TÜrk alman jinekoloji derneğİ Jİnekoloji ve obstetrik kongresi 19-23 mayis 1999


Sperm Hazırlama (Seleksiyon) Yöntemleri



Yüklə 149,9 Kb.
səhifə2/3
tarix05.05.2017
ölçüsü149,9 Kb.
1   2   3

Sperm Hazırlama (Seleksiyon) Yöntemleri

Yardımcı üreme teknolojilerinin pek çoğunda semen klasik laboratuar ortamında işlenmektedir.

Semen; seminal plazma , sperm , beyaz küreler , kontamine bakteriler ve hücresel artıklardan oluşmaktadır. Doğal ilişki ile döllenme sırasında sperm servikal mukus içerisinden geçerken seminal plazmadan fizyolojik bir yüzme ile ayrılır ve kadın üst genital traktüsüne erişir. Böylece motil spermler ovum ve fallopian tüplerin çevresine erişirken diğer seminal plazma bileşenleri alt genital kanalda elenerek kalır. İşte yardımcı üreme tekniklerinde kullanılan sperm hazırlama yöntemlerinin asıl amacı, spermi seminal plazma ve kontamine bakterilerden ayırmak, hızlı ve kaliteli bir sperm popülasyonu elde etmek ve sperm kapasitasyonunu sağlamaktır.

Günümüzde çeşitli sperm hazırlama teknikleri kullanılmasına rağmen hangi tekniğin en iyi olduğu konusunda tam bir görüş birliğine henüz varılamamıştır.Kullanılan tekniğin cinsine göre işlem sırasında %10-50 arasında sperm kaybı meydana gelir. Kullanılan yöntemin komplike olması ile doğru orantılı olarak, elde edilen motil sperm sayısı artmakta, fakat totalde kaybedilen sperm sayısının artmasına neden olmaktadır.

Normal ilişki sonrasında kapasitasyon kadın genital kanalında post-koital 5-6 saat içerisinde gerçekleşirken in vitro ortamda bu amaçla uygun kültür solüsyonları kullanılarak semen hazırlama işlemi ile kapasitasyon sağlanmaktadır. Kapasitasyonun in vitro ortamda indüklenmesi sağlanırken akrozom reaksiyonu için durum böyle olmayıp spermin zona pellüsida ile in vivo ortam da karşılaştığı zaman olması gerekmektedir.

Sperm hazırlama işlemi için kullanılan kültür solüsyonları tamponlanmış izotonik tuz solüsyonlarıdır.Tampon bileşiği solüsyonun pH’ının devamlılığını sağlar .Eğer bir CO2 inkübatörü varsa bikarbonat tampon kullanılabilir. Eğer CO2 li inkübatör yoksa HEPES tamponu pH devamlılığını sağlar.

İnsan veya bovin serum albümini ise tamponun protein kaynağı olup uzun süreli inkübasyon ve kapasitasyonun indüklenmesi için gereklidir. Son olarak Ca++ ve K+ da kapasitasyonun oluşabilmesi için gerekli elementlerdir. Sık kullanılan sperm hazırlama solüsyonlarına örnek olarak EBSS, Hams F10 , BWW ve modifiye human tubal fluid (HTF) sayılabilir. HTF, fallop tüplerinden salgılanan sekresyonun sentetik eşdeğeridir.
En basit sperm hazırlama yöntemi semenin yıkanarak sperm hücrelerinin ayrılmasıdır. Ejakülat kültür solüsyonu ile 1:5 - 1:10 oranında karıştırılarak 300 g de 10 dk. santrifüj edilir, pellet (topak) üstü atılır. Bu işlem 1-2 kez tekrarlandıktan sonra son pellet 0.5 cc %1 HSA (Human Serum Albümin) ya da %10 hasta serumu içeren kültür solüsyonu içerisinde çözülür. İyi bir hazırlama yöntemi olmayıp, pellet içerisinde sellüler artıklar ve ölü spermler kalabileceğinden yalnızca sperm hücrelerinin izolasyonunu sağlar. Beyaz küreler ve defektli spermler motil sperme zarar verecek bileşikler salgılarlar. Bu bileşikler içersinde lizozomal enzimler ve reaktif oksijen türleri oosite de zarar verebileceğinden ART’de basit yıkama yerine daha geliştirilmiş yöntemler kullanılır. Basit yıkamanın avantajı ise çabuk ve ucuz olmasıdır.
Swim-up:

Bilinen en eski yöntemlerden olup normospermik olgularda standart olarak kabul edilmektedir. Sperm Rise olarak da tanımlanmış olup self (aktif) migrasyon esasına dayanır, işlemin kolay olup, ucuz ekipman gerektirmesi avantajları arasında sayılabilir. Sperm basit yıkama yöntemi ile tüp dibinde hazırlandıktan sonra üzerine kültür solüsyonu ilave edilir. Hareketli spermler bu media içinden yukarıdaki katmana yüzer. Üst kısımdan alınan spermler ART sırasında kullanılır . Uygulamada 1:3 oranında kültür solüsyonu ile ejakülat dilüe edilir ve 500 g de 10 dk santrifüj edilir. Pelletin üst kısmı atıldıkdan sonra üzerine 2 ml kültür solüsyonu ilave edilir ve 500 g de 10 dk. yeniden santrifüj edilir , süpernatan atıldıkdan sonra üzerine 0.5 cc kültür solüsyonu ilave edilip, tüp 37O C’de 45O eğim ile %5 CO2 li ortamda 30-60 dk. inkübe edilir. Daha sonra pellete dokunulmadan süpernatan dikkatle aspire edilerek işlemde kullanılır. Swım-up ile bol miktarda progresif hareketli sperm elde edilebilmesine rağmen, sperm sayısında önemli ölçüde düşüş olur, bu nedenle şiddetli erkek faktöründe kullanımı kısıtlı kalmaktadır, diğer bir deyişle oligozoospermik olgularda kullanımı kısıtlıdır. Ayrıca işlem süresinin uzun olması ve visköz ejakülatlarda iyi sonuç vermemesi de kısıtlamalar getirmektedir.


Swim-down:

Ejakülat dansitesi seminal sıvıdan daha fazla olan bir solüsyon üzerine konularak 30-60 dk. 37O C’de 45O eğim ile %5 CO2 li ortamda inkübe edilir, tüpün en altından 0.5 cc aspire edilerek ART’de kullanılır. Basit olması ve santrifüj kullanılmaması avantajı olup progresif hareketli sperm elde etme şansı çok azdır.Bu yöntem içerisinde albumin gradientleri de kullanılmaktadır.


Dansite Gradient (Pure Sperm)

Pure Sperm (perkol yerine kullanılmaktadır) gradient metoduna dayanan bir ayırma-yıkama işlemidir. Preperasyon sonucunda semen içerisinde bulunan immotil veya anormal spermler, akyuvar hücreleri ve diğer tüm hücresel fazlalıklar ayrılarak sadece motil ve sağlıklı spermler kalır ve nontoksik olması sebebi ile Sperme,endometriuma ve oosite hiç zarar vermez.

İzotonik bir solüsyon olan Pure Sperm farklı gradientler halinde kullanıldığı gibi genellikle çift gradient halinde kullanılmaktadır. Alt faz ( % 90 lık Pure Sperm solüsyonu ) ve üst faz ( % 47 lik Pure Sperm solüsyonu) kullanılır.
Kit ve örneklerle, kullanılacak malzeme 37 °C ye getirilir.Steril bir disposable santrifüj tüpüne 3ml üstfaz ( % 47 lik Pure Sperm solüsyonu) yerleştirilir, 3ml alt faz (%90 lık Pure Sperm solüsyonu ) üst fazın üst kısmından hafifçe tüpün altına yerleştirilir. Bu işlemi yaparken çok yavaş olunmalıdır. Alt ve üst fazlar arasında istenen gradient.maksimum iki saat stabil kalır.Bir transfer pipeti yada şırınga kullanılarak 2 ml likefiye semen üst fazın üzerine aktarılır.

Bu üç fazlı tüp 20 dakika 350--450 g de santrifüj yapılır. Santrifüj sonunda görülebilir bir pellet kısmı yoksa satrifügasyon tekrarlanabilir.Sentrifikasyon sonunda hemen süpernatant alınarak pelletten uzaklaştırılır. 2.5-3 ml Sperm Yıkama Maddesi” (İçinde Antibiyotik ve HSA bulunan Earle' s balanced tuz solüsyonu/HTF- HEPES tamponu)”ilave edilip pellet çözülerek süspanse edilir (çalkalamadan hafifçe).Süspanse edilen karışım 8 -10 dakika 300 ile 400 g arasında santrifüj edilir Süpernatant alınarak pelletten uzaklaştırılır. Şimdi yıkama işlemi tamamlanan spermler çalışma ve araştırmalar için hazırdır.

PureSperm uygulamasının dezavantajları fazla zaman alması, mediumun pahalı olması ve seçilmiş spermlerden silika partiküllerini ayırmak için yeniden yıkama ve santrifüj gerektirmesidir

Mini Gradient uygulamasında ise gradientler 0.3 cc olarak hazırlanır.


Glasswool ile sperm hazırlama:

Oligo ve/veya asthenozoospermik olgularda yüksek oranda motil sperm elde edilmesinde tanımlanmış bir diğer yöntem de ‘Glass wool’ uygulamasıdır. Anormal membranı olan ,hareketi yavaş veya hareketsiz spermler Glass wool (cam yünü) fibrillerine takılarak kalırlar. Çabuk yapılabilmesi, pahalı ekipman gerektirmemesi , visköz ejakülatlarda çok iyi sonuç vermesi , yüksek oranda HOS (+) sperm eldesi ve bu yolla elde edilen spermlerin zona-free hamsteer yumurtalarını etkin bir şekilde penetre etmeleri avantajları olup, dezavantaj olarak da sperm membranı üzerinde ultrastrüktürel bozulmalara neden olmakla suçlanmasıdır. Uygulama şu şekilde gerçekleştirilir . Özel tip cam yünü 2 cc’lik bir enjektör içine 6-7 mg. tartılarak yerleştirilir ve 4-5 ml kültür solüsyonu ile yıkanır.Daha sonra ıslatılmış cam yünü üzerine maksimum 2 ml. ejakülat eklenerek 370 C’de 5 dk.içinde süzülmesi beklenir. Ardından 0.4 ml kültür solüsyonu ile glass wool içersinde kalmış ejakülatın da süzülmesi sağlanır ve süzülen tüm sperm fraksiyonu 1:3 oranında kültür solüsyonu ile dilue edilerek 300 g de 10 dk. santrifüj edilir, ve süpernatan atıldıkdan sonra pellet medium içersinde resüspanse edilerek kullanılır Daha pek çok semen işleme teknikleri olmasına rağmen en sık kullanılanlar yukarda sayılan teknikler olup diğerleri de bunların bir kombinasyonu şeklindedir. Örnek: Hyaluronic asit (Sperm Select) veya ficoll swim-up’da kullanılan medium hyaluronic asit/ficoll olup işlem temelde gene bir swim-up işlemidir.Yüksek dansiteli media içine santrifügasyonda da percoll dışında nycodenz uygulaması yapılabilir , filtrasyon uygulamalarından da glass-wool yerine sephadex column filtrasyonu (Sperm prep.) örnek olarak verilebilir.


İntra Uterin İnseminasyon (IUI)

Sperm hücrelerinin seminal plazmadan ayrılıp kapasite edilmelerinden sonra uterus içerisine verilmesidir, “aşılama” olarak da adlandırılmaktadır. Histerektomi yapılmış kadınlarda vajinaya yerleştirilen spermlerin 5000 de 1 tanesi servikal mukusa ve yalnızca 14 milyon da biri tüpe ulaşmaktadır .

IUI, seminal plazma içerisindeki prostaglandinlerin şiddetli uterin kasılmalara neden olması ve olası bakteriel kontaminasyon dolayısıyla uygun hazırlama yöntemleri kullanılıp seminal plazmadan arındırılmış, hareketli spermler ile yapılmalıdır. İnseminasyon için kullanılacak miktarın 0,5 ml’i geçmesinin de uterusta kontraksiyonlara yol açabileceği ve ağrılı olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır.

Ovaryumlarım hormonal stimülasyonu ile multipl folikül sağlanması IUI için rutin kullanılan yöntemlerden biridir.

Erkek faktörüne bağlı infertilite olgularında klomifen sitrat ile stimülasyon sonucu siklus başına gebelik yüzdeleri %6 ila %8 arasındadır.. Stimülasyon hMG ile yapıldığında siklus başına gebelik oranları %10, %15 arasındadır. Ho ve ark. tarafından yapılan karşılaştırmalı bir çalışmada bu ajan ile stimüle edilmiş hastalardaki gebelik oranı %14,3 dür.

IUI da başarı oranları sperm parametrelerindeki defekt veya defeklerinin sayısı ve ciddiyeti ile de doğru orantılıdır. Bu nedenle IUI yöntemi hastalarda in vivo ortamda döllenmenin olabileceğinin düşünüldüğü vakalarda uygulanmalıdır. Bu amaçla kullanılacak kriterler arasında en önemli yeri strict kriterler ile değerlendirilmiş sperm morfolojisi (MEUSC) almakta olup IUI için limit > %4 normal morfolojidir.

IUI yöntemine alternatif olarak intraservikal inseminasyon (ICI) ve intraperitoneal inseminasyon (IPI) yöntemleri de tanımlanmıştır. ICI’nın hipospadias gibi mekanik nedenlerle erkek infertilitesi dışında erkek infertilitesi tedavisinde yeri yoktur. IPI ise yapılan kontrollü karşılaştırmalı çalışmalarda gebelik oranları açısından IUI’a üstünlük göstermediği için yalnızca servikal stenoz nedeniyle uterusa ulaşılamayan durumlarda kullanılacak bir yöntem olup erkek infertilitesi tedavisinde yeri yoktur.

IUI’ın bir diğer özel kullanım alanı ise retrograd ejakülasyon olgularıdır. Burada önce mesane içi ya kültür solüsyonu ya da ağızdan bikarbonat verilerek bazik hale getirilir, takiben hastadan mastürbasyon yapıp, idrarını steril bir kaba yapması söylenir.Bu materyalden elde edilecek spermler ile IUI veya diğer ART teknikleri kullanılarak inseminasyon yapılabilinir.

İnseminasyon sırasında kateter seçimi de önemlidir . Rutin olarak kullanılan pek çok kateter vardır. Serviksin yapısı ve uterusun derinliği kateter seçiminde dikkat edilmesi gereken en önemli olgudur. Travmatizasyondan kaçınmak amacı ile serviks yarığında kateterin fundusa zarar vermesini engelleyecek adaptörleri bulunan kateterler seçilmesi tavsiye edilmektedir. Bunun için IUI yapılmadan en az bir siklus önce histerometri yada kullanılacak kateter ile kontrol yapılması tavsiye edilmektedir.
İn Vitro Fertilizasyon (IVF)
Yardımcı üreme teknikleri içerisinde en çok kullanılan ve en kontrollü yöntemdir. IVF için de ön koşul spermin hazırlanmasıdır. Çoğunlukla swim-up ya da Dansite Gradient (PureSperm) ile hazırlama yöntemleri kullanılır. Semenden mümkün olduğunca fazla progresif hareketli sperm elde edilmesi gerekmektedir.

IVF işleminin en önemli aşaması inseminasyondur. İnseminasyonda kullanılacak sperm sayısı, hareketliliği ve sperm morfolojisi in vitro döllenme şansı üzerine direkt etkilidir . İnseminasyon için kullanılacak sperm sayısı düşük olduğunda yeterli sperm olmadığından döllenme oluşamayacağı gibi, inseminasyon ortamındaki sperm sayısı fazla olduğunda artık metabolitler toksik etki gösterecektir. Erkek infertilitesinin söz konusu olmadığı durumlarda uygulanan standard inseminasyon oosit başına 50.000 adet progresif hareketli sperm kullanımıdır.

IVF sonuçlarını etkileyen en önemli sperm parametresi strict kriterlere göre değerlendirilmiş sperm morfolojisi olup in vitro döllenme şansı %5 normal morfolojinin altındaki olgularda %7 lere kadar inmektedir . Herne kadar morfoloji IVF sonuçlarını en iyi öngören parametre olsa da bu parametreye ikincil olarak progresif hareketli sperm sayısı ile birlikte değerlendirildiğinde morfolojinin %5 in altında ve progresif hareketli sperm sayısının 3 milyon/ml altında olduğu olgularda fertilizasyon yüzdesi %18 olup bu gurupta hiç gebelik oluşmayabilir. Oysaki her iki parametrenin normal olduğu durumlarda (>5%, >3 milyon/ml) fertilizasyon oranları %72 ye ulaşmakta ve gebelik %27 oranında görülmektedir .

Bu nedenlerle inseminasyon protokolleri ,erkek faktörünün varlığı ve şiddeti göz önüne alınarak değişik protokollerde uygulanır. Erkek infertilitesi olgularında kullanılabilecek inseminasyon tekniklerinden ençok başvurulan insemine edilen progresif hareketli sperm sayısının 100.000 ila 500.000’e kadar çıkarılmasıdır. Erkek faktörünün olmadığı infertilite vakalarında fertilizasyon yüzdeleri %71 iken erkek faktörüne bağlı infertilite olgularında bu oran %23’e düşmekte; inseminasyon konsantrasyonlarının artırılması ile de fertilizasyon yüzdeleri % 61’e kadar yükseltilebilmektedir .

Erkek faktörünün saptandığı infertilite olgularında ortalama fertilizasyon yüzdesi %50 iken bu yüzde erkek faktörünün olmadığı vakalarda %70 ila %90’ lara varmaktadır. Total fertilizasyon yokluğunun saptandığı olgular erkek faktörünün olduğu vakalarda %25 iken bu oran erkek faktörünün olmadığı olgularda %10’a düşmektedir. Erkek infertilitesindeki düşük fertilizasyon yüzdeleri aynı zamanda IVF başına canlı doğum oranında da %13’e varan bir düşüş göstermekte olup, bu oran erkek faktörünün olmadığı durumlarda %18’dir .

Unutulmaması gereken bir faktör de tümüyle erkeğe bağlı infertilite olgularında bir kez fertilizasyon sağlandıktan sonra oluşan embryoların uterusa implante olma şansı ve dolayısıyla hamilelik şansı erkek faktörünün olmadığı vakalarla eşit düzeydedir.

Erkek infertilitesinde başarı şansını artırmak için başvurulan diğer bir yöntem de mikrodamla inseminasyon yöntemidir. Oositler yağ altında 20 mikrolitrelik damlalara transfer edilip bu damlalar içerisine yüksek konsantrasyonda sperm verilerek oosit sperm etkileşim yüzeyi azaltılmıştır. Erkek infertilitesi olgularında klasik IVF inseminasyonu sonuçları ile mikrodamla inseminasyon sonuçları karşılaştırıldığında, klasik IVF de fertilizasyon yüzdesi %14 iken mikrodamla ile inseminasyonda %55 dir.

Oosit transferi ve erken embryonik gelişme normalde Fallop tüplerinde gerçekleştiği için gametlerin klasik IVF deki gibi toplanıp hazırlandıktan sonra Fallop tüplerine yerleştirilmesi (Gamete İntrafallopian Transfer = GİFT) veya in vitro koşullarda elde edilmiş embryoların Fallop tüplerine yerleştirilmesi (Zygote intrafallopian transfer = ZIFT) de IVF’e alternatif olarak geliştirilmiş yöntemlerdir. Erkek infertilitesi vakalarında GIFT yöntemi uygulanan siklus başına gebelik yüzdeleri %26 olup ZIFT’de karşılaştırmalı çalışmalarda IVF ile anlamlı farklılık gözlenememiştir.



Mikromanipulasyon (Intrastoplazmik Sperm Enjeksiyonu):
Sperm değerleri çok düşük olan erkeklerde kullanılan bir yöntem olduğu için erkek infertilitesi olgularında vazgeçilemez laboratuar tekniği haline gelmiştir. Mikromanipülasyon tekniklerinin çoğunlukla erkek infertilitesi vakalarında kullanılıyor olması bu vakalarda fertilizasyon elde edilebildiği takdirde, bunu takip eden gebelik oluşma şansı diğer IVF vakaları ile eşit hatta zaman zaman daha yüksek olmaktadır.
İn vitro fertilizasyon yöntemi ile aynı şekilde elde edilen oosit ve spermlerin ınsemine edilmesi yerine mikromanipülasyon yönteminde oositlerin manipülasyonu ile oosit-sperm etkileşmesi manipüle edilerek artırılmaktadır. Üç tür mikromanipülasyon tekniği tanimlanmıştır.

Parsiyel zona diseksiyonu (Partial Zona Disection = PZD), ile zona pellucida üzerinde mekanik bir delik (geçit) oluşturulur ve manipüle edilen oositler normal IVF prosedüründeki gibi insemine edilir. Bu yöntemin kullanımı ile erkek infertilitesi olgularında başarılı sonuç elde edilmiştir .

Spermin subzonal aralığa injeksiyonu (subzonal sperm injection = SZI) ile sperm zona altındaki perivitellin aralığa yerleştirilir. Bu teknikde de başarılı sonuçlar elde edilmiştir .
Mikromanipülasyon teknikleri içerisinde en invaziv yöntem olan intra sitoplazmik sperm enjeksiyonu ile (Intracytoplasmic sperm injection = ICSI) en yüksek fertilizasyon ve gebelik oranları elde edilmektedir. Bu prosedürün bir başka üstünlüğü ise bir oosit için bir sperm gerektirmesi dolayısı ile çok düşük sayılardaki sperm ile bile gebeliklerin oluşturulabiliyor olmasıdır. Intrauterin inseminasyon ve in vitro fertilizasyon prosedürlerinin aksine ICSI sonuçları sperm kalitesine bağımlı değildir .
Mkromanipülasyon sonuçları semen analiz sonuçları ile birlikte değerlendirildiğinde, PZD uygulanan ileri teratozoospermik olgulardan oluşan embryolarda belirgin embryo anormallikleri görülmekle birlikte bu gurup hastalardaki SZI ve ICSI prosedürlerinde bu olgu görülmemektedir. Gerek PZD gerekse de IVF inseminasyonlarında semen analizi sonuçları ile doğru orantılı olarak embryolar pekçok immotil ve/veya ölü spermin bulunduğu ortamdadırlar. Bu ise serbest oksijen radikalleri gibi toksik maddelerin ortamda bulunması ile sonuçlanmaktadır. Öte yandan SZI ve ICSI uygulanan embryolar heterojen sperm popülasyonları ile etkileşimde bulunmadığından çevresel faktörlerden etkilenmemektedir.
Mikromanipülasyonda en önemli komplikasyon oosit hasarıdır, bu SZI için %7 iken başlangıçta ICSI için %13,5 olarak bildirilmiş olup son yayınlarda bu ornanın % 8,3’e düştüğü belirtilmiştir. Fertilizasyon oranları SZI için %14,3 ICSI’de ise %59 olup kimyasal gebelik oranları SZI de %16,1 ICSI de %45, klinik gebelik yüzdeleri ise SZI’de %14 ICSI de ise %35 olarak bildirilmiştir .
Bu sonuçlar doğrultusunda, özellikle erkek infertilitesi olgularında en etkin tedavi yöntemi ICSIdir. İlk çalışmalar ICSI sonucu dünyaya gelen çocuklardaki majör genetik malformasyon riskinin normal popülasyon ile karşılaştırıldığında beklenenin altında (%2,2) olduğunu göstermektedir.

Konjenital vas defferens yokluğu ya da restore edilemeyen obstrüktif olgularda başvurulan epididimal (Microsurgical epydidimal sperm aspiration = MESA) ya da testiküler (Testicular sperm aspiration = TESA) sperm elde edilmesi ile de mikromanipülasyon teknikleri kullanılmaktadır. Cerrahi yöntemlerle elde edilen bu sperm popülasyonunda gerek fertilizasyon gerekse gebelik yüzdeleri açısından optimal sonuçlar yalnızca ICSI prosedürü uygulanarak elde edilmektedir. Bu yöntemler ile bildirilen fertilizasyon oranları %45 olup hasta başına klinik gebelik oranları % 20-30 olarak bildirilmiştir .


ICSI’DE TESTİKÜLER SPERMLERİN KULLANIMI
Azoospermiye erkek infertilitesi olguları arasında %10 oranında rastlanılmaktadır. Bunların büyük kısmında etyoloji testiküler yetmezliğe bağlıyken, %20’sinde bilateral obstrüksiyon sorumludur. Genel olarak değerlendirildiğinde ise infertilitede seminal kanallara ait obstrüksiyon sıklığı %7 civarındadır. Geçirilmiş skrotal veya inguinal operasyon yada tekrarlayan genital enfeksiyon hikayesi bir obstrüksiyonun varlığını düşündürmelidir. Bu hastalarda testis volümü normal olup, FSH ve LH hormon düzeyleri de yine normal sınırlarda bulunur. İnfertil erkek populasyonunun %1-2’sinde konjenital bilateral vaz deferens agenezi söz konusudur. İnfertilite nedeniyle tetkik edilen erkeklerin yaklaşık %20’sinde ultrasonografik veya vazovezikülografik incelemeler ile ejakulatör kanallara ait fonsiyonel yada mekanik obstrüksiyon yapması muhtemel bir anomali saptanırken, bunların %4’ünde ejakülatör kanallarda parsiyel bir obstrüksiyonun varlığı söz konusudur. Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarında ejakulatın tamamı veya büyük kısmını prostat sekresyonu oluşturur. Ejakulat volümü 0.5-1 ml, pH ise 6.5 civarındadır. Koagulasyon oluşmayıp, semende früktoz negatiftir. Bu nedenle, vaz deferenslerin palpe edildiği, seminal volümün azaldığı ve asitleştiği azoospermi olgularında komplet bilateral ejakulatör kanal darlığından şüphelenilmelidir. Parsiyel tıkanıklıkların kliniği ise değişkendir. Ejakülatör kanal obstrüksiyonlarının tedavisinde transrektal yada transperineal kist aspirasyonu, transuretral endoskopik rezeksiyon veya seminal kanalların yıkanması kullanılan metodlardır.
Seminal parametreleri ileri derecede bozuk olan erkeklerin %20-25’inde ise epididimal oligospermi bulunmaktadır. Bu durum, epididim içinde skar dokusu oluşumuna neden olan klinik yada subklinik geçirilmiş enfeksiyonlara bağlanmaktadır. Skar dokusu epididimal tubulülere bası yapmakta ama bir miktar sperm çıkışına da müsaade etmektedir. Son yıllarda seksüel geçiş gösteren hastalıkların artması ile bu oranın daha da yükselmesi beklenmektedir. Geniş serili çalışmalarda, sperm konsantrasyonunun 5 milyon/ml’den düşük, <%20 motilite ve <%25 normal formda sperm bulunan olguların %49’unda testis biyopsilerinde normal spermatogenez saptanırken epididimal bir patoloji de eşlik etmektedir. Spermatogenezin ve epididimlerin her ikisinin de normal olduğu olgular sadece %4 oranındadır. Geri kalanlarında ise spermatogenezde bir bozukluk söz konusudur. Epididimal oligospermi olgularının tedavisi mikrocerrahi olup, epididimolizis yada vazoepididimal anastomozlar uygulanabilir. Sonuçları oldukça başarılıdır. Değişik etyolojilere bağlı gelişebilen vazal yada epididimal obstrüksiyonların mikrocerrahi ile tedavileri neticesi %38-96’sında anastomoz açıklığı ve %19-82 arasındada spontan gebelik oranları bildirilmerktedir. Sonuçlardaki değişkenlik obstrüksiyonun seviyesi ve süresi, epididim fonksiyonları, tekrarlayan genital enfeksiyonların varlığı ve antisperm antikor gelişimine bağlanabilir.
Obstrüktif azoospermi olgularında yukarıda bahsedilen tedavileri takiben bir düzelme sağlanamamışsa üremeye yardımcı teknikler kullanılmalıdır. Ejakulattan yeterli sayı veya kalitede sperm elde edilemediği olgularda testisden yada epididimden alınan spermler ICSI işleminde kullanılarak olguların yaklaşık %40’ında klinik gebelik sağlanılabilir.
Nonobstrüktif azoospermiye ise değişik faktörler yol açabilir: maturasyon arresti, germinal aplazi (Sertoli cell only), kriptorşidizm, kemoterapi veya Klinefelter sendromu bunlar arasında sayılabilir. Testiküler yetmezlikli bu olguların yaklaşık %60’ında testislerden spermatozoa ekstrakte edilebilmektedir. Geri kalanlarında ise round spermatid nukleusu (ROSNI) veya değişik evrelerde spermatidler kullanılarak ICSI yapılabilmektedir. ICSI’de kullanılabilecek en ideal spermatid evresi elongated ve matür spermatidlerdir. Bununla birlikte elongating yada round spermatidler kullanılarak da fertilizasyonun başarılması mümkündür. Hoffman veya Nomarski optikleri kullanılarak bile haploid round spermatidleri diploid spermatositlerden, spermatogoniumlardan, lökositlerden, eritrositlerden yada Sertoli hücre nukleusundan ayırdetmek her zaman kolay olmamaktadır. Bu amaçla bazı kriterler getirilmiştir. Round spermatidlerin daha küçük olmaları (6.5-8 um) ve çıkıntı yapmış akrozom veziküllerinin görülmesi, belirgin nukleusları ile bunu çevreleyen sitoplazma zonu bunların spermatogoniumlardan, spermatositlerden yada lenfositlerden ayırdedilmesinde dikkat edilecek bazı kriterlerdir. Bununla birlikte, ikinci mayoz bölünmesini yeni tamamlamış bir spermatidde henüz akrozom yapısı gelişmediği için, Golgi fazı spermatidleri özellikle küçük lenfositlerle karıştırmak mümkün olabilmektedir. Belirgin nukleolusu ve transparan, düz sınırlı görünümleri ile Sertoli hücre nukleuslarını görebiliriz. Bütün bu kriterlere rağmen bir round spermatidin canlı olup olmadığına yada genomik yapısının normal olup olmadığına, hücreyi boyamadan veya parçalamadan karar vermek imkansızdır. Tek kriter mikropipet içine aspire edildikten sonra spermatidin lizis olmadan canlılığını sürdürdüğünün gözlenmesidir. Komplet spermatogenez bozukluğu gösteren testislerin sadece %10’unda round spermatid bulunabilmektedir. Daha önceki tahlillerinde azda olsa spermatozoa görülmüş olan olgulardan elde edilen spermatidler kullanılarak yapılan ICSI işleminden elde edilen başarı, şiddetli spermatogenez defekti bulunan olgulardakine göre çok daha düşüktür. Round spermatid kullanılacak olgularda işlemin etkinliğinin ve Y kromozom delesyonlarının genetik geçiş risklerinin mutlaka önceden çiftlere izah edilmesi gerekmektedir.
TESE işlemi sırasında spermatid bulunduktan sonra başka hücre aranmasına son vererek bu spermatidin kullanılması yada araştırmaya spermatozoa bulununcaya kadar devam edilmesi konusu halen tartışılmaktadır. Spermatid bulunan olgularda mutlaka spermatozoada bulunabileceğini savunan araştırmacıların yanısıra, spermiyogenez arresti olgularında Sertoli hücreleri ile bağlantılarının kesilmesi neticesi daha ileri maturasyon gösteremeyen spermatidlerin spermatozoa olmasada elde edilebileceğini savunan bilim adamları da bulunmaktadır. Çalışmalar, testis dokusunun fazla travmatize edilmesinin ileride atrofi yapabileceğini ve başka uygulamalarda kullanılamaz hale getirebileceğini ortaya koymuştur. Bu nedenle hastanın durumu, önceki biyopsileri ve kadın faktörü de göz önüne alınarak bu işlemin sınırına karar verilmesi daha uygun olacaktır.
TESE işlemi operasyon mikroskopu altında yapılmalıdır. Testisin damarlanmasının en az olduğu bölgesi alt kutup iç, dış ve ön yüzü ile üst kutup iç ve dış bölgeleridir. Mikroskop ile damarlanmanın olmadığı alanlardan ince (tercihan göz ameliyatlarında kullanılan) bir bistüri ile kesi yapılması uygun olur. Testis dokusu arasındada yine damarsız hatlardan diseksiyon yapılarak ilerlenilmelidir. Tubulilerin dolgun ve daha parlak olanları seçilerek eksize edilmesi, hem daha az volümde doku çıkarılmasına hem de germinal hücre bulma şansının daha fazla olmasına olanak verecektir. Mümkün olduğu kadar kanatmaksızın kesilen testis tubuli dokuları uygun kültür ortamı içine alınarak bekletilir. Testisin üst ve alt kutuplarından bilateral olarak biyopsilerin alınmasının yeterli olacağı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Yada, her seferinde spermatozoa aranarak bulununcaya kadar işleme devam edilebilir. İşlem sonunda tunika ince absorbe olur bir sütür ile kapatılır. Hemostaz bipolar koter ile sağlanmalıdır. Biyopsi esnasında testisin, epididimin ve vaz deferensin muyene edilmesi çok önemlidir. Bu sırada gerekirse mikrocerrahi işlemine ihtiyaç duyulabilir. İşlemin uzun sürmesi olasılığını da düşünerek genel anestezi kullanılması uygun olur.
Testislerden sperm elde etmede perkütan iğne biyopsisi de önerilen diğer bir metoddur. Özellikle obstrüktif olduğuna daha önce karar verilmiş olgularda tercih edilmelidir. Sperm eldesi konusunda değişik çalışmalarda farklı sonuçlar bildirilmektedir. Ancak, eksplorasyon ile beraber testislerden açık cerrahi teknik ile TESE yapılması daha faydalı ve başarılı bir yöntemdir. Perkütan girişimlerin ancak testis biyopsisi alınmasında uygulanması doğru olur.
Testis dokusu alındıktan sonra önce mekanik yolla parçalanır. Bu işlemin enzimatik digesyon metodu ile yapılması da tavsiye edilmektedir. Bizim gözlemlerimiz, mekanik ayrıştırma ile yeterli hücre elde edilemeyen olgularda enzimatik ayrıştırmanın kullanılması yönündedir. Böylece enzimlere (DNAse ve Collagenase) ait muhtemel toksik etkilerden, hernekadar spermlerin canlılığında bir bozulma yapmadıkları gösterilmişse de, korunulmuş olunur. Bu yöntemlerle eğer spermatozoa görülmüşse bunların ICSI işlemi için hazırlanmaları gerekir. Swim-up uygulanacaksa, testis dokusu ekstresi vortekslendikten sonra 5-10 dk süreyle çökmeye bırakılır. Takiben üstteki sıvı kısmı alınarak bilinen yıkama işlemine, arkasındanda swim-up’a geçilir. Sperm sayısının çok düşük olduğu olgularda direk pellet kullanılabilir. TESE olgularında değişik solüsyonlarla hazırlanmış gradient sistemleri de kullanılabilir. Bu şekilde doku artıkları, eritrositler ve lökositler büyük oranda ortamdan uzaklaştırılmış olunur. Gradient sişstemleri kullanılacaksa, bunların miktarları ve santrifüj süreleri sperm sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Bu teknikte önce lökositler ortamdan uzaklaştırıldığı için, santrifüj sırasında bunlardan ortama çıkabilecek serbest oksijen radikallerinin önceden uzaklaştırılması da mümkün olmaktadır.
TESE işlemi sırasında eritrositlerin ortamdan uzaklaştırılacağı eritrosit lysing mediumları kullanılabilir. Özellikle biyopsilerin aşırı kanamalı ortamda alındığı olgularda eritrosit lysing solüsyonları faydalı olabilir.
Testis dokusundan sperm elde edildikten sonra bunlar hemen ICSI işleminde kullanılabilecekleri gibi 24-72 saat süreyle kültür ortamında inkübe edilerek bekletilebilirlerde. Bu şekilde immotil spermatozoaların maturasyonlarını tamamlayarak motil hale geçmeleri yada round spermatidlerin elongating-elongated-matür spermatid evrelerine gelmeleri mümkündür. Bekleme işlemi inkübatör içinde 37C’de yapılabileceği gibi 32C’de yada oda ısısında da olabilir. Oda ısısında sperm enerji tüketiminin minimal olacağı, bu nedenle daha uzun süereli saklamaların sağlanabileceği ileri sürülmektedir. 10 günlük saklamalarda bile motilitenin %20 oranında korunabileceği bildirilmektedir. Bu konuda daha geniş serilerin sonuçlarının yol göstereceği kanısındayız.
Testis dokusu alındıktan sonra bir kısmı dondurularak ileri uygulamalar için saklanabilir. Ayrıca, TESE yapıldıktan sonra elde edilen spermatozoalar da dondurularak saklanılabilir. Testis dokusu veya sperm hücrelerinin kriyoprezervasyonunun her TESE olgusunda uygulanmasının gerekli olduğu kanısındayız. Bu şekilde daha sonra yapılacak ICSI olguları için hazır hücre saklanmış olunur. İlk TESE işleminden sonra testiste damarlanmanın bozularak yada hematom gelişimine bağlı olarak atrofi gelişmesi ve ikinci uygulamalarda hücre bulunmasını güçleştirmesi mümkündür. Testisten elde edilen spermatozoaların kriyoprezervasyonunda canlılık oranı ortalama %30 olarak bildirilmektedir.
Sonuç olarak, azoospermi olgularında TESE ile elde edilen hücrelerin ICSI’de kullanılması, infertilite tedavisinde son derece önemli bir gelişme olmuştur. Daha erken evre germinal hücrelerin kullanılması ile fertilizasyon ve gebelik elde edilmesi gelecekte bu grup hastaların da tedavilerini mümkün kılacaktır.
Yüklə 149,9 Kb.

Dostları ilə paylaş:
1   2   3




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə