Antioxidant, Anti-inflammatory and Cytotoxicity of 1 Phaleria macrocarpa



Yüklə 197,39 Kb.
Pdf görüntüsü
səhifə1/2
tarix11.08.2017
ölçüsü197,39 Kb.
  1   2

 

- 1 - 


Antioxidant, Anti-inflammatory and Cytotoxicity of 



Phaleria macrocarpa 



(Boerl.) Scheff Fruit 

 



Rudi Hendra 

1,2*

, Syahida Ahmad



1*§

, Ehsan Oskoueian

3*

,Aspollah Sukari



4*

, M. Yunus 

Shukor 


1*

 



1

 Department of Biochemistry, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, 

Universiti Putra Malaysia (UPM), 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia.  



2

 Department of Chemistry, Faculty of Mathematic and Natural Sciences, University 



of Riau, Pekanbaru, Riau, Indonesia  

3

 Department of Microbiology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, 



10 

Universiti Putra Malaysia (UPM), 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia.  

11 

4

 Department of Chemistry, Faculty of Sciences, Universiti Putra Malaysia (UPM), 



12 

43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia.  

13 

 

14 



*These authors contributed equally to this work 

15 


§

Corresponding author 

16 

 

17 



Email addresses: 

18 


RH: r.hendra@unri.ac.id  

19 


SA: syahida@biotech.upm.edu.my  

20 


EO: ehs424@yahoo.com 

21 


AS: aspollah@science.upm.edu.my 

22 


YS: yunus@biotech.upm.edu.my 

23 


24 

 

- 2 - 


Abstract  

24 


Background 

25 


Phaleria  macrocarpa 

(Scheff.)  Boerl  (Thymelaceae) 

originates

  from  Papua  Island, 

26 

Indonesia  and 



it

  grows  in  tropical  areas.  The  different  parts  of  the  fruit  of  P. 

27 

macrocarpa

  were  evaluated  for  antioxidant,  anti-inflammatory,  and  cytotoxic 

28 

activities.  



29 

Methods 

30 


Phaleria macrocarpa

 fruit were divided into pericarp, mesocarp and seed. All parts of 

31 

the 


fruit were 

reflux 


extracted with methanol

 by using reflux

. The antioxidant activity 

32 


of  the  extracts  were  characterized  in  various  in  vitro  model  systems  such  as  FTC, 

33 


TBA, DPPH radical, reducing power and NO radical. 

The


 

Aa

nti-inflammatory 



assays 

34 


were done by using NO production by macrophage RAW 264.7 cell lines induced by 

35 


LPS/IFN-γ and cytotoxic activities were determined by using several cancer cell lines 

36 


and one normal cell line 

37 


Results 

38 


The  results  showed  that  different  parts  (pericarp,  mesocarp,  and  seed)

  of 


Phaleria 

39 


macrocarpa 

fruit 

  contain

ed

  various  amount  of  total  phenolic  (59.2±0.04,  60.5±0.17, 



40 

47.7±1.04  mg  gallic  acid  equivalent/g  DW)  and  flavonoid  compounds  (161.3±1.58, 

41 

131.7±1.66,  35.9±2.47  mg  rutin  equivalent/g  DW).  Pericarp  and  mesocarp  showed 



42 

high  antioxidant  activities  by  using  DPPH  (71.97%,  62.41%),  ferric  reducing 

43 

antioxidant power (92.35%, 78.78%) and NO scavenging activity (65.68%, 53.45%). 



44 

Ferric  thiocyanate  and  thiobarbituric  acid  tests  showed  appreciable  antioxidant 

45 

activity  in  the  percentage  hydroperoxides  inhibitory  activity  from  pericarp  and 



46 

mesocarp in the last day of the assay. Similarly, the pericarp and mesocarp inhibited 

47 

inducible  nitric  oxide  synthesi



sze

  with  value

s

  of  63.4±1.4%  and  69.5±1.4%    in 



48 

macrophage  RAW  264.7  cell  lines  induced  by  LPS/IFN-γ  indicating  their  notable 

49 

anti-inflammatory  potential.  Cytotoxic  activities  against  HT-29,  MCF-7,  HeLa  and 



50 

Chang cell line

s

 were observed in all parts. 



51 

Conclusions 

52 


These results indicated the possible application of P. macrocarpa fruit as a source of 

53 


bioactive  compounds,  potent  as  an  antioxidant,  anti  inflammatory  and  cytotoxic 

54 


agents. 

55 


 

56 


Keywords 

57 


 

58 


Phaleria macrocarpa

, antioxidant, anti-inflammatory, cytotoxic activity



 

59 


Background  

60 


Text  for  this  section.  Ethnopharmacological  information  revealed  the  utilization  of 

61 


Phaleria  macrocarpa 

(Scheff.)  for  many  purposes  by  humans.  The  main  purpose  of 

62 

plants was as a source of food and food additive however the plant is also used as a 



63 

 

- 3 - 


natural  source  of  medicinal  agents  [1].  In 

the 


recent  years, 

research  on  medicinal 

64 

plants  haveresearch  on  medicinal  plants  has



s

  drawn  enormous 

global 

attention



65 


globally

. Large bod

iesy

 of evidence ha



ves

 accumulated to demonstrate the promising 

66 

potential of medicinal plants used in various traditional, complementary and alternate 



67 

systems  of  treatment  of  human  diseases.  The  plants  are  rich  in  a  wide  variety  of 

68 

secondary  metabolites  such  as  tannins,  terpenoids,  alkaloids,  flavonoids,  etc.,  which 



69 

have  been  screened  in  vitro  and  indicated  antioxidant,  anti-inflammatory  and 

70 

antimicrobial properties are used to developed drugs or dietary supplements[2].  



71 

In Indonesia, most of the research activities in natural products are still limited to the 

72 

inventory of folkloric information and utilization of various plants and trees, meaning 



73 

that  obtaining  scientific  proof  for  their  biological  activities  are  still  challenging  and 

74 

need


s

 more investigation[3].  

75 

Phaleria macrocarpa

 (Scheff.) Boerl (Thymelaceae) is commonly known as crown of 

76 

god,  mahkota  dewa,  and  pau.  It 



is

  originated  from  Papua  Island,  Indonesia  and  it 

77 

grows  in  tropical  area



s

.  This  plant  is  one  the  of  most  popular  medicinal  plant

s

  in 


78 

Indonesia. Phaleria macrocarpa grows throughout the year in tropical area

s

 reaching 



79 

a height of around 1-6 m. It is a complete tree (stem, leaves, flower and fruit) and the 

80 

fruit shape is eclipse with a diameter of around 3 cm. The colour of the fruit is green 



81 

before  ripening  and  red  when  fully  ripe[4].  Traditionally,  P.  macrocarpa  (Scheff) 

82 

Boerl has been used to control 



the

 cancer, impotency, hemorrhoids, diabetes mellitus, 

83 

allergies,  liver  and  hearth  disease,  kidney  disorders,  blood  diseases,  acne,  stroke, 



84 

migraine, and various skin diseases[5].  

85 

Based  on  the  ethopharmacological  aspects  the  boiled  water  extract  of  the  Phaleria 



86 

macrocarpa 

fruit used to treat or alleviate the above diseases symptoms. Despite the 

87 

extensive use by Indonesian people, there have been only limited attempts to explore 



88 

 

- 4 - 


the  biological  properties  of  this  plant  in  relation  to  their  medicinal  uses.  In  our 

89 


investigation  into  biological  activities  of  Indonesian  plants,  we  report  here  the  total 

90 


phenolic  and  flavonoid  compounds,  antioxidant,  anti-inflammatory,  cytotoxicity 

91 


activities of the extracts from different parts of P. macrocarpa fruit. 

92 


 

93 


Methods 

94 


 

95 


Plant Materials 

96 


The  fruits  of  Phaleria  macorcarpa  (Boerl.)  Schiff.  were  obtained  from  Faculty  of 

97 


Mathematic  and  Natural  Sciences,  University  of  Riau,  Riau  province,  Indonesia

 

(  



98 

0°28'42.14"N, 101°22'38.37"E) . The plant species was identified by the laboratory of 

99 

Plant  Taxonomy  staff  at  Herbarium  Bogoriense,  Bogor,  Indonesia.  The  voucher 



100 

specimen (SA1611/2008) was deposited at Herbarium Bogoriense, Bogor, Indonesia. 

101 

The fruit were washed and separated 



between

 into pericarp, mesocarp and seed. Those 

102 

parts were air-dried for 7 days and kept for further analyses. 



103 

Extract Preparation 

104 


The extractions from various parts of P. macrocarpa fruit were carried out based on 

105 


Crozier et al.,[6] with some modification. Briefly, air-dried powders of each parts of 

106 


P. macrocarpa

 fruit (0.5 g) were weighed and placed into a 100 ml conical flask. 40 

107 

ml  of  methanol  was  added,  followed  by  10  ml  and  6  M  HCL  solution.  The  mixture 



108 

was stirred 

with a by using

 magnetic stirrer. The mixture was 

then 

placed in a sample 



109 

flask  (250  ml),  attached  to  reflux  and  heated  for  2  hours  at  90º  C,  then 

the  mixture 

110 


were 

filtered 

with  a  using

  Whatman  No.1  filter  paper  (Whatman,  England)

.,

 

and 



111 

Ff

iltrates  were 



dried  taken  to  dryness

  by  using 

vacuumed  Rotary  Evaporator 



112 

(Buchii, Switzerland) at 40 ºC. 

113 


 

- 5 - 


 

114 


Total Phenolics Assay  

115 


Total phenolic compounds w

ereas


 determined according to Ismail et al.[7]. 0.5 ml of 

116 


each extract, 2.5 ml Folin-Ciocalteu reagent, 2 ml of 7.5% (w/v) Na

2

CO



were mixed. 

117 

The  mixture  was  vortex  and  incubated  at  room  temperature  for  90  min. 



Tt

he 


118 

absorbance

s

 were read using 



visible spectrophotometer (Novaspec II Visiblespectro) 

119 

at  765  nm.  The  results  were  expressed  as  mg  gallic  acid  equivalents/g  dry  weight 



120 

(DW).  


121 

Total Flavonoid Assay  

122 


The total flavonoid compounds in each extract was determined according to Ismail et 

123 


al  [7].  An  aliquot  (0.1  ml)  of  extract  was  added  to  0.3  ml  5%  (w/v)  NaNO

2

  and 



124 

incubated for 5 min. 0.3 ml 10% (w/v) AlCl

3

 and 2 ml 1 N NaOH was added and the 



125 

total volume was made up to 5 ml with distilled water. The absorbance was measured 

126 

at 510 nm by using visible spectrophotometer (Novaspec II Visiblespectro) at 510 nm. 



127 

The results were expressed as mg rutin equivalents/g DW.  

128 

Antioxidant Activity of P. macrocarpa Extracts 

129 


Total Antioxidant Activity Assay 

130 


Ferric Thiocyanate (FTC)  

131 


This  assay  was  carried  out  as  described  in  the  modified  method  of 

Gülçin  Kikuzaki 

132 

and Nakatani [8] [9]



. A mixture of 1.2 mg of a sample in 4 ml of 99.5% ethanol (300 

133 


µg/ml),  4.1  ml  of  2.5%  linoleic  acid  in  99.5%  ethanol,  8.0  ml  of  0.02  M  phosphate 

134 


buffer  (pH  7.0)  and  3.9  ml  of  water  contained  in  a  screw-cap  vial  was  placed  in  an 

135 


oven at 40 

o

C in the dark. To 0.1 ml of this mixture, 9.7 ml of 75% (v/v) ethanol and 



136 

0.1 ml of 30% ammonium thiocyanate was added. Three minutes after the addition of 

137 

0.1  ml  of  2.0  x  10



2

  M  ferrous  chloride  in  3.5%  hydrochloric  acid  to  the  reaction 

138 

mixture,  the  absorbance  was  measured  at  500  nm  (Molecular  Devices  Inc.,  USA)  at 



139 

 

- 6 - 


every  24  hour  interval  until  1  day  after  absorbance  of  the  control  reached  its 

140 


maximum value. 

141 


 

142 


Thiobarbituric Acid (TBA)  

143 


This test was conducted according to the method of 

Gülçin [9]Kikuzaki and Nakatani 

144 

[8]


. The same samples prepared for FTC method were used. To 2.0 ml of the sample 

145 


solution,  was  added  1.0  ml  of  20%  aq.  trichloroacetic  acid  and  2.0  ml  of  aq. 

146 


thiobarbituric  acid  solution.  The  final  sample  concentration  was  0.02%  w/v.  The 

147 


mixture  was  placed  in  a  boiling  water  bath  for  10  minutes.  After  cooling,  it  was 

148 


centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. Absorbance of the supernatant was measured 

149 


at  532  nm  (Molecular  Devices  Inc.,  USA).  Antioxidant  activity  was  recorded  based 

150 


on absorbance on the final day. In both methods, antioxidant activity is described by 

151 


percent  inhibition:  [(A

0

  -  A



1

)/  A


0

]  x  100%  ;  where  A

0

  was  the  absorbance  of  the 



152 

control reaction and A

1

 was the absorbance in the presence of the sample. 



153 

DPPH Radical Scavenging Activity 

154 


The free radical scavenging  activity of the plant  materials was determined using the 

155 


DPPH assay as described by 

GülçinGulcin et al. [10][9]

. Bri

e

fly, One ml methanolic 



156 

extract  of  each  of  plant  at  different  concentration  were  mixed  with  3  ml  0.1  mM 

157 

solution  of 



2,2‐diphenyl‐1‐picrylhydrazil  1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil 

(DPPH)  in 

158 

methanol. After incubation at room temperature for 30 min in the dark condition, the 



159 

absorbance  of  the  mixture  was  read  using  a  visible  spectrophotometer  (Novaspec  II 

160 

Visblespectro) at 517 nm. Ascorbic acid and α-tocopherol were used as a antioxidant 



161 

 

- 7 - 


standard.  Free radical scavenging activity from the sample was calculated according 

162 


to the formula: 

163 


 [(A

0

 - A



1

)/ A


0

] x 100% ; where A

0

 was the absorbance of the control reaction and A



1

 

164 



was the absorbance in the presence of the sample. 

165 


Ferric-Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assay 

166 


The ferric reducing property of the extracts was determined by using assay described 

167 


by  Yen  and  Chen 

[11][10]


.  One  ml  (concentration  of  100,  150,  200,  250,  and  300 

168 


µg/ml) of sample extracts were mixed with 2.5 ml of potassium phosphate buffer (0.2 

169 


M,  pH  6.6)  and  2.5  ml  of  potassium  ferricyanide  (1  g/100  ml).  The  mixture  was 

170 


incubated at 50 ºC for 20 min. Trichloroacetic acid (10%) was added to the mixture to 

171 


stop  the  reaction.  Equal  volume  of  distilled  water  was  added  followed  by  0.5  ml 

172 


ferum chlorate (0.1g/100 ml) (FeCl

3

). The procedure was carried out in triplicate and 



173 

allowed to stand for 30 min before measuring the absorbance at 700 nm. The above 

174 

procedures  were  repeated  with  BHT,  ascorbic  acid  and  α-tocopherol  as  positive 



175 

control.  The  percentage  of  antioxidant  activity  in  FRAP  assay  of  the  samples  was 

176 

calculated according to the formula:  



177 

Antioxidant Activity (%)   =          (A

1-

A

0



)   

178 


        

 

 



 

 

A



179 


 A

 0 


= Absorbance of the control (potassium phosphate buffer + FRAP reagent) 

180 


 A

1

 = Absorbance of sample 



181 

NO-Scavenging Activity 

182 


The  NO-scavenging  activity  of  each  plant  extract  was  determined  by  the  method  of 

183 


Tsai et al.,

[12][11]


. Sixty microliters of two-fold dilution sample were mixed with 60 

184 


µl  of  10mM  sodium  nitroprusside  in  phosphate  buffered  saline  (PBS)  into  a  96-wll 

185 


flat-bottomed  plate  and  incubated  under  light  at  room  temperature  for  150  min. 

186 


Finally,  an  equal  volume  of  Griess  reagent  was  added  into  each  well  in  order  to 

187 


X 100% 

 

- 8 - 


measure  the  nitrite  content.  Ascorbic  acid  and  α-tocopherol  were  used  as  a  control. 

188 


The NO-scavenging activity was calculated according to the formula: [(A

0

 - A



1

)/ A


0

189 



x  100%  ;  where  A

0

  was  the  absorbance  of  the  control  reaction  and  A



1

  was  the 

190 

absorbance in the presence of the sample. 



191 

Anti-inflammatory activity

 

192 


The  murine  monocytic  macrophage  RAW  264.7  cell  line  (European  Cell  Culture 

193 


Collection, CAMR, UK) was cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM) 

194 


(2mM  L-glutamine,  45  g/L  glucose,  1  mM  sodium  pyruvate)  with  10%  fetal  bovine 

195 


serum  (FBS).  The  cells  were  cultured  at  37

o

C  with  5%  CO



2

  and  were  subcultured 

196 

twice a week. The cells were seeded in 96-well tissue culture plates (1x10



6

 cells/ml) 

197 

and incubated for 24 h at 37



o

C with 5% CO

2

. Then, 100 µl of test extract in DMSO 



198 

was then added and serially diluted to give a final concentration of 200 µg/ml in 0.1 

199 

%  DMSO.  Cells  were  then  stimulated  with  200  U/ml  of  recombinant  mouse 



200 

interferon-gamma  (IFN-γ)  and  10  µg/ml  Escherichia  coli  lipopolysaccharide  (LPS) 

201 

and incubated at 37



o

C for another 17 h. The presence of nitrite was determined in cell 

202 

culture  medium  by  Griess  reagent  and  cell  viability  was  detected  by  using  MTT 



203 

cytotoxicity  assay  as  described  by  Ahmad  et  al. 

[13][12]

.  N-nitro-l-arginine-methyl 

204 

ester (L-NAME) was used as iNOS inhibitor (control) at a concentration of 250 µM. 



205 

Cytotoxic Activity 

206 


HT-29  (Human  colon  adenocarcinoma  cell  line),  MCF7  (Human  breast 

207 


adenocarcinoma  cell  line),  HeLa  (Human  cervical  cancer  cell  line),  Human 

208 


hepatocytes  (Chang  liver  cells)  and  obtained  from  the  American  Type  Culture 

209 


Collection (ATCC) were used in this study. 

210 


Cytotoxicity 

was 


determined 

using 


the 

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

211 

diphenyltetrazolium  bromide  (MTT,  Sigma)  assay  reported  by  Mosmann 



[14][13]

212 



 

- 9 - 


The plant extracts were prepared from the stock solutions by serial dilution in DMEM 

213 


to give a volume of 100 µl in each well of a microtiter plate (96-well). Each well was 

214 


filled  with  100  µl  of  cells  at  2  x10

5

  cells/ml.  The  assay  for  each  concentration  of 



215 

extract was performed in triplicates and the culture plates were kept at 37 

o

C with 5% 



216 

(v/v) CO


for 3 days. After 72 h of incubation, 100 µl of medium was removed from 

217 

each  well.  Subsequently,  20  µl  of  0.5%  w/v  MTT  (Sigma,  USA),  dissolved  in 



218 

phosphate  buffered  saline,  was  added  to  each  well  and  allowed  to  incubate  for  a 

219 

further  4  h.  After  4  h  of  incubation,  100  µl  of  DMSO  was  added  to  each  well  to 



220 

dissolve  the  formazan  crystals.  Absorbance  values  at  550  nm  were  measured  with  a 

221 

microplate reader (Molecular Devices Inc., USA). 



222 

Statistical analysis 

223 


GraphPad  Prism  5  software  (GraphPad  Software  Inc.,  San  Diego,  CA)  was  used  for 

224 


all  the  statistical  analyses  in  this  study.  One-way  ANOVA  followed  by  Dunnet  test 

225 


were used to compared between extracts with positive control and IC

50

 was analyzed 



226 

by using non-linier regression. 

227 



Yüklə 197,39 Kb.

Dostları ilə paylaş:
  1   2




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə