAA  mixtures  showed  better  catalase 
activity  than  BA/OA  at  250  mg/kg.  BAA  also  showed  better  catalse  activity  than  the 
indomethacin positive control at 250 mg/ml. 
 
 

 
 
 
4-106 
 
4.14  Iron chelation 
The results of iron chelation activity of the compounds are presented in Figure 4.16. 
 
Figure 4.16: Percentage iron chelation of the isolated compounds. 
Compound 
IC
50
 (µg/ml) 
BA   
1.62 
BAA 
0.88 
BA/OA 
2.16 
BAA/OAA 
0.92 
CA 
0.96 
EDTA 
1.04 
Table 4.7: The IC
50
 values of percentage iron chelation of the isolated compounds 
Data is expressed as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01. 
 
 
 

 
 
 
4-107 
 
The compounds showed significant dose-dependent iron chelation activity. BAA showed 
the highest activity with IC
50
 values of 0.88 mg/ml when compared to other compounds 
(Table 4.7). BAA and BAA/OAA, with IC
50
 values of 0.88 mg/ml and 0.92 respectively, 
also exhibited better IC50 values than the positive control CA (IC
50
 of 0.96 mg/ml) and 
EDTA (with an IC
50
 value of 1.04 mg/ml). 
4.15  The microscopic pictures of platelet aggregation treated with isolated 
compounds 

B  



 
 
 
4-108 
 

F 
 

Figure 4.17: The microscopic pictures of platelet aggregation treated with isolated 
compounds (10mg/ml) at a magnification of x1500.  
(A)  resting  platelets,  (B)  platelet  aggregation  induced  by  thrombin,  (C)  platelet 
aggregation induced by thrombin and treated with BA, (D) platelet aggregation induced 
by  thrombin  and  treated  with  BAA),  (E)  platelet  aggregation  induced  by  thrombin  and 
treated  with  BA/OA,  (F)  platelet  aggregation  induced  by  thrombin  and  treated  with 
BAA/OAA, and (G) platelet aggregation induced by thrombin and treated with Aspirin.  
The  microscopic  pictures  of  antiplatelet  aggregation  activity  of  the  compounds  are 
presented  in  Figure  4.17.  The  compounds  inhibit  the  platelet  aggregation  induced  by 
thrombin (Figure 4.17 C, D, E, F).  
 

 
 
 
5-109 
 
Chapter Five 
5. 
 Discussion  
Blood  platelets  are  important  in  the  maintenance  of  hemostatic  systems  and  in  the 
repair  of  damaged  endothelium  tissues  during  rupture.  However,  pathological  platelet 
aggregations have been implicated in  cardiovascular diseases (Dickneite et  al., 1995). 
Therefore,  targeting  platelet  aggregation  could  be  the  right  approach  to  minimizing 
cardiovascular  disease-related  mortality.  Medicinal  plants  are  currently  the  source  of 
diverse bioactive compounds vital to human health. The multi-therapeutic properties of 
plant-derived triterpenes have made them potential candidates for the  development of 
new drugs. The results obtained in this study revealed that the triterpenes isolated from 
M bracetacta and their derivatives exhibit anti-platelet aggregation activities (Table 4.5, 
Figuure 4.6 and Figure 4.17) regardless of the agonists used (thrombin, collagen, ADP 
and  epinephrine).  Some  pentacyclic  triterpenes  have  previously  been  reported  to 
display  antiplatelet  aggregation  activities  (Jin  et  al.,  2010;  Kim  et  al.,  2010;  Xuemei  et 
al., 2010; Tzakos et al., 2012; Habila et al., 2013; Ibrahim et al., 2013)

The apparent mechanism by which the triterpenes  in this study exhibited the observed 
anti-platelet  aggregation  activity  could  be  attributed  to  various  factors,  which  include, 
among  others:  anti-thrombin  activity,  the  potential  to  inhibit  the  release  of  ATP  from 
platelet  granules,  the  inhibition  of  acetylcholine  esterase  and  phosphodiesterase 
activity, chelation of Ca
2+
 ions, as well as anti-inflammatory and anti-oxidant properties. 
Thrombin  plays  an  important  role  in  abnormal  coagulation  formation  (Dickneite  et  al., 
1995). Thrombin converts fibrinogen into insoluble fibrin during the coagulation process. 
It  also  activates  coagulation  factors  V,  XIII,  and  XI,  thus  increasing  the  number  of 
activated platelets in the circulation of blood. This results in the activation of arachidonic 
pathways that release phospholipids, which in turn trigger platelet aggregation (Tortora 
and Grabowski, 2000). Apart from this, thrombin exhibits pro-inflammatory properties by 
enhancing the proliferation and migration of smooth muscle cells (Borissoff et al., 2011). 
Antithrombin  agents  induce  the  release  of  prostaglandin  I2  from  vasculoendothelial 
cells,  which  inhibits  platelet  aggregation  (Mizutani  et  al.,  2003).  Findings  from  the 

 
 
 
5-110 
 
present  study  indicate  that  the  compounds possessed antithrombin  activity  (Table  4.4, 
Figure  4.5).  The  antithrombin  activity  of  diterpenes  isolated  from  Dictyota  menstrualis 
have been reported previously (Moura et al., 2014) 
Platelets  comprise  of  cellular  granules  which  store  chemical  components  possessing 
extraordinary potential. During platelet activation, the content of the granules is released 
(Gehani, 1998). ATP is released via exocytosis from platelet dense granules along with 
other components, such as ADP and thromboxane A
2
. This amplifies the progression of 
platelet  aggregation  and  the  mobilization  of  more  active  platelets  (Jacqueline,  2005). 
There  is  thus  a  connection  between  antiplatelet  aggregation  activity  and  ATP  release 
(Ban  et  al.,  2007).  The  findings  obtained  from  this  study  show  that  the  compounds 
inhibited ATP release (Figure 4.7), possibly by preventing the degranulation of platelet-
dense  granules.  Aspirin  has  been  reported  to  inhibit  ATP  release  (Raul,  1999).  The 
increase  in  ATP  released  as  the  concentrations  of  BAA  and  BA/OA  increase  could 
indicate  that  the  compound  affects  the  loss  of  membrane  integrity  in  platelet-dense 
granules as concentration increased (Haubelt, 2008).  
Acetylcholine  is  a  neurotransmitter  which  co-ordinates  the  transmission  of  nerve 
impulses  between nerve  cells  or  neuromuscular  junctions.  Acetylcholine  enhances  the 
production  of  NO  and  prostacyclin,  which  are  potent  platelet  aggregation  inhibitors  by 
preventing  platelet  adhesion  and  aggregation  (Moncada,  1982;  Andrew  et  al.,  2001).  
Acetylcholine regulates the mobilization of clotting factors for homeostasis during tissue 
injury,  as  well  as  maintaining  vasculoendothelial  tissue  tone  (Sakrov  and  Skipetrov, 
1977).  At  the  cholinergic  synaptic  cleft,  acetylcholinesterase  (AChE)  hydrolyses 
acetylcholine to choline and acetate (López, 2010), thereby regulating the transmission 
of  impulses  across  cholinergic  synapses.  The  inhibition of  AChE has  been  considered 
to  be  a  promising  approach  for  the  treatment  of  neurodegenerative  diseases  such  as 
senile  dementia,  Alzheimer’s  diseases,  myasthenia  gravis,  ataxia  and  Park
inson
’s
 
disease  (Mukherjee  et  al.,  2007).  Platelet  dysfunction  has  also  been  implicated  in 
Alzheimer’s disease (
Larlori et al., 2005). AChE inhibitors derived from medicinal plants 
have previously been reported on (Mills, 2004; Mukherjee and Wahile 2006; Dohi et al., 
2009).  The  results  obtained  from  this  study  revealed  that  the  compounds  possessed 

 
 
 
5-111 
 
anti-acetylcholinesterase activity (Figure 4.8). Triterpenes isolated from medicinal plants 
have been reported to inhibit AChE activity (Areche et al., 2009; Calderon, 2009). BAA 
exhibited the highest acetylcholinesterase inhibition activity in this study. 
Platelet  aggregation  could  be  inhibited  either  by  antagonists  of  membrane  receptors 
coupled  with  intracellular  signaling  pathways,  or  by  inhibition  of  enzymes,  such  as 
phosphodiesterase  which  is  directly  involved  in  intracellular  signaling  pathways 
(Kalantzi  et  al.,  2012).  Phosphodiesterase  hydrolyzes  cAMP  and  cGMP  intracellular 
secondary  metabolites  which  are  important  to  platelet  functioning.  Increased 
intracellular  levels  of  these  secondary  metabolites  inhibit  platelet  activation  (Page  and 
Spina,  2011).  In  the  present  study,  the  isolated  compounds  exhibited  potent 
phosphodiesterase  inhibitory  activity  (Table  4.6;  Figure  4.9).  Triterpenes  isolated  from 
Vochysia  pacifica  were  reported  to  inhibit  phosphodiesterase  activity  (Weniger  et  al., 
2005).  Better  inhibitory  activity  of  phosphodiesterase  by  BAA  than  BA  could  be 
attributed  to  the  modification  of  hydroxyl  groups  at  the  C-3  position  with  acetyl  moiety 
(Ban,  2010).  BA  and  BAA  also  showed  better  inhibitory  activity  than  caffeine,  the 
positive  control.  Caffeine  is  a  member  of  the  methylated  xanthines,  have  previously 
been  reported  as  a  non-selective  PDE  inhibitor  (Moustafa  and  Feldman,  2014).  The 
non-  selective  PDE-inhibitor  also  acts  as  an  antagonist  of  adenosine  receptors  and 
prevents  adenosine  uptake  for  platelet  aggregation.  Adensoine  is  widely  used  during 
supraventricular tachycardia to prevent heart attacks or stroke (Konrad et al., 2013). 
The concentration of intracellular calcium in the platelet cytosol determines the status of 
platelet  activation.  This  drives  the  conformational  changes  in  platelet  structures  and 
subsequent  degranulation  that  enhances  platelet  activation  (Nesbitt  et  al.,  2002). 
Calcium  ions  activate  the  integrin 
αIIbβ3  that  binds  to  fibrinogen,  thus  stimulat
ing 
platelet aggregation (Warwick et al., 2003). Calcium ions also play an important role in 
the  activation  of  coagulation  cascade  by  enhancing  the  binding  of  coagulation  factors 
(Johan et al., 2002). The level of intracellular calcium is maintained by cAMP dependent 
calcium pumps (Yip  et al.,  2005). The protein tyrosine kinases antagonist elevates the 
cAMP  level  by  enhancing  the  adenylate  cyclase  activity  and  leads  to  the  chelation  of 
intracellular  calcium  (Johan  et  al,  2002).  The  cAMP  enhances  the  calcium  effluxes, 

 
 
 
5-112 
 
which reduces the calcium concentration that prevents platelet activation  (Johan et al., 
2002).  The  fura-2  dye  is  used  to  measure  platelet  calcium  flux  due  to  platelet 
fluorescence  capacity  (Yap  et  al.,  2000).  This  study  revealed  that  the  compounds  are 
dose-dependent  and  inhibit  calcium  concentration  in  the  platelet  cytosol  (Figure  4.10), 
possibly  through  their  potential  to  elevate  cAMP  through  the  inhibition  of 
phosphodiesterase activity. Oleanolic acid, a pentacyclic triterpene, has previously been 
reported to inhibit the calcium mobilization in extracellular matrix (Lee et al., 2007). BAA 
shows better calcium mobilization inhibition than the EDTA positive control. 
Tail  bleeding  time  is  used  to  assess  the  anticoagulation  potential  of  medication. 
Abnormal  coagulation  contributes  to  thromboembolic  disorders  such  as  stroke,  deep 
venous  thrombosis,  heart  attack  and  pulmonary  emboli  (Nalise  et  al.,  2008).  
Hypercoagulation  has  also  been  implicated  in  the  progression  of  cancer  (Rickles  and 
Falanga,  2001).  The  compounds  exhibited  a  prolonged  bleeding  time  (Figure  4.11), 
indicating  anticoagulant  properties.  Lanosteryl  triterpenes,  isolated  from  Protorhus 
longifolia stem bark, have previously been reported to prolong tail bleeding time (Mosa 
et al., 2015). The test compounds displayed lower activity when compared with Aspirin, 
the  positive  control.  This  could  be  due  to  the  poor  bioavailability  of  the  compounds. 
However,  it  has  been  documented  in  previous  studies  that  there  is  no  correlation 
between antiplatelet aggregation activity and bleeding time (Mekhfi et al., 2008; Gadi et 
al., 2009). 
Chronic inflammation is implicated in  thromboembolic disorder such stroke,  pulmonary 
embolism and myocardiac infarction. These disorders have been reported to cause over 
20% of world mortality (Cohen et al., 2011). The relationship between inflammation and 
hemostatic  systems  in  both  physiological  and  pathological  conditions  has  been 
established  (Hirsh  et  al.,  2007;  Verhamme  and  Hoylaerts,  2009).  In  this  study,  cotton 
pellet-induced  granuloma  was  used  for  a  chronic  inflammation  investigation.  The 
compounds  showed  significanceant  anti-inflammatory  properties  compared  to  the 
control (Figure 4.12). The anti-inflammatory potential of some triterpenes has previously 
been  reported  on  (Yadav  et  al.,  2010;  Mosa  et  al.,  2011,  2015).  BAA  again  exhibited 
better anti-inflammatory properties than BA, which again is attributed to the modification 

 
 
 
5-113 
 
of  C-3  hydroxyl  group  with  acetyl.    BAA  also  has  higher  anti-inflammatory  properties 
compared to indomethacin, a widely used non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID). 
These findings validated the report of Mosa et al., (2015) that triterpenes isolated from 
protorhus  longifolia  stem  bark  possessed  higher  anti-inflammatory  potential  than 
indomethacin.  BA/OA  has  higher  anti-inflammatory  properties  compared  to  BA  at  50 
mg/kg.  This  could  be  attributed  to  the  synergistic  action  of  the  compound  mixture. 
BAA/OAA  also  showed  better  activity  compared  to  BA/OA.  This  could  be  attributed  to 
the modification of the C- 3 hydroxyl group position within the acetyl group. 
The cyclooxygenase (COX) enzymes play major roles in the formation of thromboxanes 
and  prostaglandins.  They  have  been  implicated  in  virtually  all  physiological  and 
pathological activities (Fitzpatrick, 2004). The inhibition of COX enzymes has effectively 
been used in the treatment and management of inflammation related ailments such as 
cardiovascular  diseases,  cancer,  diabetes,  neurodegenerative  diseases,  pulmonary 
diseases  and  autoimmune  diseases  (Shacter  and  Weitzman,  2002).  There  are  two 
types of COX enzymes (COX-1 and COX-2).  COX-1 is a constitutive enzyme which is 
important  for  cellular  housekeeping,  whereas  COX-2  is  an  inductive  enzyme,  induced 
during inflammation. Non

selective NSAIDs, such as Aspirin, inhibit both iso-enzymes. 
This could also attribute to their frequent side effects. The use of  Aspirin in treatments 
has  also  been  implicated  in  gastrointestinal  bleeding.  This  prompts  the  search  for 
selective  COX-2  inhibitors  in  others,  to  spare  the  COX-1  housekeeping  effects 
(Rainsford,  2007).  The  present  study  has  shown  that,  with  the  inhibition  of  COX 
enzymes, all the compounds exhibited anti-inflammatory properties (Figure 4.13) Some 
pentacyclic  triterpenes,  isolated  from  protium  kieinii,  have  previously  been  reported  to 
inhibit  COX enzymes (Otuki et al.,  2005). Betulinic acid, isolated from  Scoparia dulcis
has  been  demonstrated  to  possess  anti-inflammatory  properties  in  attenuating  COX 
enzymes (Tsai, 2011). Indomethacin is a commonly used NSAID that has been reported 
to selectively inhibit COX-1 enzymes (Stichtenoth et al., 1997). BAA possessed higher 
inhibitory  activity  compared  with  other  compounds  and  indomethacin.  The  inhibitory 
activity of BAA and BAA/OAA mixtures on COX-2 was better than COX-1. 
Superoxide  dismutase  is  an  endogenous  antioxidant  that  hydrolyzes  superoxide 

 
 
 
5-114 
 
radicals into hydrogen peroxide and oxygen, which are lesser toxins. The present study 
showed  that  the  compounds  exhibited  potent  SOD  stimulatory  activity  (Figure  4.14) 
Triterpenes  isolated  from  Ganoderma  lucidum  have  been  reported  to  possess  potent 
SOD  stimulatory  activity  (Smina  et  al.,  2011).  The  potent  SOD  stimulatory  activity  of 
Lanosteryl triterpene, isolated from Protorhus longifolia stem bark, has previously been 
reported  on  (Mosa  et  al.,  2015).  BAA  at  250  mg/kg  also  possessed  a  similar  SOD 
stimulatory activity with indomethacin, a commonly used NSAID drug. Indomethacin has 
been reported to possess a strong SOD stimulatory activity (Dillon et al., 2003). 
Inflammation enhances the formation of excess reactive oxygen species (ROS), which 
could  lead  to  oxidative  stress.  This  triggers  the  release  of  inflammation mediates from 
the  macrophages,  which  further  intensifies  the  inflammation  process  (Porfire  et  al., 
2009). The relationship between oxidative stress and abnormal platelet aggregation has 
previously  been  reported  on  (Violi  and  Pignatelli,  2012).  High  concentrations  of 
hydrogen peroxide have been demonstrated to stimulate platelet aggregation (Lopez et 
al., 2007). Catalase is an antioxidant found in all living cells that catalyzes the hydrolysis 
of hydrogen peroxide into water and oxygen (Chelikani et al., 2004).  Antioxidant drugs 
have been found to be effective in the treatment of inflammation and abnormal platelet 
aggregation diseases such as stroke, heart attack and pulmonary embolism (Freedman, 
2008).  The  present  study  showed  that  all  the  compounds  possessed  potent  catalase 
activity  (Figure  4.15).  Triterpene  isolated  from  protorhus  longifolia  stem  bark  have 
previous  been  reported  to  posses  high  catalase  stimulatory  activity  (Mosa,  2015). The 
compound (BAA) showed higher catalase stimulatory activity at 250 mg/kg compared to 
other  compounds.  This  could  be  attributed  to  the  modification  of  the  C-3  position  of 
hydroxyl within the acetyl group. 
Abnormal  iron  homeostasis  has  been  implicated  in  the  onset  of  cardiovascular 
diseases, asthma and cancer (Lee et al., 2004). Iron overload leads to fenton reactions 
which encourage the production of free radicals such as hydrogen peroxide (H
2
O
2
). The 
H
2
O

reacts with more Fe
2+
 to produce hydroxyl radicals that result in lipid peroxidation 
in  the  membrane  (Thirupathi  et  al.,  2011).  This  process  could  also  trigger  abnormal 
platelet  activation  and  inflammation.  The  present  results  indicated  that  the  isolated 

 
 
 
5-115 
 
compounds  could  prevent  ROS  formation  through  iron  chelation  (Table  4.7;  Figure 
4.16).  The  highest  iron  chelation  activity  of  BAA  and  BAA/OAA,  when  compared  with 
the  other  isolated  compounds  and  the  positive  control,  could  be  as  a  result  of  the 
modification of the C-3 position of the hydroxyl group within the acetyl moiety. 
In the search for alternative potent antiplatelet drugs, clinically safe drugs are desirable. 
Potent antiplatelet drugs are expected to display weak cytotoxic effects on normal cells. 
The  American  National  Cancer  Institute  guidelines  consider  a  compound  with  IC
50 
values of < 30 µg/ml as cytotoxic (Suffness and Pezzuto, 1990). The findings from this 
present  study  revealed  (Table  4.3)  weak  cytotoxic  effects  of  the  compounds  on  both 
normal cells (HEK293) and cancerous cells (HEPG2).  However, some triterpenes have 
been reported to have strong cytotoxic effects (Lee et al., 2007; Peteros and Uy, 2010). 
Despite  the  weak  cytotoxic  effects  displayed  by  the  compounds,  the  higher  cytotoxic 
effects  on  HEPG2,  compared  to  HEK293,  implies  that  the  compounds  could  inhibit 
cancer  cell  proliferation.  Betulinic  acid  has  been  demonstrated  to  selectively  inhibit 
tumour  cells  (Pisha  et  al.,  1995).  BA  and  its  derivatives,  isolated  from  Melaleuca 
cajuput, have also been reported to selectively inhibit myeloid leukemia (HL-60) cell line 
(Faujan, 2010).   
BAA  and  the  other  acetyl  derivatives  exhibited  the  highest  anti-platelet  aggregation 
activity compared to other compounds. The acetyl derivatives were also the most active 
in  all  the  parameters  measured.  This  could  be  attributed  to  the  modification  of  C-3 
hydroxyl  with  acetyl  moiety  (Ban  et  al.,  2010).  The  chemical  modification  of  drugs  is 
known to increase the effectiveness of drugs (Simelane et al., 2013). Targeting carbon 
positions  3  and  28  has  been  reported  as  the  new  pharmacophores  for  increasing 
biological activity (Ban et al., 2010). It is worth noting that Aspirin, a potent antithrombin 
agent, has acetyl moiety as its major functional group (Undas et al., 2007). The BA/OA 
and the BAA/OAA mixtures exhibited a lower antithrombin activity when compared with 
BA, which is possibly indicative of the synergistic effects of the compounds. 
 
 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə