From mutations to disease mechanism in rett syndrome, breast cancer, and congenital hypothyroidism



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FROM MUTATIONS TO DISEASE MECHANISM IN RETT SYNDROME,  
BREAST CANCER, AND CONGENITAL HYPOTHYROIDISM 
 
 
 
 
 
by 
brahim Barış 
B.S., Molecular Biology and Genetics, Boğaziçi Univesity, 2000 
M.S., Molecular Biology and Genetics, Boğaziçi Univesity, 2002 
 
 
 
 
 
Submitted to the Institute for Graduate Studies in 
Science and Engineering in partial fulfillment of 
the requirements for the degree of 
Doctor of Philosophy 
 
 
 
 
 
 
 
Graduate Program in Molecular Biology and Genetics 
Boğaziçi University 
2008 
 

 
 
ii 
 
 
FROM MUTATIONS TO DISEASE MECHANISM IN RETT SYNDROME,  
BREAST CANCER, AND CONGENITAL HYPOTHYROIDISM 
 
 
 
 
 
APPROVED BY: 
 
 
 
 
Assoc. Prof. Esra Battaloğlu…………………………..…. 
 
 
 
(Thesis Supervisor) 
 
 
 
 
Prof. A. Nazlı Başak………...……………………………. 
 
 
 
 
Prof. Hande Çağlayan……………………………..……… 
 
                            Prof. Uğur Özbek…………………………………………. 
 
                            Assoc. Prof. Müge Türet Sayar …………………..………. 
 
 
 
 
 
 
 
 
DATE OF APPROVAL: 
10.06.2008 
 
 

 
iii
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
to my family 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
iv 
ACKNOWLEDGEMENTS 
 
 
I would like to express my sincere gratitude to my thesis supervisor Assoc. Prof. Esra 
Battaloğlu for her endless support and intimate encouragement throughout my thesis. 
  
My  appreciation  is  also  extended  to  the  members  of  my  thesis  committee  Prof.  A. 
Nazlı Başak, Prof. Hande Çağlayan, Prof. Uğur Özbek, and Assoc. Prof. Müge Türet Sayar 
for allocating their time to evaluate this work. 
    
I  would  like  to  extend  my  gratitude  to  Boğaziçi  University,  Scientific  Research 
Projects Fund for funding the expenses of my thesis (Project No: 03S101 and 08B103D).  
 
I am grateful to the CMT members Duygu, Çiğdem,  rem, Başak, and Dr. Rezan who 
has  provided  a  warm  environment  in  the  lab.  I  am  also  thankful  to  all  Retina  and  plant 
group  members  for  creating  best  laboratory  environment  ever.  I  am  grateful  to  my  dear 
friends Dr. Birdal Bilir and Dr. Yeşim Özmen for their valuable and wonderful friendship. 
I would to extend my thanks to all my dear friends (Kader,  nanç, Sibel, and Murat) in the 
department.     
 
I wish to thank all of the academic staff, among whom I would like to mention Prof. 
Kuyaş  Buğra,  Assoc.  Prof.  Muge  Türet  Sayar,  and  Assoc.  Prof.  Nesrin  Özeren  for  their 
kind support and encouragement.         
 
I would like to express my great thanks to each of my family member, especially to 
my parents for standing by my side at all time. I am grateful to my wife Tuğba who has 
always  supported,  appreciated  and  encouraged  me  with  his  endless  love  and  patience 
throughout my life. Additionally, I would not complete my thesis work on time without her 
help in DNA sequencing and quantitative analyses.      
 
 
 

 

ABSTRACT 
 
 
FROM MUTATIONS TO DISEASE MECHANISM IN RETT 
SYNDROME, BREAST CANCER, AND CONGENITAL 
HYPOTHYROIDISM 
 
 
Epidemiological  studies  provide  the  correlative  data  to  understand  the  etiology  of 
human  inherited  diseases  and  develop  efficient  genetic  testing  assays.  Additionally,  the 
accumulated data of genetic and epigenetic findings, expression profiling, and proteomics 
allows  disease  diagnosis, to  understand the molecular mechanisms leading to  the  disease 
pathogenesis,  and  to  develop  efficient  therapeutic  approaches.  In  the  framework  of  this 
thesis,  we  have  investigated  genetic  and  epigenetic  changes  and  performed  genotype-
phenotype  correlations  to  unravel  the  molecular  mechanisms  that  lead  to  three  different 
diseases, Rett Syndrome, breast cancer, and congenital hypothyroidism.  
 
The  genetic  basis  of  Rett  Syndrome  (RTT)  was  investigated  in  a  total  of  71  RTT 
patients. A heterogeneous spectrum of disease-causing MECP2 mutations was identified in 
68.2 per cent of a clinically well defined group of cases whereas in only 12.5 per cent of 
the patients referred for differential diagnosis suggesting that this gene does not represent a 
major  cause  of the  disease  among  patients  with  Rett-like  features.  For  the  first  time,  we 
have  identified  gene  duplications  as  causative  mutations  in  female  atypical  RTT  cases. 
Consistent  with  the animal  models,  our  results  support  the  possibility  that  duplication  of 
MECP2 that leads to increased expression might underlie some cases of X-linked delayed-
onset  neurobehavioral  disorders  including  Rett  Syndrome.  Our  results  showed  that  exon 
rearrangements  that  could  not  be  detected  by  standard  techniques  contribute  to  19.3  per 
cent  of  these  MECP2  mutations,  and  should  be considered  in  especially  RTT  variants  in 
order  to  determine  the  actual  significance  of  the  gene  in  the  etiology  of  RTT. 
Genotype/phenotype correlation was performed based on comparison of severity score of 
patients with the type and location of the mutation and the XCI pattern. The results did not 
reveal  a  statistically  significant  correlation,  but,  the  patients  with  exon  deletions  were 

 
vi 
found  to  be  more  severely  affected  than  patients  with  all  other  types  of  mutations  and 
patients with exon duplications to present with severe eye contact problems. Additionally, 
we  have  developed  and  validate  a  novel  multiplexed  amplification  refractory  mutation 
system  (ARMS)  assay  for  identification  of  seven  common  mutations  that  accounts  for 
almost 65 per cent of all MECP2 gene mutations. The validation studies revealed that our 
novel assay is an efficient, reliable, and cost-effective screen for molecular genetic testing 
of patients with RTT. Furthermore, we tested the effect of DNA concentration on reliablity 
and  reproducibility  of  SYBR  green  dye-based  Real  Time  PCR  analysis  to  detect  the 
MECP2 exon rearrangments. The results suggested that Real Time PCR analysis is reliable 
for determination of the exon copy number if the DNA amount is in the range of 1-50 ng. 
 
To our knowledge, there are no known reports investigating the role of methylation 
of hHR23A and hHR23B genes in the tumor tissues. We have characterized the 5' flanking 
region of the hHR23A and hHR23B genes using web-based analysis and investigated the 
involvement  of  methylation  status  of  putative  promoter region  of  hHR23A  and  hHR23B 
genes in breast carcinogenesis. The observations of the hypermethylation of hHR23A gene 
and  the  presence  of  methylated  conserved  motifs  and  transcription  binding  sites  in 
hHR23B gene among the analyzed tumor tissues suggested the involvement of methylation 
of hHR23 genes in the breast carcinogenesis. Investigation of epigenetic changes in tumor 
samples  of  breast  cancer  patients  was  a  pioneering  work  since  available  literature 
implicates its presence only in cell lines. 
 
Since  our  CH  patient  was  the  first case  with  Bamforth  Syndrome  and  suffered  the 
plasma  cholinesterase  deficiency,  the  genetic  mechanisms  leading  to  congenital 
hypothyroidism and prolonged paralysis after mivacurium were investigated. In contrast to 
other reported two patients with TTF2 gene mutation, the presence of thyroid tissue in our 
patient  suggested  further  phenotypic  heterogeneity  associated  with  human  TTF-2 
mutations.  The  functional  study  with  a  collaborative  work  also  helped  to  understand  the 
genetic mechanisms and provided original evidence that implicated differential effects of 
TTF-2  mutations  on  downstream  target  genes  required  for  normal  human  thyroid 
organogenesis.  
 
 

 
vii 
ÖZET 
 
 
RETT SENDROMU, MEME KANSER , VE KONJEN TAL 
H POT RO D ZMDE MUTASYONLARDAN HASTALIK 
MEKAN ZMASINA  
 
 
Epidemiyolojik çalışmalar, insan kalıtsal hastalıklarının etiyolojisinin anlaşılması ve 
genetik testlerin geliştirilmesi için, karşılaştırmalı veriler sağlar. Bunun yanı sıra, genetik 
ve  epigenetik  bulgular,  anlatım  profilleri  ve  proteomiksden  elde  edilen  bilgi  birikimi, 
hastalık  tanısına,  hastalık  patogenezine  neden  olan  moleküler  mekanizmaların 
anlaşılmasına ve doğru töropatik yaklaşımların geliştirilmesine ışık tutar.  Bu tez çalışması 
kapsamında,  üç  farklı  hastalığa,  Rett  Sendromu  (RTT),  meme  kanseri  ve  Konjenital 
Hipotiroidizme  (CH),  neden  olabilecek  mekanizmaları  aydınlatmak  amacıyla  genetik  ve 
epigenetik değişimler incelendi ve genotip-fenotip karşılaştırması yapıldı.  
 
RTT’nin genetik temeli toplam 71 hastada incelendi. Kesin klinik tanı alan hastaların 
yüzde 68.2’sinde heterojen dağılım gösteren ve hastalığa neden olduğu bilinen MECP2 gen 
mutasyonları  tanımlanırken,  ayırımcı tanı  amacıyla  yönlendirilen  hastaların  sadece  yüzde 
12.5’inde  mutasyonların  belirlenmesi,  sözkonusu  genin,  RTT-benzeri  özellikler  gösteren 
hastalar için majör neden olamayacağını düşündürdü. Atipik RTT olgularında, ilk defa, gen 
duplikasyon  mutasyonlarının  hastalığa  neden  olabileceği  gösterildi.  Hayvan 
modellerindeki  bulgularla  örtüşen  sonuçlar,  duplikasyonların,  MECP2  anlatımının 
artmasına  ve  Rett  Sendromunu  da  içeren  bazı  X’e  bağlı  geç-başlangıçlı  nörodavranışsal 
hastalıklara  neden  olabileceği  olasılığını  destekledi.  Sonuçlar,  standart  teknikler  ile 
tanımlanamayan  ekson  düzenlenme  bozukluklarının,  mutasyonların  yüzde  19.3’ünü 
kapsadığını ve sözkonusu genin RTT etiyolojisine gerçek katkısının belirlenmesi açısından 
özellikle RTT varyantlarında araştırılması gerektiğini gösterdi. Hastalık şiddeti skorları ile 
mutasyonların tipi ve konumlarının, ve XCI paterninin karşılaştırılması temeline dayanan 
genotip/fenotip  korelasyonu  gerçekleştirildi.  Bulgular  istatiksel  olarak  anlamlı  bir 
korelasyonu  desteklemese  de  ekson  delesyonu  taşıyan  hastaların  diğer  tüm  mutasyon 

 
viii 
tiplerini  taşıyan  hastalardan  daha  şiddetli  etkilendikleri  ve  ekson  duplikasyonu  olan 
hastalarda şiddetli göz kontağı problemi olduğu bulundu. Ayrıca bilinen tüm MECP2 gen 
mutasyonlarının  yüzde 65’ini oluşturan ve en sık görülen yedi mutasyonun tanımlanması 
amacıyla yeni bir multipleks amplifikasyon refrakter mutasyon tanımlama sistemi (ARMS)  
geliştirildi  ve  geçerliliği  sınandı.  Yeni  metodun  RTT  hastalarının  moleküler  genetik 
analizinde kullanılabilecek elverişli, güvenilir, ve düşük maliyetli bir test olduğu gösterildi. 
Bunun  yanı  sıra,  DNA  konsantrasyonunun,  MECP2  ekson  düzenleme  bozukluklarının 
belirlenmesinde  kullanılan  SYBER  yeşili  boya-bazlı  Gerçek  Zamanlı  PCR  analizinin 
güvenilirliği  ve  tekrarlanabilirliği  üzerindeki  etkisi  irdelendi.  Ayrıca,  ekson  kopya 
sayısının  belirlenmesi  çalışmalarında,  DNA  miktarının  1-50  ng  aralığında  olduğu 
durumlarda Gerçek Zamanlı PCR analizinin güvenilir sonuçlar verdiği gösterildi.  
 
Bilgimiz dahilinde, tümör dokularında hHR23A and hHR23B gen metilasyonlarının 
rolünü  araştıran  raporlar  bulunmamaktadır.  Bu  konuda  katkı  sağlamak  amacıyla  
sözkonusu  genlerin  5’  uçları  web  tabanlı  analiz  kullanılarak  karakterize  edildi  ve  olası 
promotör  bölgelerinin  metilasyon  durumunun  meme  karsinogenezindeki  rolü  incelendi. 
Analiz  edilen  tümör  dokularında  hHR23A  gen  hipermetilasyonunun  gözlenmesi  ve  
hHR23B geninde korunmuş metilasyon motifleri ve transkripsiyon bağlanma bölgelerinde 
metilasyon  bulunması  hHR23  genlerinin  metilasyonunun  meme  kanseri  oluşumunda  yer 
alabileceğini  düşündürdü.  Literatürde  epigenetik  değişimlerin  sadece  hücre  hatlarında 
gösterilmiş olması nedeniyle meme kanseri hastalarının tümör dokularında bu değişimlerin 
araştırılması öncü bir çalışma niteliğindedir. 
 
Tez  kapsamında  incelenen  konjenital  hipotiroidizm  (CH)  hastası  ilk  Bamford 
Sendromlu olgu olması ve plazma kolin esteraz yetersizliği göstermesi nedeniyle CH’e ve 
mivacurim  kullanımı  sonrası  uzun  paralize  neden  olan  mekanizmanın  aydınlatılması 
amacıyla  incelendi.  TTF2  gen  mutasyonu  olduğu  bilinen  diğer  iki  hastanın  aksine 
hastamızda  tiroid  bezinin  varlığının  belirlenmesi  insanda  TTF2  mutasyonları  ile  ilişkili 
fenotipik  heterojenliğin  bilinenden  fazla  olduğunu  ortaya  çıkardı.  Uluslararası  ortak  bir 
çalışma  ile  gerçekleştirilen  işlevsel  analizler  de  genetik  mekanizmanın  anlaşılmasına 
yardımcı  oldu  ve  TTF2  mutasyonlarının  normal  insan  tiroid  organogenezinde  rol  alan 
hedef genler üzerindeki farklı etkilerine işaret eden özgün kanıt sağladı.  
 

 
ix 
TABLE OF CONTENTS 
 
 
ACKNOWLEDGEMENTS .......................................................................................  
iv 
ABSTRACT ..............................................................................................................  

ÖZET  ........................................................................................................................  
vii 
LIST OF FIGURES ...................................................................................................   xiv 
LIST OF TABLES  ....................................................................................................   xix 
LIST OF ABBREVIATIONS ....................................................................................   xxi 
1.  INTRODUCTION ................................................................................................  

1.1.  Epigenetics ....................................................................................................  

1.1.1.  Epigenetics  .........................................................................................  

1.1.2.  DNA Packaging ..................................................................................  

1.1.3.  Epigenetic Modifications ....................................................................  

1.1.3.1.  CpG and non-CpG Methylation .............................................  

1.1.3.2.  Histone Modification .............................................................  

1.2.  Rett Syndrome  ..............................................................................................  

1.2.1.  Historical Background  ........................................................................  

1.2.2.  Clinical and Neuropathological Charecteristics ...................................  

1.2.3.  Phenotypic Variability in RTT ............................................................  

1.2.4.  Genetic Basis of RTT  .........................................................................  

1.2.5.  MECP2 Gene  .....................................................................................  

1.2.6.  CDKL5 Gene  .....................................................................................  
11 
1.2.7.  MECP2 Mutation Profile  ....................................................................  
11 
1.2.8.  MeCP2 Function .................................................................................  
13 
1.2.8.1.  Transcription Regulation and Chromatin Remodeling  ...........  
13 
1.2.8.2.  RNA Splicing ........................................................................  
15 
1.2.9.  Mouse Models of RTT ........................................................................  
17 
1.2.10.  MeCP2 Target Genes and Their Relevance with Disease  ..................  
18 
1.3.  Breast Cancer ................................................................................................  
20 
1.3.1.  Breast Tissue  ......................................................................................  
20 
1.3.2.  Breast Cancer Risk  .............................................................................  
21 
1.3.3.  Breast Carcinogenesis .........................................................................  
24 

 

1.3.4.  DNA Methylation and Genetic Instability ...........................................  
27 
1.3.5.  DNA Repair System  ...........................................................................  
28 
1.3.6.  hHR23 (RAD23) Genes ......................................................................  
31 
1.4.  Congenital Hypothyroidism  ..........................................................................  
35 
1.4.1.  The Thyroid Gland  .............................................................................  
35 
1.4.2.  Congenital Hypothyroidism ................................................................  
36 
1.4.3.  Forkhead Gene Family  .......................................................................  
37 
1.4.4.  Human TTF-2 Gene ............................................................................  
39 
1.4.5.  Thyroid Development and TTF-2  .......................................................  
42 
1.4.6.  TTF-2 Gene Mutations  .......................................................................  
43 
1.4.7.  Plasma Cholinesterase Deficiency  ......................................................  
44 
2.  AIM  .....................................................................................................................  
45 
3.  MATERIALS  .......................................................................................................  
47 
3.1.  Subjects and Samples  ....................................................................................  
47 
3.2.  Chemicals  .....................................................................................................  
47 
3.3.  Fine Chemicals  .............................................................................................  
47 
3.3.1.  Enzymes .............................................................................................  
47 
3.3.2.  Oligonucleotide Primers  .....................................................................  
48 
3.3.3.  DNA Size Marker ...............................................................................  
51 
3.4.  Kits  ...............................................................................................................  
51 
3.5.  Buffers and Solutions  ....................................................................................  
51 
3.5.1.  DNA Extraction from Peripheral Blood  ..............................................  
51 
3.5.2.  Polymerase Chain Reaction (PCR)  .....................................................  
52 
3.5.3.  Agarose Gel Electrophoresis ...............................................................  
52 
3.5.4.  Polyacrylamide Gel Electrophoresis  ...................................................  
53 
3.5.5.  Silver Staining  ....................................................................................  
53 
3.6.  Equipments  ...................................................................................................  
54 
4.  METHODS  ..........................................................................................................  
56 
4.1.  Molecular Basis of Rett Syndrome (RTT)  .....................................................  
56 
4.1.1.  DNA Extraction from Peripheral Blood  ..............................................  
56 
4.1.2.  Quantitative Analysis of the Extracted DNA .......................................  
56 
4.1.3.  Mutation Analysis of MECP2 Gene ....................................................  
57 
4.1.3.1.  Restriction Endonuclease Analysis  ........................................  
57 

 
xi 
4.1.3.2.  Single Strand Conformation Polymorphism ...........................  
57 
4.1.3.3.  Preparation of SSCP Gels ......................................................  
58 
4.1.3.4.  SSCP Electrophoresis ............................................................  
59 
4.1.3.5.  Silver-Staining  ......................................................................  
59 
4.1.4.  DNA Sequence Analysis  ....................................................................  
59 
4.1.5.  Quantitative Real Time PCR ...............................................................  
59 
4.1.6.  Quantitative Fluorescent Multiplex PCR Assay  ..................................  
60 
4.1.7.  X Chromosome Inactivation  ...............................................................  
61 
4.1.7.1.  Preparation of Denaturing Polyacrlamide Gels  ......................  
61 
4.1.7.2.  Electrophoresis of PCR Products ...........................................  
61 
4.1.8.  Clinical Severity Score Analysis .........................................................  
62 
4.1.8.1.  Clinical Severity Score ..........................................................  
62 
4.1.8.2.  Huppke Scoring  ....................................................................  
62 
4.1.8.3.  Statistical Analyses  ...............................................................  
62 
4.1.9.  Multiplexed ARMS-PCR Approach for the Detection of Common    
MECP2
 Mutations  ..............................................................................  
62 
4.1.9.1.  Primer Design  .......................................................................  
62 
4.1.9.2.  PCR Conditions  ....................................................................  
64 
4.1.9.3.  p.R106W Mutation Detection ................................................  
65 
4.1.9.4.  PCR-RFLP and DNA Sequencing  .........................................  
65 
4.1.10.  The Effect of DNA Concentration on Reliability and Reproducibility        
of SYBR Green Dye-based Real Time PCR Analysis to Detect the         
exon Rearrangements Clinical Severity Score Analysis .......................  
65 
4.1.10.1.  Preparation of DNA Samples  ..............................................  
65 
4.1.10.2.  Quantitative Real Time PCR Conditions  .............................  
65 
4.1.10.3.  Quantification  .....................................................................  
66 
4.1.10.4.  Statistical Analysis  ..............................................................  
66 
4.2.  Methylation Analyses of the Putative Promoter Region of hHR23 Genes in    
Breast Tumor Tissues ....................................................................................  
67 
4.2.1.  Non-heating DNA Extraction Protocol  ...............................................  
67 
4.2.2.  Promoter Region Analyses and Primer Design ....................................  
67 
4.2.3.  Bisulfite Modification .........................................................................  
68 
4.2.4.  Amplification and Sequencing of the Bisulfite Modified DNA  ...........  
68 

 
xii
4.3.  Molecular Basis of Congenital Hypothyroidism (CH)  ...................................  
69 
4.3.1.  Mutation Analysis of the TTF2 Gene ..................................................  
69 
4.3.1.1.  Direct DNA Sequencing Analysis  .........................................  
69 
4.3.1.2.  AlwNI Digestion ....................................................................  
70 
4.3.2.  Functional Characterization of p.R102C Mutant TTF2  .......................  
70 
4.3.3.  Mutation Analysis of Butyrylcholinesterase (BChE) Gene ..................  
70 
5.  RESULTS  ............................................................................................................  
72 
5.1.  Molecular Basis of Rett Syndrome  ................................................................  
72 
5.1.1.  Patients ...............................................................................................  
72 
5.1.2.  Mutation Analysis of MECP2 Gene ....................................................  
72 
5.1.3.  Quantitative PCR Analyses .................................................................  
74 
5.1.4.  X Chromosome Inactivation Status .....................................................  
84 
5.1.5.  Genotype–Phenotype Correlations ......................................................  
85 
5.1.6.  Prenatal Diagnosis ..............................................................................  
85 
5.1.7.  Multiplexed ARMS-PCR Approach for the Detection of Common    
MECP2
 Mutations  ..............................................................................  
88 
5.1.7.1.  Assay Optimization ...............................................................  
88 
5.1.7.2.  Validation of the Assay  .........................................................  
88 
5.1.8.  The Effect of DNA Concentration on Reliability and Reproducibility         
of SYBR Green Dye-based Real Time PCR Analysis to Detect the        
Exon Rearrangements  .........................................................................  
90 
5.1.8.1.  Comparison of Quantification Methods  .................................  
91 
5.1.8.2.  Quantification  .......................................................................  
91 
5.2.  Methylation Analyses of the Putative Promoter Region of Rad23 Genes in     
Breast Tumor Tissues ....................................................................................  
96 
5.2.1.  Characterization of the 5' flanking region of the hHR23 Genes  ...........  
96 
5.2.1.1.  hHR23A Gene .......................................................................  
96 
5.2.1.2.  hHR23B Gene .......................................................................  
96 
5.2.2.  Bisulfite Sequencing of hHR23A and hHR23B in paraffin-embedded  
tissues .................................................................................................  
97 
5.2.2.1.  hHR23A ................................................................................  
98 
5.2.2.2.  hHR23B ................................................................................   103 
5.3.  Molecular Basis of Congenital Hypothyroidism  ............................................   110 

 
xiii
5.3.1.  Clinical Features of the Patient  ...........................................................   110 
5.3.2.  Mutation Analysis of the TTF2 Gene ..................................................   110 
5.3.3.  Functional Characterization  ................................................................   113 
5.3.4.  Mutation Analysis of Butyrylcholinesterase (BChE) Gene ..................   113 
5.3.4.1.  PCR-RFLP ............................................................................   114 
6.  DISCUSSION  ......................................................................................................   115 
6.1.  Molecular Basis of Rett Syndrome  ................................................................   115 
6.1.1.  Multiplexed ARMS-PCR Approach for the Detection of Common    
MECP2
 Mutations  ..............................................................................   120 
6.1.2.  The Effect of DNA Concentration on Reliability and Reproducibility         
of SYBR Green Dye-based Real Time PCR Analysis to Detect the        
Exon Rearrangements  .........................................................................   122 
6.2.  Methylation Analyses of the Putative Promoter Region of hHR23 Genes in    
Breast Tumor Tissues ....................................................................................   124 
6.3.  Molecular Basis of Congenital Hypothyroidism  ............................................   130 
6.3.1.  Mutation Analysis of Butyrylcholinesterase (BChE) Gene ..................   132 
7.  CONCLUSION  ....................................................................................................   133 
REFERENCES ..........................................................................................................   134 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

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