En sistemas bacterianos



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EXPRESIÓN DE UNA -EXPANSINA DE GUAYABA (Psidium guajava L.)

EN SISTEMAS BACTERIANOS

Garcidueñas-Piña, Cristina*; Gutiérrez-Campos, Rafael*; Alpuche-Solís, Ángel **;

Morales-Domínguez, José Francisco*

* Universidad Autónoma de Aguascalientes, Centro de Ciencias Básicas, Departamento de Química.

** Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT).




INTRODUCCIÓN

Las expansinas son proteínas que se encuentran en la pared celular vegetal y actúan sobre sus componentes, rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unidas a las cadenas de polisacáridos, principalmente celulosa y hemicelulosa, sin hidrolizarlas. Esta acción está involucrada con el crecimiento celular y la maduración del fruto. Son las únicas proteínas que producen una relajación de la estructura de la pared celular vegetal y permiten la incorporación de subunidades a los polímeros, dándose una extensión1. Se han identificado y aislados expansinas de diferentes plantas y su expresión es dependiente de tejido y órgano especifico así como, de la etapa de desarrollo y estímulos hormonales o de luz. Se han clasificado en dos familias, las y las -expansinas, ambas tienen un peso molecular entre 25 y 28 kDa y presentan un 25% de homología. Se ha sugerido que ambos grupos de proteínas trabajan de manera similar, pero en diferentes polímeros de la pared celular2.

Las -expansinas pueden tener aplicaciones biotecnológicas en la elaboración de productos de origen celulósico, como papel; y en la eliminación de desechos vegetales. Para esto, es necesaria su purificación. Sin embargo, la obtención de esta proteína a partir de tejido vegetal es complicada, costosa y de muy bajo rendimiento3. Por lo que en el presente trabajo se muestra el desarrollo de un sistema bacteriano capaz de producir una -expansina de guayaba, que pudiera ser una alternativa más eficiente para la obtención de la proteína.

MATERIALES Y MÉTODOS

El gen de una -expansinas de guayaba se insertó en el vector pUC18, para generar sitios y facilitar la clonación en la orientación correcta, en los vectores de sobreexpresión pBAD/His A, B y C de Invitrogen. Estas construcciones fueron introducidas a la cepa TOP 10 de la bacteria Escherichia coli, donde la expresión del gen fue inducida con arabinosa. La proteína recombinante

expresada en estas condiciones, tiene unida dos secuencias propias del vector: la primera es una cadena de seis histidinas, necesaria para la purificación; y una región de aminoácidos que reconoce el anticuerpo comercial anti-Xpress de Invitrogen. Para descubrir el vector y las condiciones apropiadas en que se produce la proteína, se probaron diferentes concentraciones de arabinosa, desde 0.00002 hasta 8%. Se recuperaron proteínas nativas y desnaturalizadas a los 30 min, 2 h, 4 h, 6 h y 20 h, después de la inducción con arabinosa. Las proteínas se observaron en geles de poliacrilamida teñidos con solución de Coomassie y por Western blot. La purificación de la proteína recombinante fue mediante cromatografía de afinidad, usando columnas comerciales de la marca Qiagen, que contienen una resina con níquel muy afín a la secuencia de histidinas.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Se analizaron los tres vectores de sobreexpresión pBAD/His A, B y C con la expansina. Mediante western blot, se observó la expresión de la -expansina en el vector pBAD/His C. La purificación de la -expansina no fue posible a partir de proteínas nativas, pero sí de proteínas desnaturalizadas. Es de esperarse que la proteína recuperada en estas condiciones, no tenga actividad, pero puede ser empleada para la generación de anticuerpos utilizables en estudios de expresión. Por otro lado, se están realizando pruebas con el extracto de proteínas nativas que contienen la -expansina, sobre tejido vegetal para analizar la actividad biológica.



  1. -Cosgrove, D. J. (1999). Enzymes and the other agents that enhance cell wall extensibility. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50:391-417.

  2. Cosgrove, D.J. (2000). Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407:321-326.

  3. Rochange, S. F. y McQuenn-Mason S. J. (2000). Expression of a heterologous expansin in transgenic tomato plant. Planta. 211: 583-586.



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