Ocorrente e recombinante, empregando

i 
 
 
 
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO 
POR Zymomonas mobilis NATURALMENTE 
OCORRENTE E RECOMBINANTE, EMPREGANDO 
BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA 
 
 
D
D
A
A
N
N
I
I
E
E
L
L
L
L
E
E
 
 
D
D
A
A
 
 
S
S
I
I
L
L
V
V
E
E
I
I
R
R
A
A
 
 
D
D
O
O
S
S
 
 
S
S
A
A
N
N
T
T
O
O
S
S
 
 
 
O
RIENTADOR
: 
Prof. Nei Pereira Jr,
 
PhD 
 
 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Escola de Química 
2012 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Escola de Química 
Programa de Pós-Graduação em  
Tecnologia de Processos Químicos e 
Bioquímicos 
 
 

 
ii 
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR 
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E 
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA 
LIGNOCELULÓSICA 
 
 
 
 
D
D
A
A
N
N
I
I
E
E
L
L
L
L
E
E
 
 
D
D
A
A
 
 
S
S
I
I
L
L
V
V
E
E
I
I
R
R
A
A
 
 
D
D
O
O
S
S
 
 
S
S
A
A
N
N
T
T
O
O
S
S
 
 
 
 
 
 
 
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação 
em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos para a 
Obtenção do Grau de Doutor em Ciências (DSc) 
 
 
 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Escola de Química 
2012 

 
iii 
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR 
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E 
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
Tese  submetida  ao  Programa  de  Pós-graduação  em  Tecnologia  de  Processos 
Químicos  e  Bioquímicos  da  Escola  de  Química  da  Universidade  Federal  do  Rio  de 
Janeiro,  como  parte  dos  requisitos  necessários  à  obtenção  do  grau  de  Doutor  em 
Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.  
 
Banca examinadora: 
Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ) 
 (Orientador-Presidente) 
 
Prof
a
. Janete Magali de Araújo,  DSc  (CCB/ UFPE) 
 
Prof. Antonio Carlos Augusto da Costa, DSc  (IQ/ UFRJ) 
 
Prof
a
. Eliana Flávia Camporese Sérvulo, DSc  (EQ/UFRJ) 
 
Prof. Rodrigo Pires do Nascimento, DSc  (EQ/UFRJ) 
 
Prof
a
. Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS) 
 
 
EQ/UFRJ 2012 

 
iv 
 
 
 
 
F
IC HA  C AT ALOGR ÁF IC A
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Santos, Danielle da Silveira 
dos
. 
Produção  de  etanol  de  segunda  geração  por  Zymomonas  mobilis 
naturalmente 
ocorrente 
e 
recombinante, 
empregando 
biomassa 
lignocelulósica/ Danielle da Silveira 
dos
 Santos. -- Rio de Janeiro, 2012. 
Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e 
Bioquímicos) 
–
 Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de 
Química, Rio de Janeiro, 2012. 
218 p.: il.  
 
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.  
1.   Zymomonas mobilis. 2.Fermentação. 3.Bagaço de cana-de-açúcar.            
4. Engenharia genética. 5. Teses 
 
I.  Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
Escola de Química, Pós-Graduação em Tecnologia de Processos 
Químicos e Bioquímicos. III. Título.  

 
v 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A meus pais, Maria Ignês e José Fernando, à minha irmã, Vanessa, ao meu 
afilhado, João Guilherme, aos meus avós e ao meu amor, Bruno.  
Dedico esta Tese a vocês, que são tudo em minha vida.   
 
 

 
vi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“A cada dia que vivo, mais me 
convenço de que o desperdício da 
vida está no amor que não 
damos, nas forças que não 
usamos, na prudência egoísta 
que nada arrisca.” 
 
                                        Carlos Drummond de Andrade 
 

 
vii 
AGRADECIMENTO ESPECIAL  

  Ao  querido  professor  Nei  Pereira  Jr.,  obrigada  pela  orientação  exemplar, 
pautada por um elevado e rigoroso nível científico, contribuindo para enriquecer 
todas  as  etapas  subjacentes  ao  processo  de  investigação.  Obrigada  pela 
confiança depositada,  pela  oportunidade  oferecida,  pela  partilha  do  saber, por 
estimular  o  meu  interesse  pelo  conhecimento,  pelo  acompanhamento 
incansável  nesta  jornada,  me  encorajando  para  que  eu  prosseguisse  e 
concluísse  este  trabalho.  Orgulho-me  de  ter  desenvolvido  este  estudo  sob  a 
sua  orientação.  Acima  de  tudo,  obrigada  por  ter  sido  responsável  pelo  meu 
amadurecimento  profissional.  Jamais  teria  ido  tão  longe  sem  o  seu  auxílio, 
amizade e dedicação. Meu profundo respeito, admiração e gratidão.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
viii 
AGRADECIMENTOS 
 

  Agradeço  principalmente  ao  meu  amado  Deus,  que  com  seu  amor 
incondicional e sua imensa graça tem  me dado forças para enfrentar todos os 
obstáculos da vida, permitido que eu realize todos os meus sonhos.  

  À  minha  família,  da  qual  sempre  tive  apoio  total  e  um  amor  incondicional: 
meus pais, José Fernando e Maria Ignês; minha irmã, Vanessa; meu sobrinho, 
João  Guilherme;  meu  cunhado,  Mario;  meus  avós,  Geraldo,  Isaura,  Maria 
Clara,  Luís  Fernando,  Neide  e  Nyldo,  que  sempre  estiveram  presentes  em 
minha  vida,  me  dando  apoio  e  me  erguendo  em  qualquer  situação;  a  meus 
primos  e  tios,  em  especial,  Walter  Silveira,  pelo  auxílio  e  carinho.  Minha 
felicidade não se realizaria sem a participação de vocês. 

  A  meu  futuro  marido,  Bruno  Moreira  Martins,  por  ser  o  meu  porto  seguro  e 
anjo da guarda em todos os aspectos da minha vida, por todo amor, dedicação, 
carinho  e  conforto  em  todos  os  momentos.  Com  toda  a  certeza,  se  não 
estivesse do seu lado não seria tão feliz e completa. Agradeço também à sua 
família, pela convivência agradável e carinho.  

  Ao  Professor  Dr.  Fernando  Araripe  Torres  (IB,  UnB),  pela  dedicação, 
profissionalismo  e  grande  colaboração  depositada;  assim  como  ao  seu  grupo 
de pesquisa; em especial, Viviane. Meus sinceros agradecimentos.  

  A todos os integrantes do Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos 
pelo  auxílio  e  companheirismo,  tornando  o  laboratório  um  lugar  agradável: 
Liliana,  Patrycia,  Sabrina  Dias,  Mariana  Ruiz,  Vanessa  Rocha,  Fabrício,  Luís 
André,  Paulo,  Mariana  Faber,  Mônica,  Camylle,  Leonard,  Beatriz,  Guilherme, 
Vanessa, Renata, Lys,  Ludmilla, Sabrina Mesquita, Mariana Mello, Elisabete e 
Eleandro,  Wilma,  Marcio,  Carla;  ao  Jorge,  pela  colaboração  e  atenção  em 
todos os momentos.  

  Às queridas alunas, Aghata e Jéssica, pelo auxílio, amizade e carinho.  

 
ix 

  Ao  Luís  Carlos  por  ter  sido  fundamental  na  elaboração  da  minha  tese,  por 
todo apoio, estímulo, amizade, dedicação e confiança a mim depositadas. Não 
tenho palavras que descrevam tamanha gratidão.   

  À  Carolina  e  Maeda,  pela  colaboração  neste  trabalho,  auxílio,  amizade  e 
companheirismo. 

  Ao  meu  melhor  amigo,  Elcio,  pela  presença  em  todos  os  momentos, 
contribuindo  efetivamente  para  formulação  de  minha  tese,  por  todo  carinho, 
dedicação e amizade depositados.  

  À  Dona  Edina,  que  já  faz  parte  da  família,  por  todo  o  carinho,  amor  e 
companheirismo. 

  Às  minhas  melhores  amigas,  Bárbara,  Ticiane,  Regianne,  Alessandra, 
Daiane,  Camila  e  à  nova  amiga,  Janaína,  pelo  companheirismo,  carinho, 
momentos de descontração, desabafo e pela amizade sincera.  

  Ao  Professor  Dr.  Donato  Aranda,  pelo  auxílio  e  amizade,  assim  como  os 
integrantes  de  seu  grupo  de  pesquisa;  em  especial  às  queridas  amigas,  Ana 
Paula,  Andréia,  Mariana  Barreto  e  Laiza;  e  ao  amigo  Dower,  pelo 
companheirismo e confiança depositados.  

  Ao  Programa  de  Pós-graduação  em  Tecnologia  de  Processos  Químicos  e 
Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ; ao  Departamento de Engenharia 
Bioquímica,  especialmente  aos  funcionários  da  Secretaria  de  Pós-graduação 
da Escola de Química, pela agradável recepção e convivência diária. 

  À PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro. 

 
Aos  membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliação deste 
trabalho.
 
"A glória da amizade não é só a mão estendida, o sorriso carinhoso 
nem mesmo a companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você 
descobre que alguém acredita e confia em você”. 
Anônimo. 
 
E a todos que participaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho, 
 
Muito Obrigada! 

 
x 
RESUMO 
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produção de etanol de segunda geração por 
Zymomonas  mobilis  naturalmente  ocorrente  e  recombinante  empregando 
biomassa  lignocelulósica.  Orientador:  Nei  Pereira  Jr.  Escola  de  Química- 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.  
O  desenvolvimento  de  tecnologias  para  produção  de  bioetanol  a  partir  de  materiais 
lignocelulósicos mostra-se promissor devido às várias vantagens da utilização de biomassa 
residual  para  produção  de  etanol  de  segunda  geração.  Dessa  forma,  o  atual  cenário  dos 
biocombustíveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnológica, pois o bagaço 
de  cana-de-açúcar,  principal  material  lignocelulósico  em  países  tropicais,  possui  enorme 
potencial  energético.  A  bactéria  Zymomonas  mobilis  mostrou-se  extremamente  atraente 
para a produção de etanol combustível de segunda geração a partir da glicose proveniente 
da  fração  celulósica,  em  virtude  de  sua  elevada  capacidade  de  absorção,  resultando  em 
altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de 
metabolizar  outro  açúcar  importante  encontrado  nas  biomassas  de  composição 
lignocelulósica,  a  xilose  oriunda  da  fração  hemicelulósica.  Visando  avançar  neste  tema  e 
tornar  a  produção  de  etanol  de  segunda  geração  mais  eficiente,  recomendou-se  a 
incorporação  de  técnicas  da  Biologia  Molecular,  a  fim  de  dotar  as  linhagens  utilizadas  no 
presente estudo capazes de fermentar também a xilose. Com isto, motivados com a procura 
de  novas alternativas  energéticas  e  industriais,  nas  quais diferentes  derivados  de  petróleo 
sejam  substituídos,  avançar-se-ia  para  a  concepção  SSCF.  Desta  forma,  o  objetivo  deste 
trabalho  consiste  em  avaliar  a  produção  de  etanol  a  partir  do  bagaço  de  cana  por 
Zymomonas  mobilis,  utilizando-se  a  estratégia  de  processo  SSF  (hidrólise  enzimática  e 
fermentação  simultâneas)  e  SSCF  (hidrólise  enzimática  e  co-fermentação  simultâneas)  a 
partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir 
o fácil acesso das enzimas do complexo celulásico até a celulose, o bagaço passou por um 
pré-tratamento ácido  para  extração dos  açúcares  da fração  hemicelulósica,  resultando  em 
um  resíduo  sólido  denominado  celulignina.  Em  seguida,  foi  realizado  um  pré-tratamento 
alcalino,  que  promove  sua  deslignificação  parcial.  Inicialmente,  a  celulose  presente  na 
celulignina  parcialmente  deslignificada  foi  pré-hidrolisada  com  enzimas  de  um  complexo 
enzimático comercial denominado celulases, permitindo a conversão da celulose a açúcares 
fermentáveis, nas temperaturas de 50°C, durante 12 horas. No que tange à transformação 
genética aplicada em Z. mobilis, o plasmídio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente, 
contendo os genes relacionados à origem de replicação de E. coli e de Z. mobilis, os genes 
que  codificam as  enzimas  XI,  XK,  TAL e  TKL,  bem  como a  marca  de  seleção  tetraciclina. 
Posteriormente  a  essa  etapa,  a  adaptação  metabólica  foi  empregada,  seguida  de 
planejamentos  experimentais  de  superfície  de  resposta;  os  quais  avaliaram  a  adição  de 
glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentrações, bem como de hidrolisado 
hemicelulósico  em  diferentes  proporções.  As  condições  ótimas  para  o  processo  SSF 
utilizando-se  a  bactéria  Zymomonas  mobilis  nativa,  empregando  o  bagaço  de  cana  pré-
tratado e o resíduo da indústria de celulose, respectivamente, foram: teor de sólido, 30% e 
20%; carga enzimática, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentração celular, 4 g/L e  1,59% (v/v); 
atingindo  a  concentração  final  de  etanol  de  60  g/L  e  58  g/L;  avaliando  a  adição  dos 
nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L;  KH
2
PO
4
, 
2,5 e 1,25 g/L; (NH
4
)
2
SO
4
, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO
4
, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados 
alcançados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcançado 25 g/L de etanol, constatando-
se  que  cerca  de  50%  desta pentose foi  convertida ao produto, a partir  do processo  SSCF 
pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de sólidos, 20,5%  
de  hidrolisado  hemicelulósico,  10  mg/L  de  tetraciclina,  carga  enzimática  de  25  FPU/g  de 
celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcançados com o presente trabalho 
foram satisfatórios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas. 

 
xi 
ABSTRACT 
 
SANTOS,  Danielle  da  Silveira  dos.
 
Second  generation  ethanol  production  by 
native 
and 
recombinant 
strain  of 
Zymomonas 
mobilis  employing 
lignocellulosic  biomass.  Supervisor:  Nei  Pereira  Jr.  School  of  Chemistry  of 
Federal University of Rio de Janeiro 
–
 Brazil, 2012.  
During  the  past  decades,  considerable  efforts  have  been  made  to  utilize  agricultural  and 
forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel. 
Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w% 
lignin,  represents  the  main  lignocellulosic  material  to  be  considered  by  most  of  tropical 
countries.  The  bacterium  Zymomonas  mobilis  possesses  technological  advantages  which 
make  of  it  a  potential  fermentative  agent  for  industrial  ethanol  production:  fast  glucose 
uptake,  high  ethanol  tolerance  and  production  yields,  besides  the  ability  of  fermenting  in 
anaerobiose.  Compared  with  Saccharomyces  cerevisiae,  the  ethanol  yield  and  specific 
productivity  of  Zymomonas  mobilis  are  higher,  because  less  biomass  is  produced  and  a 
higher  metabolic  rate  of  glucose  is  maintained  through  its  special  Entner
–
Doudoroff 
pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the 
ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high 
capacity  to  absorb  this  sugar,  resulting  in  high  ethanol  productivity  values.  However,  the 
wild-type  strains  proved  to  be  unable  to  metabolize  xylose  arisen  from  the  hemicellulose 
fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol 
and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of 
molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the 
fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation 
(SSF)  and  simultaneous  saccharification  for  and  co-fermentation  (SSCF)  processes,  in 
which  the  fermentation  of  both  sugars  occurs  in  one  step.  Initially,  to  make  easier  the 
accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a 
pretreatment  with  diluted  acid  to  fractionate  it  and  extract  the  hemicellulose  component 
from  the  solid  residue  termed  cellulignin.  This  solid  residue  was  pretreated  using  NaOH 
(4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the 
action  of  a  commercial  celulolytic  preparation,  allowing  the  conversion  of  cellulose  to 
glucose.  This  enzymatic  pretreatment  occurred  under  temperature  of  50°C  for  12  hours, 
after which the temperature was reduced to 30°C and the system was inoculated with cells 
of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565 
kb  was  chemically  synthesized and  cloned  into a  synthetic  vector,  that  contain  the  E.  coli 
and  Z.  mobilis  replication  checkmark  origin;  the  XI,  XK,  TAL,  TKL  genes,  and  the 
tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface 
experimental,  evaluating  the  addition  of  glucose  and  xylose  in  the  culture  medium  with 
different  concentrations,  as  well  as  hemicellulosic  hydrolyzate  in  different  proportions. 
Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF 
conditions,  evaluating  the  solid  content,  enzymatic  load  and  cell  concentration  by 
submerged fermentation.  Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry 
residue,  respectively,  the  optimum  conditions  were  found  to  be:  solid  content,  30%  and 
20%;  enzyme  load,  25  FPU/g  and  17.5  FPU/g;  cell  concentration,  4  g/L  and  1.59%(v/v), 
resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients 
addition  in the  SSF  process:  yeast  extract,  12.5 and  6.25  g/L;  KH
2
PO
4
,  2.5 and 1.25 g/L; 
(NH
4
)
2
SO
4
, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO
4
, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54 
g/L of ethanol concentration.  The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25 
g/L  of  ethanol,  confirming  that  about  50%  of  this  pentose  were  consumed  in  the  SSCF 
process,  employing  30%  of  solids,  20.5%  of  hydrolyzed  hemicellulosic,  10  mg/L  of 
tetracycline,  enzyme  load  of  25  FPU/g  cellulignin,  and  10%  of  the  initial  inoculum.  The 
results 
were 
very 
interesting 
and 
pointed 
out 
for 
future 
developments. 

xii 
 
S
S
U
U
M
M
Á
Á
R
R
I
I
O
O
 
 
 
 
CAPÍTULO 1  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
1.  APRESENTAÇÃO DO TEMA
 
1 
 
 
CAPÍTULO 2