11 – laboratoriya mashg’uloti

11 – laboratoriya mashg’uloti.

Mavzu: RNK ning kislotali gidrolizi va xromatografiya yordamida nukleotid tarkibini aniqlash.

Hisobot

Biz ushbu laboratoriya mashg’ulotida RNK ning kislotali gidrolizi va xromatografiya yordamida nukleotid tarkibini aniqlashni nazariy o’rgandik.

Bunda 10 mg RNK olib, uni ultratermostatda 37 – 38 ^oS harotda 12 – 18 soat davomida 0,1 – 0,2 ml 1 n KOH yordamida gidroliz qilinadi. Gidroliz vaqtini 3,5 – 4 soatgacha qisqartirish mumkin, lekin bu sharoitda (4 soat, 60 ^oS) sitidil kislotasining bir qismi dezaminlanadi va uridil kislotaga aylanadi. Gidroliz vaqti tugagach, gidrolizat sovitiladi va 50% - li HClO₄ bilan neytrallanadi. Yomon eriydigan KClO₄ cho’kmaga tushishi uchun aralashma muzli suv hammomida qoldiriladi.

Gidrolizatdagi ribomononukleotidlar aralashmasi YuQX yordamida etanol : n- butanol (4 : 1) sistemasida aniqlanadi. So’ngra plastinkani quritib, shu yo’nalishda suv bilan to’yingan va konsentrlangan ammiak yordamida pH 3,5 – 4,5 – ga keltirilgan izomoy kislotasida xromatografiya qilinadi. Nukleotidlar standartdan boshlab, quyidagi tartibda joylashadi: guanil kislota, uridil, sitidil va adenil kislota. Ultrabinafsha nurida hosil bo’lgan dog’lar aniqlanadi, oddiy qalam bilan chiziladi va pH 7,0 bo’lgan 5 ml 0,3 – 0,5 M K – (yoki Na) fosfat buferi eritmasi yordamida 37 – 45 ^oS – da bir necha soat davomida elyuatsiya qilinadi. Elyuatlar spektrofotometrda quyidagi to’lqin uzunliklarida tekshiriladi: guanil kislota (GK) 255 nm va 290 nm, adenil kislota (AK) 260 nm va 290 nm, sitidil kislotasi (SK) 270 va 290 nm, uridil kislotasi(UK) 260 va 290 nm. Nukleotidlar mkmollarda quyidagi formulalar bo’yicha aniqlanadi: GK = 0,47 x (E₂₅₅ - E₂₉₀), AK = 0,363 x(E₂₈₀ – E₂₉₀) SK = 0,73 x (E₂₇₀ – E₂₉₀), UK = 0,515 x (E₂₆₀ – E₂₉₀). RNK ni xarakterlash uchun nukleotidlar molyar protsentlarda ifodalanadi.

Nisbatan tez va effektiv ravishda ajratishga DEAE – sellyulozali plastinkalar YuQX da olib borish bilan erishish mumkin. Bunda DEAE – selyuloza gips yordamida plastinkaga mahkamlanadi (plastinkalarga 78,5 g DEAE – selyuloza va 62 ml suvdagi 1 g gipsdan iborat suspenziya qo’llaniladi, 50 ^oS da 2 soat davomida quritiladi). 0,005 n HCl yordamida xromatografiya qilinadi, elyuatsiya qilish va nukleotidlar miqdorini aniqlash yuqorida bayon etilgani kabi amalga oshiriladi. Nukleotidlarning joylashishi quyidagi tartibda bo’ladi: A – 2 fosfat (0,32), A – 3 fosfat (0,24), G – 2 fosfat (0,18), G – 3 fosfat (0,09), S – 2 fosfat (0,61), S – 3 fosfat (0,50), U – 2 fosfat (0,48), U – 3 fosfat (0,42).