Experimental Lachesis muta rhombeata envenomation and effects of soursop



Yüklə 2,43 Mb.
Pdf görüntüsü
tarix10.07.2017
ölçüsü2,43 Mb.

R E S E A R C H

Open Access

Experimental Lachesis muta rhombeata

envenomation and effects of soursop

(Annona muricata) as natural antivenom

Caroline Marroni Cremonez

1

, Flávia Pine Leite



1

, Karla de Castro Figueiredo Bordon

1

, Felipe Augusto Cerni



1

,

Iara Aimê Cardoso



1

, Zita Maria de Oliveira Gregório

2

, Rodrigo Cançado Gonçalves de Souza



3

,

Ana Maria de Souza



2

and Eliane Candiani Arantes

1*

Abstract


Background: In the Atlantic forest of the North and Northeast regions of Brazil, local population often uses the fruit

juice and the aqueous extract of leaves of soursop (Annona muricata L.) to treat Lachesis muta rhombeata

envenomation. Envenomation is a relevant health issue in these areas, especially due to its severity and because the

production and distribution of antivenom is limited in these regions. The aim of the present study was to evaluate

the relevance of the use of soursop leaf extract and its juice against envenomation by Lachesis muta rhombeata.

Methods: We evaluated the biochemical, hematological and hemostatic parameters, the blood pressure, the

inflammation process and the lethality induced by Lachesis muta rhombeata snake venom. We also assessed the

action of the aqueous extract of leaves (AmL) and juice (AmJ) from A. muricata on the animal organism injected

with L. m. rhombeata venom (LmrV) in the laboratory environment.

Results: LmrV induced a decrease of total protein, albumin and glucose; and increase of creatine kinase, aspartate

aminotransferase, and urea concentrations. It provoked hemoconcentration followed by reduction of hematocrit, an

increase in prothrombin time and partial thromboplastin time and a decrease of the blood pressure. LmrV induced

the release of interleukin-6, an increase in neutrophils and changes in the serum protein profile, characteristic of the

acute inflammatory process. LD

50

values were similar for the groups injected with LmrV and treated or untreated



with AmJ and AmL. Both treatments play a role on the maintenance of blood glucose, urea and coagulation

parameters and exert a protective action against the myotoxicity. However, they seem to worsen the hypotension

caused by LmrV.

Conclusion: The treatments with AmJ and AmL present some beneficial actions, but they might intensify some

effects of the venom. Therefore, additional studies on A. muricata are necessary to enable its use as natural

antivenom for bushmaster snakebite.

Keywords: Lachesis muta rhombeata, Bushmaster, Natural antivenom, Antiophidic action, Soursop, Annona muricata L.

* Correspondence:

ecabraga@fcfrp.usp.br

1

Department of Physics and Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences of



Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP, Brazil

Full list of author information is available at the end of the article

© 2016 Cremonez et al. Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0

International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and

reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to

the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The Creative Commons Public Domain Dedication waiver

(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins

including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

DOI 10.1186/s40409-016-0067-6


Background

The species

L. muta is divided into two subspecies: L.

muta muta found in tropical forests of Colombia,

Venezuela, Guyana, Suriname, Peru, Ecuador and Brazil,

and


L. muta rhombeata confined to certain areas of the

rainforest of the Brazilian Atlantic region [1, 2].

Lachesis

muta rhombeata was considered “endangered of extinc-

tion

” in 1989 by the official list of the Brazilian Institute of



Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA),

and currently is considered

“vulnerable” by the Inter-

national Union for the Conservation of Nature [3].

The envenomation caused by

Lachesis genus repre-

sents 4.5 % of all registered snakebites in Brazil and is

characterized by the so-called

“Lachesis Syndrome” [4].

Within the first few minutes after the bite, the victim is

affected by agonizing burning throbbing local pain and

edema, followed by intense inflammation, bleeding dis-

orders, clotting disorders, kidney malfunction, myotoxicity

and autonomic syndrome evidenced by sweating, nausea,

vomiting, abdominal cramps, diarrhea, hypotension and

bradycardia [5

–9].

The venom is rich in proteolytic enzymes responsible



for severe local effects such as swelling, local inflammation

and necrosis mainly due to the action of phospholipases

A

2

(PLA



2

) and metalloproteinases [7]. Hemorrhagic ef-

fects are attributed to alpha-fibrinogenases, active on the

factor XIII of the coagulation cascade, and hemorrhagic

metalloproteinases that provoke microvascular damage in

the organism, which leads to internal bleeding [10

–16].

This effect is enhanced by the action of thrombin-like



serine proteinases and C-type lectins that respectively in-

duce the consumption of fibrinogen and cause platelet ag-

gregation and hemaglutination [7, 17

–24]. Together, they

provoke the disturbance in blood coagulation and collab-

orate with the hemorrhagic profile observed during the

envenomation.

The PLA


2

exerts indirect hemolytic effect and plays a

major role in neurotoxic symptoms (stimulation of the

autonomic nervous system) and causes vomiting, diarrhea,

sweating, hyper salivation, bradycardia and hypotension in

human victims [7, 23, 25

–31]. Other components of the

venom include L-amino acid oxidases, bradykinin potenti-

ating peptides, cysteine-rich secretory proteins, C-type

natriuretic peptides, nerve growth factors and hyaluroni-

dases [7, 24, 32

–36].


Up to the present, the only specific therapy available

for snake envenomation is the serotherapy. Its efficiency

is mainly related to the amount of venom injected and

the time elapsed between the accident and the start of

treatment [37]. Despite being the treatment of choice, it

is limited to regions that have structured health centers

and may provoke several side effects, which makes the

search for additional and/or alternative treatments even

more important [6, 34]. Moreover, the venom of

L. muta


has low immunogenic capacity, when compared with

other venoms [38].

Plants popularly used to maintain or restore human

health provide an important source of compounds able to

directly assist in the treatment of accidents with venom-

ous animals, or indirectly, as a complement to conven-

tional antivenom therapy. The use of plant extracts, as an

antidote against venoms is an old option for many com-

munities that need rapid access to antivenom therapy.

In the Atlantic forest of the North and Northeast re-

gions of Brazil, the fruit juice and the aqueous extract of

soursop (

Annona muricata L.) leaves are often used by

local population to treat

Lachesis muta rhombeata en-

venomation [39]. The envenomation caused by

Lachesis

genus comprises an important health issue, especially in

regions where the production and distribution of anti-

venom are limited. The search for alternative methods

to minimize or delay the action of the venom is a neces-

sity and should be encouraged.

The aim of the current study was to evaluate the rele-

vance of the use of leaf extracts and juice of

Annona muri-

cata L., a plant traditionally used in the Brazilian Northeast

region against

Lachesis muta rhombeata venom.

Methods

Venom


The venom was kindly provided by Rodrigo C. Gonçalves

de Souza, founder and director of the Núcleo Serra

Grande for Captive Breeding of

Lachesis muta rhombeata,

Federal Technical Registry No. 495100. The present study

was approved by IBAMA (process no. 14785

–1).

Annona muricata L.



The aqueous extract of

Annona muricata L. leaves

(AmL) was prepared by maceration of 20 g of fresh

leaves newly collected in the presence of 80 mL of water

and then the extract was filtered through a clean cotton

fabric.


Annona muricata L. juice (AmJ) was prepared in

proportion of 50 % pulp and 50 % drinking water. The

leaf extract and juice were administered by gavage to an-

imals. For this study, three preparations of 0.5 mL

(water, AmJ or AmL) were administered by gavage, 1 h

and 15 min before and 1 h after intramuscular (i.m.) in-

jection of saline (control, 200

μL) or venom (200 μL, 3

mg/rat). The voucher specimen is deposited at the

Herbarium of University of São Paulo

– SPFR, in the

city of Ribeirão Preto, SP, Brazil, under the collector

identification MGroppo 1886.

Experimental groups

Animal care was in accordance with ethical recommen-

dations of the International Guiding Principles for Bio-

medical Research Involving Animals and the study was

approved by the Ethics Commission for the Use of

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 2 of 12


Animals (CEUA) of the University of São Paulo, Campus

of Ribeirão Preto (process no 07.1.277.53.1). Male Wistar

rats (209 ± 12 g) were supplied by the Central Biotherium

(University of São Paulo, Campus of Ribeirão Preto).

The animals were divided into six groups that were

analyzed in different times. Each animal from the groups

LmrV, LmrV + AmL and LmrV + AmJ received an intra-

muscular injection of 3 mg of venom diluted in physio-

logical solution (200

μL), which is a previously

determined non-lethal dose (data not shown) and re-

ceived, respectively, water, aqueous extract of soursop

leaves and soursop juice. The control groups C, C +

AmL and C + AmJ received an intramuscular injection

of physiological solution (200

μL) followed by water,

aqueous extract of soursop leaves and soursop juice, re-

spectively. Each group was evaluated in three different

times after injection of physiological solution or venom:

1, 6 and 24 h.

At the appointed time for each subgroup (1, 6 or 24 h

after injection), the animals were anesthetized with a intra-

peritoneal injection of a mixture of ketamine (35 mg/kg)

and xylazine (5 mg/kg), and subjected to cardiac puncture

for collecting blood. Then, they were euthanized in a CO

2

chamber.



Biochemical parameters

The concentrations of albumin, total protein, blood glu-

cose, urea, creatinin, aspartate aminotranspherase (AST)

and creatine kinase (CK) were evaluated in the serum of

the animals submitted to different treatments. All bio-

chemical analyses were performed at the Laboratory of

Clinical Analysis of the School of Pharmaceutical Sciences

of Ribeirão Preto in an automated analyzer BT 3000 Plus

(Wiener Lab, Argentina, serial number 41080340).

Hematological parameters

Hematological parameters were determined in whole

blood of animals using classical methods: volume of

packed red blood cells or hematocrit (Ht) by the micro-

hematocrit method, total hemoglobin concentration

(Hb) by the cyanmethemoglobin method, red blood cells

(RBC) count with a Neubauer hemacytometer using

Hayem diluting fluid.

Hemostatic parameters

The prothrombin time and partial thromboplastin time

were determined using a commercial kit of Wiener Lab

(Wiener Lab, Argentina).

Blood pressure

The blood pressure was evaluated by tail-cuff plethys-

mography with heating [40, 41].

Inflammatory process

The assays used to evaluate the inflammatory profile

triggered by

Lachesis muta rhombeata envenomation

were the global leukocyte count, differential leukocyte

count, serum protein quantification after electrophoresis

in agarose gel and concentration of interleukin-6, deter-

mined by enzyme immunoassay (commercial kit from R

& D Systems). Serum proteins were separated by agarose

electrophoresis [42]. Bands were quantified by densitom-

etry (DenGo Densitometer, Qualiterm, Brazil).

Lethality assay

The lethal dose 50 (LD

50

) for



Lachesis muta rhombeata

venom was calculated by the probits method [43]. Three

experimental groups (see below) of male Balb-C mice

(22 ± 3 g) were injected with four different doses of

venom (100

μL, i.m.): 10, 20, 40 and 80 mg/kg (ten ani-

mals per dose). The choice of the venom doses was

based on the studies of Otero et al. [25].

1. LmrV: animals received water (150 mL) by gavage

15 min before venom injection.

2. LmrV + AmL: animals were administered aqueous

extract of soursop leaves (150 mL) by gavage 15 min

before venom injection.

3. LmrV + AmJ: animals received soursop juice (150

mL) by gavage 15 min before venom injection.

Statistical analysis

The results are expressed as mean ± standard error of

mean (SEM). The statistical analysis was carried out by

one-way ANOVA followed by Tukey-Kramer post-hoc test

with a significance level set at

p < 0.05, using Graphpad

Prism® 4.0 software for Windows

™.

Results and discussion



Biochemical parameters

A time-dependent decrease is observed for total protein

and albumin (Fig. 1

– a and b) in groups in which ani-

mals were injected with venom, which is consistent with

the intensity of the inflammatory process triggered by

the envenomation. The biochemical changes observed in

L. muta rhombeata envenomation are consequences of

the main action of enzymes present in the venom, such

as PLA


2

, thrombin like serine proteinases and metallo-

proteinases. PLA

2

and metalloproteinases exert intense



inflammatory and myotoxic effects. The inflammatory

process triggers an acute phase reaction, altering the

concentration of serum proteins, mainly albumin, which

is part of the group of negative acute phase inflamma-

tory proteins, and its synthesis is reduced during the

inflammatory process. The decrease of total protein con-

centration occurs along with the reduction of albumin

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 3 of 12



concentration, since this is the most abundant protein in

blood [44].

The results show an increase of serum urea (Fig. 1

– c)


during the early hours after the venom injection in the un-

treated group (LmrV 1 h and LmrV 6 h) and in treated

groups (LmrV + AmL, 1 h and 6 h; LmrV + AmJ, 1 h and 6

h), but increases in serum urea observed in the treated

groups were lower (6 h) than those observed in untreated

animals, showing that treatment may be able to partially re-

verse this effect of the venom. After 24 h of envenomation,

the concentration of urea tend to return to control values.

The increased concentrations of urea and creatinine

are commonly observed after

Lachesis muta envenom-

ation in humans [6, 45]. The fibrin clots may be respon-

sible for this response observed in the groups injected

with venom. According to Souza [45] and Lima et al.

[23], the increase of urea is possibly the result of depos-

ition of fibrin clots in the kidneys due to the action of

thrombin-like serine proteinases present in

Lachesis


venom, which promotes thrombin cleavage into fibrino-

gen and fibrin clots. The venom-induced renal damage

could also be a consequence of the myoglobin deposit in

the kidney, since the venom is myotoxic, or due to pe-

riods of renal hypotension [29, 46].

The increase in creatinine concentration is usually ac-

companied by increased concentrations of urea, as indica-

tive of decreased glomerular filtration rate. Pardal et al. [8]

in a case report, noted an increase in creatinine during the

first day after the snakebite, which returned to normal

levels of concentration after that. Although the animals

had shown increased urea levels in the early hours (1 and

6 h) after the envenomation, no changes were observed in

serum creatinine (data not shown).

A time-dependent decrease was also observed in blood

glucose (Fig. 1

– d) in the group injected with LmrV as

well as the maintenance of normal glucose values in the

group treated with aqueous extract of

Annona muricata

L. leaves (LmrV + AmL), evidencing that AmL treatment

was able to control glucose levels. Taylor [47] de-

scribes the popular use of soursop to control the

blood glucose levels of diabetic people, in Amazonian

region of Peru.

Fig. 1 a Concentration of total proteins, b albumin, c urea, d glucose, e CK and f AST in the serum of male Wistar rats injected with 3 mg of Lachesis

muta rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after envenomation (LmrV) and with their respective treatments with aqueous extract of Annona muricata L.

leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ). The numbers above the columns represent the number of animals used in each test.

*** p < 0.001, ** p < 0.01, * p 0.05 compared to control group. p < 0.05, °° p < 0.01 compared with the envenomation group (LmrV)

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 4 of 12



The Fig. 1

– E shows that LmrV induces an increase

of CK, which is a biomarker of muscle damage, in the

1

st



and 6

th

hours, while Fig. 1



– F shows an increase in

AST mainly 24 h after envenomation. These effects are

probably due to the myotoxic action of venom PLA

2

, as



well as the action of metalloproteinases that indirectly

lead to death of muscle fibers, due to the reduction

of tissue perfusion [23, 26, 29,]. CK levels in groups

LmrV + AmL and LmrV + AmJ, both 6 h after en-

venomation, are lower than that observed in the un-

treated group LmrV (Fig. 1

– e), suggesting a

protective effect of the juice and aqueous extract of

soursop leaves against myotoxic activity of the venom.

Although not significant, there is a reduction of CK

concentration 24 h after envenomation in the treated

groups when compared to the untreated group (LmrV

24 h), which reinforces the hypothesis that the treat-

ment may have protective effect against the myotoxi-

city of

Lachesis muta rhombeata venom.



There was an increase in AST (Fig. 1

– f) observed in

groups LmrV, LmrV + AmL and LmrV + AmJ, mainly 24

h after injection of the venom. AST is a sensitive marker

for liver damage, but its significant increase in groups

injected with LmrV does not necessarily indicates liver

damage, since AST is also distributed in appreciable

amounts in cardiac tissues, muscles, red blood cells,

brain and kidney, and this increase may be due to

hemolysis and/or myotoxicity caused by the envenom-

ation [48]. In case reports published by Jorge et al. [7] and

Torres et al. [49], both also described increased liver trans-

aminases after

Lachesis muta envenomation in humans.

Hematological parameters

Our results showed a significant initial increase (1 h) of

hematocrit values followed by decay (24 h), in the

groups injected with venom (Fig. 2

– a), with and with-

out treatment (LmrV, LmrV + AmL and LmrV + AmJ).

These values drop significantly after 24 h. The same effect,

an initial increase and decrease after 24 h, was also ob-

served in total hemoglobin concentrations (Fig. 2

– b), as


well as in the red blood cell count (Fig. 2

– c), being the

increase significant only in the group LmrV + AmL (1 h).

The treatments with AmL and AmJ appear to worsen the

hematological profile induced by LmrV, since the treated

groups showed a significant decrease of hemoglobin (24 h)

compared with LmrV group (Fig. 2

– b).


An evidence of envenomation by

Lachesis muta rhom-

beata is indirect hemolytic effect induced by the PLA

2

present in the venom, which acts on the phospholipids



of the cell membrane, causing the lysis of red blood cells

[25, 45]. Campos et al. [50] also attributed the hemolytic

effect to PLA

2

, since inhibition of this toxin by triazole



derivatives is capable of neutralizing the hemolytic activ-

ity of


Lachesis muta venom. This effect probably occurs

due to the initial hemoconcentration caused by plasma

extravasations to tissues and dehydration due to diar-

rhea, probably due to the hemolytic action of the venom

toxins [25, 45, 51]. One hypothesis to justify this result with

the treated groups is the effect of soursop to treat diarrhea,

preventing the fluid loss by the animal [47]. In this sense,

for the same amount of hemoglobin, there is a greater vol-

ume of plasma, leading to decreases in the total

hemoglobin concentration. The same pattern is observed in

the red blood cell count and hematocrit (Fig. 2

– a and c).

Several case reports show hematological changes dur-

ing the envenomation. Pardal et al. [8] reported these

changes during 24 h after envenomation by

Lachesis. On

admission at the hospital, the hematocrit of the patient

was 40 % and the total hemoglobin 11.3 g/L. After 24 h,

the hematocrit was under 25 % and hemoglobin 8.1 g/L.

A similar profile was described by Jorge et al. [7], in

which they report hematocrit values of 54 % two hours

after the snake bite, and 47 % after 24 h. The same oc-

curred with the hemoglobin concentration, which was

18.2 g/dL after two hours and 16 g/dL after 24 h of en-

venomation. The decrease of hemoglobin concentration

was accompanied by reduction of total red blood cells.

Hemostatic parameters

We found a significant increase in prothrombin time

(Fig. 3

– a) and an increase of partial thromboplastin



time (Fig. 3

– b) in the first hour after the venom injec-

tion (LmrV 1 h). A tendency to normalization was ob-

served in the following hours (6 and 24 h). Groups

treated with AmL and AmJ maintained prothrombin

time at values close to the control group, suggesting a

positive effect of the treatments with

Annona muricata

L. on hemostasis. In the case reports published by Pardal

et al. [8] and Jorge et al. [7] there are descriptions of pa-

tients with incoagulable blood (clotting time test) even

26 h after the snakebite, and increased prothrombin time

and partial thromboplastin time values two hours after

the envenomation.

The envenomation by snakes of the Viperidae family

induces changes in hemostasis and causes hemorrhagic

syndromes. These processes involve a large number of

molecules that promote microvascular damage or interfere

with the coagulation cascade, and as pro- and antiaggregat-

ing toxins affecting blood platelets. Metalloproteinases,

thrombin-like serine proteinases, PLA

2

and type-C lectins



are involved in this process [10, 17, 23, 27, 52

–55]. To-

gether they cause an imbalance in the hemostatic system

and tissues repair, leading to persistent bleeding.

Blood pressure

The evaluation of blood pressure during

Lachesis en-

venomation is very important, since the snakebite causes

an intense decrease in blood pressure, commonly seen

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 5 of 12



in envenomation in humans [45]. The hypotension is

provoked by the combined autonomic and hemorrhagic

effects as well as bradycardia. The vagal symptomatology

consists of the following symptoms: sweating, nausea,

vomiting, abdominal cramps, diarrhea, hypotension and

bradycardia and is probably caused by PLA

2

[29, 56].



The hemorrhagic effects are due to the actions of

thrombin-like serine proteinases and metalloproteinases,

which deplete the reserves of fibrinogen and cause

microvascular damage, respectively.

A time-dependent tendency of blood pressure reduc-

tion was observed in the animals injected with LmrV, es-

pecially after 24 h, in all groups analyzed (Fig. 4). It is

important to note that the reduction of blood pressure

was more pronounced in animals injected with LmrV

and treated with AmL or AmJ than in animals only

injected with LmrV, especially 1 and 6 h after envenom-

ation. Although the treatment with the juice (LmrV +

AmJ) has not presented significant differences when

compared to the untreated group (LmrV), the results

indicate that AmJ may potentiate the hypotensive

effect of LmrV. We also noted a slight hypotensive

effect in the control group of

Annona muricata L.

juice (C + AmJ).

Studies in animal models demonstrated hypotensive,

vasodilator and cardiac depressant effects of

Annona


muricata L. and its use is not recommended for

people with hypotension [47]. Due to this natural ef-

fect of the plant, the treatment with soursop juice

could intensify the hypotension observed in human

Fig. 2 a Hematocrit, b total hemoglobin concentration, c total red blood cells count in whole blood of male Wistar rats injected with 3 mg of

Lachesis muta rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after envenomation (LmrV) and with their respective treatments with aqueous extract of

Annona muricata L. leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ). The numbers above the columns represent the number of

animals used in each test. *** p < 0.001, ** p < 0.01 compared to control group. °°° p < 0.001 compared to the envenomation group (LmV)

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 6 of 12


envenomation, as shown in case reports of snakebites

caused by

Lachesis genus [9, 45].

A. muricata L. reduces blood pressure by a mechan-

ism that does not involve muscarinic, endothelial, hista-

minergic, adrenergic or endothelial-dependent pathways.

The more likely mechanism of action is Ca

2+

antagon-



ism, involving voltage dependent Ca

2+

channel blockade



and/or inhibition of Ca

2+

release from intracellular



stores of the blood vessels [57]. The hypotensive effect

of

A. muricata may be attributed to the combined action



of alkaloids and essential oils present in the plant. The

alkaloids, isoquinoline, coreximine and anomurine exert

a transient depressive effect on the blood pressure. The

essential oil beta-caryophyllene exhibits hypotensive and

Fig. 3 a Determination of prothrombin time and b partial thromboplastin time in plasma of male Wistar rats injected with 3 mg of Lachesis muta

rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after envenomation (LmrV) and with their respective treatments with aqueous extract of Annona muricata L.

leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ). The numbers above the columns represent the number of animals used in each

test. *** p < 0.001, ** p < 0.01 compared to control group. °° p < 0.001 compared to the envenomation group (LmrV)

Fig. 4 Variation of systolic blood pressure during 24 h after the envenomation with Lachesis muta rhombeata venom (LmrV) and their respective

treatments with aqueous extract of Annona muricata L. leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ). The animals, male Wistar

rats, were injected with 3 mg of Lachesis muta rhombeata venom and the blood pressure was measured before the venom injection and at 1, 6

and 24 h after the envenomation. The numbers above the columns represent the number of animals used in each test

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 7 of 12


vasodilator effects. Furthermore, reticuline, another alkaloid

found in


Annona muricata leaves, can cause hypotension

through voltage-dependent Ca

2+

channel blockade and/or



inhibition of Ca

2+

release from norepinephrine-sensitive



intracellular stores [57].

Inflammatory process

Serum proteins

Most of serum proteins are involved in the inflammatory

response, as positive acute-phase proteins or negative

acute-phase proteins [42]. Our analysis (Table 1) shows

the serum protein profile of animals at different times

(1, 6 and 24 h) after envenomation (LmrV) and treated

with AmL or AmJ, showing alterations related to the in-

flammatory response induced by LmrV. The albumin

significantly decreases 6 and 24 h after LmrV injection,

with and without the treatments (AmL and AmJ), a re-

sult that is confirmed by the biochemical analysis of this

protein (Fig. 1

– b).

The alpha-1 zone is composed of positive acute-phase



proteins such as proteinase inhibitors, and is increased

24 h after the envenomation without treatment (LmrV

24 h), due to the acute inflammatory process triggered

by the venom. The same occurs with the alpha-2 zone,

which is also composed of positive acute-phase proteins,

and is increased in untreated groups (LmrV 24 h) and in

the group treated with aqueous extract of

Annona muri-

cata L. leaves (LmrV + AmL 24 h).

The beta zone is mainly represented by transferrin and

C3 component of complement system, and can be di-

vided into beta-1 and beta-2 zones. There is a significant

increase in beta zone in the groups injected with venom

Table 1 Percentages of serum proteins of the animals at different times after envenomation

Groups

N

a



Albumin (%)

b

Alfa-1 (%)



b

Alfa-2 (%)

b

Beta-1 (%)



b

Beta-2 (%)

b

Gama (%)


b

Control


36

59.84 ± 0.51

15.10 ± 0.72

8.61 ± 0.31

5.76 ± 0.19

8.39 ± 0.18

2.02 ± 0.08

C + AmL


27

59.46 ± 0.67

14.88 ± 0.63

9.67 ± 0.62

5.84 ± 0.19

8.28 ± 0.17

1.92 ± 0.10

C + AmJ


28

59.66 ± 0.66

15.61 ± 0.86

6.60 ± 0.62

6.20 ± 0.23

8.88 ± 0.18

2.32 ± 0.13

LmrV 1h


10

56.14 ± 1.24

18.72 ± 1.17

8.15 ± 0.72

5.69 ± 0.20

8.76 ± 0.31

2.54 ± 0.27

LmrV 6h


10

55.56 ± 0.81*

18.20 ± 0.75

9.47 ± 0.74

6.52 ± 0.43

8.03 ± 0.26

2.21 ± 0.24

LmrV 24h


9

45.60 ± 0.92*

21.22 ± 0.78*

14.82 ± 1.90*

12.33 ± 0.28*

8.80 ± 0.24

1.70 ± 0.27

LmrV + AmL 1h

5

56.50 ± 0.54



20.44 ± 0.45

6.34 ± 0.26

5.76 ± 0.22

9.12 ± 0.22

1.62 ± 0.20

LmrV + AmL 6h

6

54.20 ± 0.41*



19.30 ± 0.52

7.68 ± 0.60

7.25 ± 0.20

9.50 ± 0.36

1.70 ± 0.27

LmrV + AmL 24h

5

40.70 ± 1.81*



17.10 ± 1.36

12.82 ± 0.44*

10.42 ± 0.30*

15.28 ± 2.56*°

2.12 ± 0.24

LmrV + AmJ 1h

6

57.43 ± 0.73



16.55 ± 0.34

9.82 ± 0.58

5.53 ± 0.33

8.50 ± 0.34

2.16 ± 0.14

LmrV + AmJ 6h

6

52.78 ± 1.48*



20.02 ± 0.66

7.28 ± 0.49

6.98 ± 0.68

9.97 ± 0.26

2.66 ± 0.42

LmrV + AmJ 24h

6

40.33 ± 1.81*



19.35 ± 1.01

10.95 ± 0.99

10.87 ± 0.44*

14.70 ± 2.22*°

2.05 ± 0.24

Male Wistar rats were injected with 3 mg of Lachesis muta rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after envenomation (LmrV) and treated respectively with aqueous

extract of Annona muricata L. leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ)

a

Number of animals per group.



b

Percentages of serum proteins estimated by densitometry, represented by mean ± SEM. * p < 0.05, significant difference

compared to control group.

° p < 0.05, significant difference compared to envenomation LmrV group (without treatment)

Fig. 5 Interleukin-6 concentration of male Wistar rats injected with 3 mg of Lachesis muta rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after

envenomation (LmrV) and with their respective treatment with aqueous extract of Annona muricata L. leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L.

juice (LmrV + AmJ). The numbers above the columns represent the number of animals used in each test. *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05

compared to control group

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 8 of 12


after 24 h, with and without treatment (LmrV 24 h,

LmrV + AmL 24 h and LmrV + AmJ 24 h). The gama

zone, composed by imunoglobulins, did not show any

changes during the envenomation. These results confirm

the inflammatory process triggered by the venom. Add-

itionally, they show that treatments did not interfere

with these parameters.

Interleukin-6

We observed increased concentrations of IL-6 mainly 6

h after envenomation (Fig. 5). Treatment did not inter-

fere with this LmrV effect. The IL-6 increase is consist-

ent with other results already obtained, initiating and

propagating the acute phase inflammatory response to

the injury induced by the envenomation.

IL-6 has both pro-inflammatory and anti-inflammatory

properties. It is often used as a marker to evaluate the

inflammatory process and has been correlated with the

severity of envenomation, together with other pro-

inflammatory cytokines, such as TNF-alpha, IL-1b, IL-8,

IL-10, IL-12 and COX-2 [58

–63]. IL-6 cannot be uniquely

related to pro-inflammatory response. It is known

that the soluble form of IL-6 receptor is related to its

pro-inflammatory activity whereas classic IL-6 is re-

quired for regenerative or anti-inflammatory activities

of the cytokine [64, 65].

Fig. 6 a Total white blood cells count, b relative count of lymphocytes and c segmented neutrophils of male Wistar rats injected with 3 mg of

Lachesis muta rhombeata venom, at 1, 6 and 24 h after envenomation (LmrV) and with their respective treatments with aqueous extract of

Annona muricata L. leaves (LmrV + AmL) or Annona muricata L. juice (LmrV + AmJ). The numbers above the columns represent the number of

animals used in each test. *** p < 0.001, ** p < 0.01 compared to control group. °° p < 0.001, ° p < 0.001 compared to envenomation group

without treatment (LmV)

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 9 of 12



Total and relative white blood cells count

The venom itself was not sufficient to alter significantly

the total white blood cell count (Fig. 6

– a). However,

there was a time-dependent trend in the increasing

number of leukocytes in animals injected with venom

without treatment (LmrV).

The differential leukocyte count of the groups injected

with

Lachesis muta rhombeata venom clearly shows the



reduction of lymphocytes in the early hours after en-

venomation over the increasing of neutrophil number

(Fig. 6

– b and c, respectively), and an increase of lym-



phocytes 24 h after envenomation accompanied by a de-

crease in the number of neutrophils. This effect of the

venom on defense cells can be explained by the clonal

expansion of B lymphocytes during the production of

antibodies specific for the toxins present in the venom

[66]. Neutrophilia occurs in the early hours of envenom-

ation and returns to normal within 24 h after envenom-

ation, indicating the recruitment of these cells to sites

where tissue damages were intense.

Lethality assay

The determination of the lethal dose 50 % (LD

50

) is es-



sential for the standardization of antivenoms of natural

origin, which justifies this test in order to evaluate the

efficiency of treatment with AmL and AmJ for cases of

Lachesis muta rhombeata envenomation.

The LD

50

obtained in this study in the untreated group



(LmrV) was 51.0 ± 6.4 mg/kg (44.6 to 57.4 mg/kg). The

LD

50



obtained for the group injected with the venom and

treated with soursop juice (LmrV + AmJ) was 56.3 ± 8.5

mg/kg (47.8 to 64.8 mg/kg) and the LD

50

obtained for the



group injected with the venom and treated with aqueous

extract of soursop leaves (LmrV + AmL) was 62.2 ± 6.8

mg/kg (55.4 to 69.0 mg/kg). These results show that the

treatment did not significantly alter the LD

50

values of the



venom, when considering the fiducial limits for each test.

Conclusion

The clinical profile of the envenomation caused by

La-


chesis muta rhombeata was well documented and very

detailed for the first 24 h after the injection of the

venom, and could evaluate the efficiency of the popular

use of soursop (

Annona muricata L.) as natural anti-

venom in snakebites caused by this specie.

In general, the treatments with AmL and AmJ do not

alter relevantly the lethality of the envenomation, as the

LD

50

values have shown. They played a role in the main-



tenance of blood glucose and the coagulation parameters

and exert a protective action against the myotoxicity of

the venom. However, both treatments seem to worsen

the hypotensive effect induced by LmrV. Therefore, add-

itional studies with

A. muricata are necessary to deter-

mine its suitable forms of use and mechanism of action

in order to enable its safe and effective use as natural

antivenom for bushmaster snakebite.

Ethics approval

Animal care was in accordance with the ethical recommen-

dations of the International Guiding Principles for Biomed-

ical Research Involving Animals. The present study was

approved by the Ethics Commission for the Use of Animals

(CEUA) of the University of São Paulo, Campus of Ribeirão

Preto (process no. 07.1.277.53.1). The use of snake venom

was approved by IBAMA (process no. 14785

–1).


Abbreviations

AmJ:


Annona muricata L. juice; AmL: Annona muricata L. leaves; AST: aspartate

amino transferase; CK: creatine kinase; Hb: hemoglobin concentration;

Ht: hematocrit; IL: interleukin; LmrV: Lachesis muta rhombeata venom;

PLA


2

: phospholipase A

2

; RBC: red blood cells; SEM: standard error of mean.



Competing interests

The authors declare that there are no competing interests.

Authors

’ contributions



CMC was the master student responsible for the project, and was involved

in the organization and execution of the experimentation section,

acquisition of data, statistical analysis and interpretation of data, drafting and

revising the manuscript. ECA was the mentor and senior researcher of this

project, and was involved since the conception of the project, the analysis

and interpretation of data, and critical revision of the manuscript for

important intellectual content. FPL, FAC and IAC made substantial

contributions during the experimental execution, and revised the

manuscript. KCFB was involved in the design of the project and provided

fruitful discussions and guidance during the development of the project, and

revised the manuscript. RCGS was responsible for the acquisition and

donation of Lachesis muta rhombeata venom, and critical revision of the

manuscript, enlightening the clinical relevance of the results obtained during

the project. ZMOG and AMS revised the manuscript, and shared their

expertise in the hematological profile of the envenomation. All authors read

and approved the final manuscript.

Acknowledgements

The authors are grateful to Dr. Marcelo Dias Baruffi, Luisa Helena Dias Costa,

Luciana Prado Turin, and Laboratory of Clinical Analysis of School of

Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto for assistance in clinical analysis. This

study was supported by the following grants: the São Paulo Research

Foundation (FAPESP, grant no. 2005/54855

–0 and doctoral scholarship to FAC

2012/13590

–8), the National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq, masters scholarship to CMC 143472/2011

–9) and

Research Support Center in Animal Toxins (NAP-TOXAN-USP, grant no. 12-



125432.1.3). Thanks are also due to the Center for the Study of Venoms and

Venomous Animals (CEVAP) of UNESP for enabling the publication of this paper

(CAPES, grant n

o

. 23038.006285/2011



–21, AUXPE – Toxinologia – 1219/2011).

Author details

1

Department of Physics and Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences of



Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP, Brazil.

2

Department of Clinical Analyses, Toxicology and Food Sciences, School of



Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP),

Ribeirão Preto, SP, Brazil.

3

Núcleo Serra Grande for Captive Breeding of



Lachesis muta rhombeata, CTF Ibama MMA, 495100 Itacaré, BA, Brazil.

Received: 18 December 2015 Accepted: 29 February 2016

References

1.

Zamudio KR, Greene HW. Phylogeography of the bushmaster (Lachesis



muta: Viperidae): implications for neotropical biogeography, systematics,

and conservation. Biol J Linn Soc. 1997;62(3):421

–42. doi:10.1111/j.1095-

8312.1997.tb01634.x.

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 10 of 12


2.

Campbell JA, Lamar WW. The Venomous Reptiles of Latin America. Ithaca &

London: Comstock/Cornell University Press; 1989.

3.

De Souza RCG. Concerning Lachesis and Capoeira: An Anti-Article by a



Brazilian Outsider. Bull Chicago Herp Soc. 2006;40(4):65

–8.


4.

Menaldo DL, Jacob-Ferreira AL, Bernardes CP, Cintra AC, Sampaio SV.

Purification procedure for the isolation of a P-I metalloprotease and an

acidic phospholipase A2 from Bothrops atrox snake venom. J Venom Anim

Toxins incl Trop Dis. 2015;21:28. doi:10.1186/s40409-015-0027-6.

5.

Madrigal M, Sanz L, Flores-Diaz M, Sasa M, Nunez V, Alape-Giron A, et al.



Snake venomics across genus Lachesis. Ontogenetic changes in the venom

composition of Lachesis stenophrys and comparative proteomics of the

venoms of adult Lachesis melanocephala and Lachesis acrochorda. J

Proteomics. 2012;77:280

–97. doi:10.1016/j.jprot.2012.09.003.

6.

Cardoso JLC, França FOS, Wen FH, Málaque CMS, Haddad Jr V. Animais



Peçonhentos no Brasil. Biologia, Clínica e Terapêutica dos Acidentes. Sarvier:

São Paulo; 2003.

7.

Jorge MT, Sano-Martins IS, Tomy SC, Castro SC, Ferrari RA, Ribeiro LA, et al.



Snakebite by the bushmaster (Lachesis muta) in Brazil: case report and

review of the literature. Toxicon. 1997;35(4):545

–54.

8.

Pardal PP, Souza SM, Monteiro MR, Fan HW, Cardoso JL, Franca FO, et al.



Clinical trial of two antivenoms for the treatment of Bothrops and Lachesis

bites in the north eastern Amazon region of Brazil. Trans R Soc Trop Med

Hyg. 2004;98(1):28

–42.


9.

Mellor NH, Arvin JC. A Bushmaster bite during a birding expedition in

lowland southeastern Peru. Wilderness Environ Med. 1996;7(3):236

–40.


10.

Magalhaes A, de Oliveira GJ, Diniz CR. Purification and partial

characterization of a thrombin-like enzyme from the venom of the

bushmaster snake, Lachesis muta noctivaga. Toxicon. 1981;19(2):279

–94.

11.


Yarleque A, Campos S, Escobar E, Lazo F, Sanchez N, Hyslop S, et al. Isolation

and characterization of a fibrinogen-clotting enzyme from venom of the snake,

Lachesis muta muta (Peruvian bushmaster). Toxicon. 1989;27(11):1189

–97.


12.

Sanchez EF, Magalhaes A, Diniz CR. Purification of a hemorrhagic factor

(LHF-I) from the venom of the bushmaster snake, Lachesis muta muta.

Toxicon. 1987;25(6):611

–9.

13.


Sanchez EF, Costa MI, Chavez-Olortegui C, Assakura MT, Mandelbaum FR,

Diniz CR. Characterization of a hemorrhagic factor, LHF-I, isolated from the

bushmaster snake (Lachesis muta muta) venom. Toxicon. 1995;33(12):1653

–67.


14.

Sanchez EF, Cordeiro MN, De Oliveira EB, Juliano L, Prado ES, Diniz CR.

Proteolytic specificity of two hemorrhagic factors, LHF-I and LHF-II, isolated

from the venom of the bushmaster snake (Lachesis muta muta). Toxicon.

1995;33(8):1061

–9.


15.

Sanchez EO, Magalhaes A. Purification and partial characterization of an L-

amino acid oxidase from bushmaster snake (Surucucu Pico de Jaca) Lachesis

muta muta venom. Braz J Med Biol Res. 1991;24(3):249

–60.

16.


Sanchez EF, Souza CT, Bello CA, Richardson M, Oliveira EB, Magalhaes A.

Resolution of isoforms of mutalysin II, the metalloproteinase from

bushmaster snake venom. Toxicon. 2003;41(8):1021

–31.


17.

Sartim MA, Sampaio SV. Snake venom galactoside-binding lectins: a

structural and functional overview. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis.

2015;21:35. doi:10.1186/s40409-015-0038-3.

18.

Hermogenes AL, Richardson M, Magalhaes A, Yarleque A, Rodriguez E, Sanchez



EF. Interaction of a plasminogen activator proteinase, LV-PA with human alpha2-

macroglobulin. Toxicon. 2006;47(4):490

–4. doi:10.1016/j.toxicon.2005.12.009.

19.


Weinberg ML, Felicori LF, Bello CA, Magalhaes HP, Almeida AP, Magalhaes

A, et al. Biochemical properties of a bushmaster snake venom serine

proteinase (LV-Ka), and its kinin releasing activity evaluated in rat mesenteric

arterial rings. J Pharmacol Sci. 2004;96(3):333

–42.

20.


Magalhaes A, Ferreira RN, Richardson M, Gontijo S, Yarleque A, Magalhaes

HP, et al. Coagulant thrombin-like enzymes from the venoms of Brazilian

and Peruvian bushmaster (Lachesis muta muta) snakes. Comp Biochem

Physiol B Biochem Mol Biol. 2003;136(2):255

–66.

21.


Felicori LF, Souza CT, Velarde DT, Magalhaes A, Almeida AP, Figueiredo S, et

al. Kallikrein-like proteinase from bushmaster snake venom. Protein Expr

Purif. 2003;30(1):32

–42.


22.

Aguiar AS, Alves CR, Melgarejo A, Giovanni-de-Simone S. Purification and

partial characterization of a thrombin-like/gyroxin enzyme from bushmaster

(Lachesis muta rhombeata) venom. Toxicon. 1996;34(5):555

–65. doi:10.1016/

0041-0101(95)00159-X.

23.

Lima ME, Pimenta AMC, Martin-Eauclaire MF, Zingali RB, Rochat H. Animal



Toxins: State of the Art- Perspectives in health and biotechnology. Belo

Horizonte: UFMG; 2009.

24.

Pla D, Sanz L, Molina-Sanchez P, Zorita V, Madrigal M, Flores-Diaz M, et al.



Snake venomics of Lachesis muta rhombeata and genus-wide antivenomics

assessment of the paraspecific immunoreactivity of two antivenoms

evidence the high compositional and immunological conservation across

Lachesis. J Proteomics. 2013;89:112

–23. doi:10.1016/j.jprot.2013.05.028.

25.


Otero R, Furtado MF, Goncalves C, Nunez V, Garcia ME, Osorio RG, et al.

Comparative study of the venoms of three subspecies of Lachesis muta

(bushmaster) from Brazil Colombia and Costa Rica. Toxicon. 1998;36(12):2021

–7.


26.

Cordeiro FA, Perini TG, Bregge-Silva C, Cremonez CM, Rodrigues RS,

Boldrini-Franca J, et al. A new phospholipase A2 from Lachesis muta

rhombeata: Purification, biochemical and comparative characterization with

crotoxin B. Protein Pept Lett. 2015;22(9):816

–27.


27.

Fuly AL, Calil-Elias S, Zingali RB, Guimaraes JA, Melo PA. Myotoxic activity of

an acidic phospholipase A2 isolated from Lachesis muta (Bushmaster) snake

venom. Toxicon. 2000;38(7):961

–72.

28.


Fuly AL, de Miranda AL, Zingali RB, Guimaraes JA. Purification and

characterization of a phospholipase A2 isoenzyme isolated from Lachesis

muta snake venom. Biochem Pharmacol. 2002;63(9):1589

–97.


29.

Damico DC, Bueno LG, Rodrigues-Simioni L, Marangoni S, da Cruz-Hofling

MA, Novello JC. Neurotoxic and myotoxic actions from Lachesis muta muta

(surucucu) whole venom on the mouse and chick nerve-muscle

preparations. Toxicon. 2005;46(2):222

–9. doi:10.1016/j.toxicon.2005.04.011.

30.

Damico DC, Lilla S, de Nucci G, Ponce-Soto LA, Winck FV, Novello JC, et al.



Biochemical and enzymatic characterization of two basic Asp49

phospholipase A2 isoforms from Lachesis muta muta (Surucucu) venom.

Biochim Biophys Acta. 2005;1726(1):75

–86. doi:10.1016/j.bbagen.2005.05.022.

31.

Diniz MR, Oliveira EB. Purification and properties of a kininogenin from the



venom of Lachesis muta (bushmaster). Toxicon. 1992;30(3):247

–58.


32.

Costa TR, Burin SM, Menaldo DL, de Castro FA, Sampaio SV. Snake venom L-

amino acid oxidases: an overview on their antitumor effects. J Venom Anim

Toxins incl Trop Dis. 2014;20:23. doi:10.1186/1678-9199-20-23.

33.

Bregge-Silva C, Nonato MC, de Albuquerque S, Ho PL. Junqueira de



Azevedo IL, Vasconcelos Diniz MR, et al. Isolation and biochemical,

functional and structural characterization of a novel L-amino acid oxidase

from Lachesis muta snake venom. Toxicon. 2012;60(7):1263

–76. doi:10.1016/j.

toxicon.2012.08.008.

34.


Soares MR, Oliveira-Carvalho AL, Wermelinger LS, Zingali RB, Ho PL,

Junqueira-de-Azevedo IL, et al. Identification of novel bradykinin-

potentiating peptides and C-type natriuretic peptide from Lachesis muta

venom. Toxicon. 2005;46(1):31

–8. doi:10.1016/j.toxicon.2005.03.006.

35.


Sanz L, Escolano J, Ferretti M, Biscoglio MJ, Rivera E, Crescenti EJ, et al.

Snake venomics of the South and Central American Bushmasters.

Comparison of the toxin composition of Lachesis muta gathered from

proteomic versus transcriptomic analysis. J Proteomics. 2008;71(1):46

–60.

doi:10.1016/j.jprot.2007.10.004.



36.

Wiezel GA, Dos Santos PK, Cordeiro FA, Bordon KC, Selistre-de-Araujo HS,

Ueberheide B, et al. Identification of hyaluronidase and phospholipase B in

Lachesis muta rhombeata venom. Toxicon. 2015;107(Pt):359

–68. doi:10.1016/

j.toxicon.2015.08.029.

37.

França FOS. Associação da envenenomia e de gravidade em acidentes



botrópicos, no momento da admissão no Hospital Vital Brasil do Instituto

Butantã de São Paulo, com variáveis epidemiológicas, clínicas e

laboratoriais. Rev Soc Bras Med Trop. 1998;3:187

–90.


38.

Stephano MA, Guidolin R, Higashi HG, Tambourgi DV, Sant

’Anna OA. The

improvement of the therapeutic anti-Lachesis muta serum production in

horses. Toxicon. 2005;45(4):467

–73. doi:10.1016/j.toxicon.2004.12.006.

39.

De Souza RCG, Nogueira APB, Lima T, Cardoso JLC. The enigma of the



north margin of the Amazon River: proven Lachesis bites in Brazil, report of

two cases, general considerations about the genus and bibliographic

review. Bull Chicago Herp Soc. 2007;42(7):105

–15.


40.

Mahoney LT, Brody MJ. A method for indirect recording of arterial pressure

in the conscious cat. J Pharmacol Methods. 1978;1(1):61

–6.


41.

Kubota Y, Umegaki K, Kagota S, Tanaka N, Nakamura K, Kunitomo M, et al.

Evaluation of blood pressure measured by tail-cuff methods (without heating)

in spontaneously hypertensive rats. Biol Pharm Bull. 2006;29(8):1756

–8.

42.


Naoum PC. Eletroforese: técnicas e diagnósticos. 1st ed. São Paulo: Editora

Santos; 1990.

43.

Finney DJ. Statistical method in biological assay. London: Hafner; 1952.



44.

Barraviera B, Lomonte B, Tarkowski A, Hanson LA, Meira DA. Acute-phase

reactions, including cytokines, in patients bitten by Bothrops and Crotalus

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 

Page 11 of 12



snakes in Brazil. J Venom Anim Toxins. 1995;1(1):11

–22. http://www.scielo.br/

scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-79301995000100003.

45.


De Souza RCG. Aspectos clínicos do acidente laquético. 2008. www.

lachesisbrasil.com.br/download/JLC_5D_Final.pdf. Accessed January 25th 2011.

46.

White J. Venomous animals: clinical toxinology. EXS. 2010;100:233



–91.

47.


Taylor L. Cancer Plants: Graviola. 2006. http://www.cancerplants.com/

medicinal_plants/annona_muricata.html. Accessed January 25th 2011.

48.

Nogueira DM, Strufaldi B, Hirata MH, Abdalla DSP, Hirata RDC. Enzimologia.



Métodos de bioquímica clínica: técnica e interpretação. São Paulo: Pancast;

1990. p. 291

–2.

49.


Torres JR, Torres MA, Arroyo-Parejo MA. Coagulation disorders in

bushmaster envenomation. Lancet. 1995;346(8972):449

–50.

50.


Campos VR, Abreu PA, Castro HC, Rodrigues CR, Jordao AK, Ferreira VF, et al.

Synthesis, biological, and theoretical evaluations of new 1, 2, 3-triazoles

against the hemolytic profile of the Lachesis muta snake venom. Bioorg

Med Chem. 2009;17(21):7429

–34. doi:10.1016/j.bmc.2009.09.031.

51.


Rucavado A, Flores-Sanchez E, Franceschi A, Magalhaes A, Gutierrez JM.

Characterization of the local tissue damage induced by LHF-II, a

metalloproteinase with weak hemorrhagic activity isolated from Lachesis

muta muta snake venom. Toxicon. 1999;37(9):1297

–312.

52.


Estevao-Costa MI, Martins MS, Sanchez EF, Diniz CR, Chavez-Olortegui C.

Neutralization of the hemorrhagic activity of Bothrops and Lachesis snake venoms

by a monoclonal antibody against mutalysin-II. Toxicon. 2000;38(1):139

–44.


53.

Gutierrez JM, Rucavado A. Snake venom metalloproteinases: their role in the

pathogenesis of local tissue damage. Biochimie. 2000;82(9-10):841

–50.


54.

Orejuela P, Zavaleta A, Salas M, Marsh N. Thrombin-like activity in snake venoms

from Peruvian Bothrops and Lachesis genera. Toxicon. 1991;29(9):1151

–4.


55.

Fuly AL, Machado AL, Castro P, Abrahao A, Redner P, Lopes UG, et al.

Lysophosphatidylcholine produced by the phospholipase A2 isolated from

Lachesis muta snake venom modulates natural killer activity as a protein kinase

C effector. Toxicon. 2007;50(3):400

–10. doi:10.1016/j.toxicon.2007.04.008.

56.

Damico DC, Bueno LG, Rodrigues-Simioni L, Marangoni S, da Cruz-Hofling



MA, Novello JC. Functional characterization of a basic D49 phospholipase

A2 (LmTX-I) from the venom of the snake Lachesis muta muta (bushmaster).

Toxicon. 2006;47(7):759

–65. doi:10.1016/j.toxicon.2006.02.007.

57.

Nwokocha CR, Owu DU, Gordon A, Thaxter K, McCalla G, Ozolua RI, et al.



Possible mechanisms of action of the hypotensive effect of Annona

muricata (soursop) in normotensive Sprague-Dawley rats. Pharm Biol. 2012;

50(11):1436

–41. doi:10.3109/13880209.2012.684690.

58.

Santhosh MS, Sundaram MS, Sunitha K, Kemparaju K, Girish KS. Viper



venom-induced oxidative stress and activation of inflammatory cytokines: a

therapeutic approach for overlooked issues of snakebite management.

Inflamm Res. 2013;62(7):721

–31. doi:10.1007/s00011-013-0627-y.

59.

Cherifi F, Namane A, Laraba-Djebari F. Isolation, functional characterization



and proteomic identification of CC2-PLA2 from Cerastes cerastes venom: a

basic platelet-aggregation-inhibiting factor. Protein J. 2014;33(1):61

–74.

doi:10.1007/s10930-013-9534-x.



60.

Lima MC, Bitencourt MA, Furtado AA, Oliveira Rocha HA, Oliveira RM, da

Silva-Junior AA, et al. Ipomoea asarifolia neutralizes inflammation induced

by Tityus serrulatus scorpion venom. J Ethnopharmacol. 2014;153(3):890

–5.

doi:10.1016/j.jep.2014.03.060.



61.

Kimura LF, Prezotto-Neto JP, Tavora Bde C, Antoniazzi MM, Knysak I, Gioia

Guizze SP, et al. Local inflammatory reaction induced by Scolopendra

viridicornis centipede venom in mice. Toxicon. 2013;76:239

–46. doi:10.1016/j.

toxicon.2013.10.017.

62.

Setubal SS, Pontes AS, Furtado JL, Xavier CV, Silva FL, Kayano AM, et al.



Action of two phospholipases A2 purified from Bothrops alternatus snake

venom on macrophages. Biochemistry (Mosc). 2013;78(2):194

–203. doi:10.

1134/S0006297913020089.

63.

Stone SF, Isbister GK, Shahmy S, Mohamed F, Abeysinghe C, Karunathilake



H, et al. Immune response to snake envenoming and treatment with antivenom;

complement activation, cytokine production and mast cell degranulation. PLoS

Negl Trop Dis. 2013;7(7):e2326. doi:10.1371/journal.pntd.0002326.

64.


Lima PC, Bordon KC, Pucca MB, Cerni FA, Zoccal KF, Faccioli LH, et al. Partial

purification and functional characterization of Ts19 Frag-I, a novel toxin

from Tityus serrulatus scorpion venom. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis.

2015;21:49. doi:10.1186/s40409-015-0051-6.

65.

Rose-John S. IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6 receptor: importance



for the pro-inflammatory activities of IL-6. Int J Biol Sci. 2012;8(9):1237

–47.


doi:10.7150/ijbs.4989.

66.


Janeway CAJ, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. The production of armed

effector T cells. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease.

5th ed. New York: Garland Science; 2001.

  

We accept pre-submission inquiries

 

  

Our selector tool helps you to find the most relevant journal



•  

We provide round the clock customer support 



•  

Convenient online submission



  

Thorough peer review



•  

Inclusion in PubMed and all major indexing services 



  

Maximum visibility for your research

Submit your manuscript at

www.biomedcentral.com/submit

Submit your next manuscript to BioMed Central 

and we will help you at every step:

Cremonez et al. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases

 (2016) 22:12 



Page 12 of 12

Document Outline

  • Abstract
    • Background
    • Methods
    • Results
    • Conclusion
  • Background
  • Methods
    • Venom
    • Annona muricata L.
    • Experimental groups
    • Biochemical parameters
    • Hematological parameters
    • Hemostatic parameters
    • Blood pressure
    • Inflammatory process
    • Lethality assay
    • Statistical analysis
  • Results and discussion
    • Biochemical parameters
    • Hematological parameters
    • Hemostatic parameters
    • Blood pressure
    • Inflammatory process
      • Serum proteins
      • Interleukin-6
      • Total and relative white blood cells count
    • Lethality assay
  • Conclusion
  • Ethics approval
  • Abbreviations
  • Competing interests
  • Authors’ contributions
  • Acknowledgements
  • Author details
  • References


Yüklə 2,43 Mb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə