Katı Besiyerinde Toplam Mezofil Aerob Bakteri Sayımı
A12 A12 Listeria monocytogenes
Yüklə 235,92 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Kullanılan Malzeme ve Katkıları
- Campylobacter Analizi (Var/ yok Testi)
- Kullanılan Malzeme, Katkıları ve Diğer Malzeme
- Enterobacter sakazakii Analizi (Var/ yok Testi)
- Katı besiyerinde Bacillus cereus Sayımı
- Katı Besiyerinde Staphylococcus aureus Sayılması
|
A12 A12 Listeria monocytogenes Analizi (Var/ Yok Testi) ISO 11290 revize edilmektedir. Burada www.mikrobiyoloji.org’nin önerdiği yöntem verilmektedir. Kullanılan Malzeme ve Katkıları # Fraser Broth Base (Merck 1.10398) Fraser Listeria Ammonium iron (III) Citrate Supplement (Merck 1.00092) Fraser Listeria Selective Supplement (Merck 1.00093) Chromocult Listeria Selective Agar Base acc. OTTAVIANI and AGOSTI (Merck 1.00427) Listeria Agar Selective Supplement (Merck 1.00432) Listeria Agar Enrichment Supplement (Merck 1.00439) PALCAM Agar (Merck 1.11755) PALCAM Agar Selective Supplement (Merck 1.12122) Oxford Agar (Merck 1.07004) Oxford Agar Selective Supplement (Merck 1.07006)
-Gıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir. Homojenizasyonda blender ya da stomacher kullanılacaksa 25 gram katı gıda 225 mL 1/2 (yarım kuvvette) Fraser Broth besiyeri içinde homojenize edilir. 25 mL sıvı gıda doğrudan bu besiyerine eklenir. Fraser Broth’un yarım konsantrasyonda ilave edilecek olan katkıları, amaca göre homojenizasyon öncesinde ya da sonrasında ilave edilebilir. Gıdada hasar görmüş Listeria olmasından kuşku duyuluyorsa 30 o C’da 4 saat inkübasyona bırakılması ve sonra selektif katkı ilave edilmesi önerilir. -30
o C’da toplam 24 saat inkübasyondan sonra biri “Chromocult Listeria Selective Agar acc. OTTAVIANI and AGOSTI” ile diğeri kullanıcının tercihine bırakılmış bir başka selektif katı besiyerine (Oxford Agar veya PALCAM Agar) sürme yapılır, paralel olarak bu ön zenginleştirme kültüründen selektif katkıları tam konsantrasyonda ilave edilmiş 10 mL Fraser Broth’a 0,1 mL ilave edilir. Bu besiyeri 35-37 o C’da 48 saat inkübe edilir. İnkübasyonun 24 ve 48. saatlerinde biri “Chromocult Listeria Selective Agar acc. OTTAVIANI and AGOSTI” ile diğeri kullanıcının tercihine bırakılmış bir başka selektif katı besiyerine (Oxford Agar veya PALCAM Agar) sürme yapılır -Bütün selektif katı besiyerleri 37 o C’da 24±3 saat, gerekirse 48 saat inkübe edilir. İnkübasyon sıcaklığı analiz raporuna kaydedilir. -Şüpheli koloniler TSYE Agar besiyerine ayrı ayrı sürülür. 37 o C’da 24±3 saat inkübasyon sonunda bu besiyerinde oluşan koloniler tanımlanır. -Hangi aşamadan gelirse gelsin, Listeria monocytogenes belirlenirse analiz raporu “25 g (mL) gıdada Listeria monocytogenes vardır” şeklinde, hangi aşamadan gelirse gelsin, Listeria spp. belirlenir ancak bunun L. monocytogenes olmadığı saptanırsa analiz raporu “25 g (mL) gıdada L. monocytogenes yoktur ancak, Listeria spp. vardır” şeklinde, her 3 aşamada da Listeria türüne rastlanmaz ise analiz raporu “25 g (mL) gıdada Listeria yoktur” şeklinde yazılır. -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar da dâhil olmak üzere inkübatörden çıkan tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/atılır. Not 01: Listeria analizinde Fraser Broth bazal besiyerine ilave edilen katkılar yarım ve tam kuvvette olmak üzere 2 farklı konsantrasyonda ilave edilir. Fraser Broth katkılarının en ekonomik kullanımı için 4 gıda paralel olarak analiz edilir. Bu amaçla 4 adet 225 mL ile 4 adet 10 mL Fraser Broth hazırlanır.
ilavesinden sonra selektif katkı olan şişe (vial) dondurulur, amonyum demir (III) sitrat buzdolabında saklanır. Dondurulmuş katkı, çözüldükten sonra tekrar dondurulmaz.
® Singlepath L'mono Kiti ile Hızlı Tayin 25 g (mL) Gıda örneği, 225 mL 1/2 (yarım kuvvette) Fraser Broth besiyeri içinde homojenize edilir.
İnkübasyon: 28-30 °C'da 21-24 saat. 0,1 mL kültür, 1/1 (tam kuvvette) 10 mL Fraser Broth'a inoküle edilir. İnkübasyon: 28-30 °C'da 21-24 saat. ® Singlepath L'mono kitine 160 µL (Pastör pipeti ile 5 damla) ilave edilir. Kit daha önceden oda sıcaklığına getirilmiş olmalıdır. Kitte (C) şeridi kırmızı olmalıdır. (T) şeridi kırmızı olursa Listeria monocytogenes pozitif, olmazsa Listeria monocytogenes negatif olarak
A13 Singlepath L’mono Kiti ile Hızlı Tayin Listeria monocytogenes, yeryüzünde en fazla sayıda hastalık ve ölümlere yol açan gıda kaynaklı patojenlerden birisidir. Standart kültürel yöntemlerle analizi 4-5 gün sürmektedir. Singlepath L’mono kiti kullanılarak, selektif zenginleştirme sonrasında Listeria monocytogenes varlığı ya da yokluğu belirlenebilir. Singlepath Listeria hızlı test kitinden farklı olarak Singlepath L’mono kiti, sadece Listeria monocytogenes belirlenmesine yöneliktir. Singlepath Listeria kullanımında, flagella antijeninin belirlenmesine yönelik olarak mutlaka 28-30 o C’da inkübasyon gerekli iken, Singlepath L’mono kitinde böyle bir zorunluluk yoktur. Not 01: Test kiti analizden 2 saat önce buzdolabından çıkarılıp, oda sıcaklığına getirilmeli ve alüminyum poşeti açıldıktan sonra 30 dakika içinde kullanılmalıdır. Not 02: Singlepath ® L’mono kitinin, düşük konsantrasyonda Listeria monocytogenes içeren yüksek refakatçi floralı çiğ et ve diğer gıdalarda Listeria monocytogenes’i tespit edemediği gösterilmiştir. Etik kurallar ölçüsünde verilen bu açık bildirgenin, kullanıcı tarafından benzer amaçla kullanılan farklı markalar için de sorgulanması önerilir.
Fraser Broth Base (Merck 1.10398) Fraser Listeria Ammonium iron (III) Citrate Supplement (Merck 1.00092) Fraser Listeria Selective Supplement (Merck 1.00093) Analiz -Gıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir. Homojenizasyonda blender ya da stomacher kullanılacaksa 25 gram katı gıda 225 mL 1/2 (yarım kuvvette) Fraser Broth besiyeri içinde homojenize edilir. 25 mL sıvı gıda doğrudan bu besiyerine eklenir. Fraser Broth’un yarım konsantrasyonda ilave edilecek olan katkıları, amaca göre homojenizasyon öncesinde ya da sonrasında ilave edilebilir. Gıdada hasar görmüş Listeria monocytogenes olmasından kuşku duyuluyorsa 30 o C’da 4 saat inkübasyona bırakılması ve sonra selektif katkı ilave edilmesi önerilir. -İnkübasyondan sonra 10 mL 1/1 kuvvetindeki Fraser Broth’a ön zenginleştirme kültüründen 0,1 mL eklenir ve inkübasyon 28-30 ya da 35-37 o C’da 21-24 saat olarak yapılır. -Kullanıcının tercihine göre diğer Listeria zenginleştirme besiyerleri de kullanılabilir. Her koşulda ön zenginleştirme ve selektif zenginleştirme yapılması önerilmektedir. -Selektif zenginleştirme sonrasında bu kültürden uygun bir tüpe (tercihen polipropilen) 1-2 mL alınıp, kaynar su banyosunda 15 dakika tutulur ve oda sıcaklığına geldiğinde 160 mL (Pastör pipeti ile 5 damla) Singlepath L'mono kitine uygulanır. 20 dakika sonunda kontrol "C" penceresinde kırmızı şerit oluşmalıdır. Bu, çizgi kitin doğru çalıştığını kanıtlar. Test "T" penceresinde de kırmızı şerit görülmesi analiz edilen kültürde, dolayısı ile gıdada Listeria monocytogenes olduğunu gösterir. Pozitif sonuç alındığında selektif zenginleştirme kültüründen standart bir katı besiyerine sürme yapılıp sonucun doğrulanması önerilir. Tersine olarak, bu test kiti ile negatif sonuç alınırsa analize devam etmenin gereği yoktur. Bu yöntemde toplam analiz süresi 42 saat 35 dakikadır. -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar ve Singlepath L’mono test sonucu negatif olan kitler de dâhil olmak üzere inkübatörden çıkan ve kullanılmış tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/ atılır.
Campylobacter Analizi (Var/ yok Testi) Besiyeri önce 37 °C'da 4 saat, sonra 41,5 °C'da 42-44 saat süre ile inkübasyona bırakılır İnkübasyon: 41,5 °C'da 24-48 saat; mikroaerofilik Çalışmada kullanılan bütün malzeme otoklavlandıktan sonra yıkanır/atılır. 25 g (mL) gıda, 225 mL Bolton Broth ile homojenize edilir. mCCDA ve Campylobacter Selective Agar besiyerlerine sürme yapılır mCCDA besiyerinde grimsi, düz, ıslak görünümlü ve yayılma eğiliminde olan koloniler ile Campylobacter Selective Agar besiyerinde gelişen gri-kahverengi berrak zonlu koloniler C. jejuni ya da C. coli olarak değerlendirilir
A14 Campylobacter Analizi (Var/ yok Testi) Campylobacter jejuni, Salmonella ile birlikte kayda geçmiş en fazla hastalığa yol açan gıda kaynaklı patojenlerdir. ISO 10272’ye göre analizi temel olarak 41,5 o C’da zenginleştirme, selektif katı besiyerine sürme şeklinde yapılan var/ yok testidir. Campylobacter analizi yapılacak gıda dondurulmamalı, gerekli ise buzdolabı sıcaklığında tutulmalı, olanaklar ölçüsünde hızla analiz yapılmalıdır. Aksi halde sahte negatif sonuçlar alınabilir.
Bolton Selective Enrichment Broth (Merck 1.00068) Bolton Broth Selective Supplement (Merck 1.00069) CCDA, modified (mCCDA; Merck 1.00070) CCDA Selective Supplement (Merck 1.00071) Campylobacter Selective Agar (Merck 1.02248) Campylobacter Selective Supplement (Merck 1.02249) Mikroaerofilik İnkübasyon Gereçleri Analiz -Gıda örneği mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir, 25 g (mL) alınıp, 250 mL vida kapaklı cam şişede hazırlanmış 225 mL Bolton Broth besiyerine ilave edilir. Campylobacter mikroaerofilik bir bakteri olduğu için homojenizasyonu sırasında aşırı oksijen teması bakteriye zarar vererek sahte negatif sonuçlara neden olur. Bu nedenle blender kullanılmasından olabildiğince kaçınılmalıdır. Eğer vida kapaklı cam şişe yerine erlen kullanılıyor ise inkübasyon mikroaerofil koşullarda yapılmalıdır. -Besiyeri önce 37 o C’da 4 saat, sonra 41,5 o C’da 42-44 saat süre ile inkübasyona bırakılır. Bu süre sonunda mCCDA ve Campylobacter Selective Agar besiyerlerine sürme yapılır ve Petri kutuları 41,5 o C’da 24-48 saat süre yine mikroaerofilik ortamda inkübe edilir. İnkübasyonun ilk 24 saatinde Petri kutuları incelenir, tipik koloni görülmemesi durumunda inkübasyona 24 saat daha devam edilir. -mCCDA besiyerinde grimsi, düz, ıslak görünümlü ve yayılma eğiliminde olan koloniler ile Campylobacter Selective Agar besiyerinde gelişen gri-kahverengi berrak zonlu koloniler C. jejuni ya da C. coli olarak değerlendirilir. -Tipik Campylobacter kolonilerine rastlanması halinde “25 g (mL) örnekte Campylobacter jejuni ve/ veya C. coli vardır” şeklinde standart rapor verilir. -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar da dahil olmak üzere inkübatörden çıkan tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/ atılır.
® Singlepath Campylobacter Kiti ile Hızlı Tayin 25 g yada 25 mL gıda 225 Bolton Broth (Merck 1.00068 ve Merk 1.00069) besiyerine ilave edilir. Gerekirse homojenizasyon yapılır. A15 A15 Singlepath Campylobacter Kiti ile Hızlı Tayin Not: Test kiti analizden 2 saat önce buzdolabından çıkarılıp, oda sıcaklığına getirilmeli ve alüminyum poşeti açıldıktan sonra 30 dakika içinde kullanılmalıdır. Kullanılan Malzeme # Bolton Selective Enrichment Broth (Merck 1.00068) Bolton Broth Selective Supplement (Merck 1.00069) Singlepath Campylobacter (Merck 1.04143) Anaerobik İnkübasyon Gereçleri # # Analiz # # -Gıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir. Gıdada hasar görmüş Campylobacter olmasından endişe ediliyorsa, besiyeri önce 37 o C’da 4 saat süre ile mikroaerofilik ortamda inkübe edilir, sonra inkübasyon sıcaklığı 41,5 o C’a çıkarılıp inkübasyona 44 saat daha devam edilir. Eğer vida kapaklı cam şişe yerine erlen kullanılıyor ise inkübasyon mikroaerofilik koşullarda yapılmalıdır. # -Toplam 48 saat süren inkübasyondan sonra bu kültürden cam bir tüpe 1-2 mL alınıp, kaynar su banyosunda 15 dakika tutulur ve oda sıcaklığına geldiğinde 160 mL (Pastör pipeti ile 5 damla) Singlepath Campylobacter kitine uygulanır. # -20 dakika sonunda kontrol “C” penceresinde kırmızı şerit oluşmalıdır. Test “T” penceresinde de kırmızı şerit görülmesi analiz edilen kültürde Campylobacter olduğunu gösterir. Pozitif sonuçta selektif bir agara sürme yapılıp sonucun doğrulanması önerilir. Negatif sonuçta analize devam etmenin gereği yoktur. # -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar ve Singlepath Campylobacter test sonucu negatif olan kitler de dâhil olmak üzere inkübatörden çıkan ve kullanılmış tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/ atılır. Enterobacter sakazakii Analizi (Var/ yok Testi) İnkübasyon: 37 °C'da 24 saat İnkübasyon: 44 °C'da 24 saat Çalışmada kullanılan bütün malzeme otoklavlandıktan sonra yıkanır/atılır. 25 g (mL) gıda, 225 mL LST ya da EE Broth besiyerinde homojenize edilir. ® Chromocult Enterobacter sakazakii besiyerine sürme yapılır İnkübasyon sonunda Enterobacter sakazakii kolonileri mavi-yeşil renkli görülür.
A16 Enterobacter sakazakii Analizi (Var/ yok Testi) Bakterinin ismi, Cronobacter sakazakii olarak değiştirilmiştir. Not 01: Bu analizde inkübasyon sıcaklığı kritiktir. 45 o C üzerinde Enterobacter sakazakii gelişmez. 43 o C altında ise refakatçi bakteri baskılaması ortadan kalkar ve gelişen refakatçi flora, hedef bakterinin fark edilmesini maskeleyebilir. Kullanılan Malzeme Buffered Peptone Water (Merck 1.07228) Lauryl Sulfate Broth; LST (Merck 1.10266) Enterobacteriaceae Enrichment Broth acc. to MOSSEL; EE Broth (Merck 1.05394) Chromocult® Enterobacter sakazakii (Merck 1.00873)
-Gıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir. Katı gıda tartılır ve zenginleştirme besiyerinde homojenize edilir. Sıvı gıda doğrudan analize alınabilir. -Zenginleştirme için LST ya da EE Broth kullanılabilir. Bu besiyerleri standart olarak 37 o C’da 24±2 saat inkübe edilir. -Bazı standartlarda Buffered Pepton Water ortamında selektif olmayan ön zenginleştirmeden sonra LST ya da EE Broth’a geçiş önerilmektedir. -Zenginleştirme sonrası 1 öze kültür Chromocult® Enterobacter sakazakii besiyerine sürülür ve Petri kutusu 44±1 o C’da 24±2 saat inkübasyona bırakılır. -İnkübasyon sonunda mavi-yeşil renkli koloniler Enterobacter sakazakii olarak değerlendirilir. Refakatçi flora renksiz koloniler oluşturur. -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar da dahil olmak üzere inkübatörden çıkan tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/atılır. Katı besiyerinde Bacillus cereus Sayımı 80 °C'da 5 dakikalık pastörizasyon uygulanıp hızla soğutulur. İnkübasyon: 28 °C'da 24-48 saat Çalışmada kullanılan bütün malzeme otoklavlandıktan sonra yıkanır/atılır. 10 g (mL), gıda 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile homojenize edilir. Süt ve ürünlerinde tercihen ¼ Ringer çözeltisi kullanılır. Sıvı gıdalar doğrudan analize alınabilir. 1 mL homojenizat 3 standart Petri kutusundaki MYP Agar (Cereus Selective Agar acc. to Mossel) besiyerine dağıtılır. Alternatif olarak 14 cm çaplı büyük Petri kutusu da kullanılabilir Yaygın, kuru, pembe-menekşe merkezli ve etrafında yoğun bir presipitat olan koloniler Bacillus cereus olarak sayılır 80
A17 Katı besiyerinde Bacillus cereus Sayımı Bacillus cereus, toprak kökenli bakteri olup, gıda zehirlenmelerine yol açar. Baharat gibi gıdalarda sınırlı sayıda bulunmasına izin verilebilir. UHT yöntemi ile üretilen uzun ömürlü sütlerde de bozulmaya neden olur.
koloniler verir. Bu kolonilerin standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında B. cereus olup olmadıklarının belirlenmesi oldukça zordur. Bununla beraber, B. anthracis, B. thuringiensis ve B. mycoides gıdaların günlük analizinde oldukça nadir olarak ortaya çıkarlar. Bu nedenle tipik koloniler B. cereus olarak kabul edilir.
homojenizat (ya da örnek sıvı ise doğrudan örneğin kendisi) 80 o C’da 5 dakika pastörize edilir. Analiz, standart olarak bu şekilde yapılır. Pastörizasyon sonrasında sayılacak olanlar sadece, pastörizasyon öncesi spor oluşturmuş olan bakterilerdir. Vejetatif formdaki B. cereus hücreleri pastörizasyon işlemi ile öleceği için sayılamaz. Dolayısı ile analiz sonucu toplam B. cereus sayısını değil, spor oluşturmuş olanların sayısını verecektir. Kullanılan Malzeme ve Katkıları Maximum Recovery Diluent (Merck 1.12535) ¼ Ringer Çözeltisi (Merck 1.15525) MYP Agar (Cereus Selective Agar acc. to Mossel; Merck 1.05267) Bacillus cereus Selective Supplement (Merck 1.09875) Egg-yolk Emulsion (Merck 1.03784) Analiz -Gıda örneği, mikrobiyolojik analiz kurallarına uyularak laboratuvara getirilir. Katı gıda tartılır ve homojenize edilir. Sıvı gıda doğrudan analize alınabilir. -Homojenizasyon ve/ veya gerekli ise seyreltmeler için, süt ve ürünlerinde tercihen ¼ Ringer çözeltisi, diğer gıdalarda Maximum Recovery Diluent kullanılır. -Tüp içindeki örnek, kaynar su banyosuna daldırılır, aynı çeper kalınlığındaki tüpte bulunan bir diğer örneğe termometre yerleştirilir. -Kontrol tüpündeki sıcaklık 80 o C’a eriştiğinde her iki tüp su banyosundan çıkarılır, kontrol tüpünün sıcaklığı kontrol edilerek sıcaklık 79 o C’a düştüğünde tekrar kaynar su banyosuna beraberce daldırılırlar. Bu şekilde 5 dakika tutulduktan sonra test tüpü oda sıcaklığındaki su banyosuna alınır ve soğutulur. Pek çok uluslararası standartta soğutmanın buz banyosu içinde ve hızla yapılması gerektiğine dikkat çekilir. Soğutma şekli ilgili talimatta yazılmalıdır. -Gerekli ise seyreltmeler bu aşamada (pastörizasyondan sonra) yapılır. -Beklenen ya da hedef alınan sayıya göre, sıvı örnekten ya da homojenizattan ve/ veya uygun seyrelti(ler) den yayma ya da dökme yöntemi ile ekim yapılır. -İnkübasyon sonunda (28 o C’da 48 saat) MYP Agar besiyerinde yaygın, kuru, pembe-menekşe merkezli ve etrafında yoğun bir presipitat olan koloniler Bacillus cereus olarak sayılır ve standart şekilde hesaplanarak, sonuç kob/g (mL) olarak verilir. -Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar da dâhil olmak üzere inkübatörden çıkan tüm malzeme sterilize edildikten sonra yıkanır/ atılır. Katı Besiyerinde Staphylococcus aureus Sayılması 1 mL homojenizat 3 standart Petri kutusundaki Baird-Parker Agar besiyerine dağıtılır. Alternatif olarak 14 cm çaplı büyük Petri kutusu da kullanılabilir. Etrafı saydam zonlu 1-1,5 mm çaplı siyah parlak koloniler S. aureus olarak sayılır
Çalışmada kullanılan bütün malzeme otoklavlandıktan sonra yıkanır/atılır. 10 g (mL), gıda 90 mL MRD (Merck 1.12535) ile homojenize edilir. süt ve ürünlerinde tercihen ¼ Ringer çözeltisi kullanılır. Sıvı gıdalar doğrudan analize alınabilir. İnkübasyon: 37 °C'da 24 saat Şüpheli kolonilere koagülaz testi uygulanır. A18 A18 Katı Besiyerinde Staphylococcus aureus Sayılması S. aureus, patojen bir bakteridir ve intoksikasyon tipi gıda zehirlenmelerine neden olur. İşlem görmüş gıdalarda bulunmasına izin verilmez ancak, çiğ et gibi gıdalarda az sayıda bulunmasına izin verilebilir. Buna göre arama ya da sayma yöntemi kullanılır. Gıdadaki varlığı her zaman zehirlenme yapacağı anlamına gelmez. Toksin oluşturması gıdanın asitliği, kuru maddesi vb. faktörlere bağlıdır. ISO 6888’e göre gıdalarda S. aureus sayısı katı besiyerinde standart kültürel yöntemle belirlenir.
o C’a soğutulur ve yumurta sarısı-tellurtit emülsiyonu bu aşamada ilave edilir. Yumurta sarısı-tellurit emülsiyonu buzdolabında saklanması gereken bir katkıdır. Buzdolabından çıkarıldığı gibi bazal besiyerine eklenirse yer yer jelleşmeler olur. Bu emülsiyon önceden buzdolabından çıkartılıp, oda sıcaklığında iken bazal besiyerine eklenmelidir.
Yüklə 235,92 Kb. Dostları ilə paylaş:
|