Измерение механических и кинетических характеристик изолированных молекул сердечного миозина с помощью оптической ловушки



Yüklə 456 Kb.
tarix23.12.2016
ölçüsü456 Kb.
Измерение механических и кинетических характеристик изолированных молекул сердечного миозина с помощью оптической ловушки

С.Р. Набиев и С.Ю. Бершицкий



Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург

Миозин – это молекулярный биологический мотор, совершающий механическую работу за счет химической энергии гидролиза АТФ. Мышечный миозин II является димером и обеспечивает сокращение скелетных, сердечной и гладких мышц. Каждый мономер миозина состоит из одной тяжелой и двух легких цепей [1]. Каждая тяжелая цепь содержит глобулярный каталитический, или моторный, домен, который и обеспечивает моторную функцию белка.

В сердечной мышце имеется две изоформы миозина, отличающиеся разными типами тяжелых цепей (ТЦ): -ТЦ и -ТЦ [2]. Соотношение этих изоформ зависит от вида, возраста и гормонального состояния животного [3-4]. У мелких взрослых млекопитающих (крыса, мышь) превалирует быстрая изоформа миозина – -ТЦ, называемая мышечным миозином V1. Мышечный миозин V3 – гомодимер -ТЦ, или медленный миозин, преобладает у крупных млекопитающих [5], в том числе и у человека [6].

При большинстве сердечных патологий, вызванных перегрузкой давлением или объемом сердца, обнаруживается сдвиг в составе изоформ миозина [7]. Функциональные свойства сердечных изоформ миозина исследовались, главным образом, на сердечной ткани грызунов. Например, было найдено, что актин-активируемая ATPазная активность V1, выделенного из левого желудочка крысы или кролика, в 2–3 раза выше, чем у V3 [8]. В экспериментах на искусственной подвижной системе (in vitro motility assay) было показано, что скорость ненагруженного движения актиновой нити по поверхности, покрытой изомиозином V1 в 2–3 раза большей, чем для изомиозина V3 [9-10]. Различия в средней изометрической силе между двумя изоформами миозина зависят от вида животных: так у крыс сила, развиваемая этими изоформами, была одинаковой [11], а у кроликов миозин V3 развивает силу в два раза большую, чем миозин V1[10].

Для исследования функциональных свойств одиночных молекул изоформ сердечного миозина мы использовали метод оптической ловушки [12-15]. Схема эксперимента показана на рис. 1.

Чистые изоформы сердечных изомиозинов V1 и V3 получали из левых желудочков сердец гипер- и гипотиреоидных кроликов. Миокард левого желудочка гипертиреоидных кроликов содержит преимущественно изоформу миозина V1, гипотиреоидных – изоформу V3. Для получения чистых изоформ сердечных миозинов кролики подвергались медикаментозной обработке [16]. Использовались стандартные методики получения и хранения сократительных белков [17]. Чистоту изоформ проверяли гель-электрофорезом.



Рис. 1. Концы нити актина длиной в несколько микрон крепятся к 1 мкм полистироловым шарикам, которые удерживаются двумя лучами ИК лазера вблизи покрытой миозином поверхности проточной камеры с фиксированными на ней стеклянными шариками диаметром 2 мкм, образующими пьедесталы на поверхности [13].



Рис. 2. Пример экспериментальной записи отклонений микросферы из центрального положения при кратковременных присоединениях молекулы миозина к актиновой нити. Сигнал записан с частотой 5 кГц.



В экспериментах на оптической ловушке концентрация миозина, загружаемого в экспериментальную ячейку была 3-6 мкг/мл. Все экспериментальные записи получены при концентрации АТФ 5 мкМ. Пример экспериментальной записи показан на рис. 2.

Были измерены «рабочие шаги» двух изоформ сердечного миозина (рис. 3), а также его кине-тические параметры: среднее время, которое изоформы проводят в присоединенном к актину состоянии (рис. 4), а также средняя вероятность пребывания молекулы миозина в присоединенном к актину состоянии.



Рис. 3 Сравнение среднего рабочего шага изоформ сердечного миозина. Шаг для изоформы V1 составил 8±4 нм, для изоформы V3 – 10±2 нм.

Рис. 4 Распределение длительностей событий (присоединенное состояние миозина) для сердечных изоформ миозина. Среднее время нахождения миозина в присоединенном состоянии определяют как обратный показатель экспоненциального распределения. Среднее время присоеди-ненного состояния для изоформы миозина V1 составило 46.2±11 мс, а для изоформы V3 58.6±12 мс.



Среднюю вероятность пребывания молекулы миозина присоединённом к актину состоянии определяли как отношение суммарного времени присоединённого состояния в течение одной записи, к длительности всей записи. Для изоформы V1 средняя вероятность составила 6.9±2.5%, а для изоформы V3 – 10.6±3.9%.

Достоверные отличия были обнаружены только в средней длительности событий, то есть, в среднем времени пребывания молекулы миозина в присоединённом к актиновой нити состоянии. Изоформа V1 находится в этом состоянии меньше времени, чем изоформа V3, что согласуется с данными по измерению скорости движения актиновых нитей по этим изоформам миозина в in vitro экспериментах.



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Weeds A.G. and Lowey S. (1971). J. Mol. Biol. 61: 701—725.

  2. Hoh J.F.Y., Yeoh G.P.S., Thomas M.A.W. and Higgenbottom L. (1979). FEBS Lett. 97: 330—334.

  3. Everett A., Sinha A., Umeda P., Jakovcic S., Rabinowitz M., Zak R. (1984). Biochemistry 23: 1596—1599.

  4. Lompre A.M., Nadal-Ginard B., Mahdavi V. (1984). J. Biol. Chem. 259: 6437—6446.

  5. Hamilton N. and Ianuzzo C.D. (1991). Mol. Cell. Biochem. 106: 133—141.

  6. Mercadier J.J., Bouveret P., Gorza L., Schiaffino S., Clark W.A., Zak R., Swynghedauw B. and Schwartz K. (1983). Circ. Res. 53: 52—62.

  7. Litten R.Z., Martin B.J., Low R.B. and Alpert N.R. (1982). Circ. Res. 50: 856—864.

  8. Pope B., Hoh J.F.Y. and Weeds A. (1980). FEBS Lett. 118: 205—208.

  9. Sata M., Sugiura S., Yamashita H., Momomura, S., Serizawa, T. (1993). Circ. Res. 73: 696–704.

  10. VanBuren, P., Harris, D.E., Norman, R.A., and Warshaw, D.M. (1995). Circ. Res. 77: 439–444.

  11. Malmqvist U.P., Aronsham A. and Lowey S. (2004). Biochemistry 43: 15058–15065.

  12. Ashkin A. (1970). Phys. Rev. Lett. 24:156-159.

  13. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A. (1994). Nature 368:113-118.

  14. Svoboda K., Block S.M. (1994). Cell 77:773-784.

  15. Набиев С.Р., Д.А. Овсянников, Б.Ю. Бершицкий, С.Ю. Бершицкий. (2008). Оптическая ловушка как инструмент для исследования моторных белков. Биофизика, 53.6, с.929-935.

  16. Никитина Л.В., Копылова Г.В., Щепкин Д.В., Кацнельсон Л.Б. (2008). Биохимия 73:178-184.

  17. Margossian, S.S., and Lowey, S. (1982) Meth. Enzymol., 85: 55–71.

Kataloq: upload
upload -> По антикоррупционной работе в поликлинике
upload -> Fərid Zeynalov stomatoloq, bds, dds şəxsi məlumat
upload -> Fakültə İxtisas qrup Kurs fənn tarix baslanma vaxti otaq
upload -> Oitsning ma’nosi – Orttirilgan Immunitet Tanqisligi Sindromi. Bu dahshatli va bedavo kasallik hozirgi zamonning “vabosi” deb yuritiladi
upload -> 4 İstehlakçıların davranışının modelləşdirilməsi Son istehlakçıların davranışının modelləşdirilməsi
upload -> UŞaq anatomiyasi, FİZİologiaysi və GİGİyenasi analizatorlar- duyğU ÜzvləRİ
upload -> Uşağın fərdi psixoloji hazırlığı 20 azn ağız boşluğunun kompleks peşəkar gigiyenası 80 azn
upload -> Мisvak вя онун XXI ясрдя истифадяси
upload -> Klinik protokol Az ərbaycan Respublikas

Yüklə 456 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə