Baki universitetiNİn xəBƏRLƏRİ



Yüklə 49.23 Kb.
PDF просмотр
tarix16.02.2017
ölçüsü49.23 Kb.

 

BAKI UNİVERSİTETİNİN XƏBƏRLƏRİ 

№3                                        Təbiət elmləri seriyası                                  2010 

 

 

 

 

 

 



POLİMERAZA-ZƏNCİRVARİ REAKSİYASINA ƏSASLANAN 

DİAQNOSTİK METODLAR VƏ TƏTBİQ SAHƏLƏRİ 

 

K.Ə.ƏLİYEVA, Z.F.ƏFƏNDİBƏYLİ, E.M.RƏSULOV, E.E.RƏSULOV  

Bakı Dövlət Universiteti, GEN LAB 

kama_fuadik@mail.ru 

 

Polimeraza-zəncirvari reaksiyası metodunun prinsipləri və  tətbiq sahələri  şərh edilir. 

Azərbaycan Respublikasının Quba və Xaçmaz rayonlarının  əhalisində yüksək temperaturlu 

allel-spesifik amplifikasiya metodu vasitəsilə beta-talassemiya mutasiyasının və qlükoza-6-

fosfatdehidrogenaza fermentinin çatışmazlığının öyrənilməsinin eksperimental nəticələri 

verilir.  

  

Molekulyar biologiya və molekulyar genetika elmlərinin inkişafı bir sıra yeni 

diaqnostika üsullarının işlənib hazırlanmasına səbəb olmuşdur ki, bu da öz növbə-

sində molekulyar diaqnostikanın, molekulyar təbabətin sürətlə inkişafına səbəb 

olmuşdur. Kəşflərdən  ən  əhəmiyyətlisi hüceyrə bölünməsində mövcud replikasiya 

prosesinin in vitro təkrarı olan “Polimeraza Zəncirvari Reaksiyasıdır” (PZR). PZR 

üsulunun kəşfinə görə yapon mənşəli amerika alimi Saiki 1988-ci ildə biologiya elmi 

sahəsində Nobel mükafatına layiq görülmüşdür. PZR metodu üçün çox az bioloji 

material (DNT və RNT) tələb olunur. Hətta bir hüceyrədən alınmış genetik material 

səviyyəsində belə genetik patalogiyası  məlum olan istənilən irsi xəstəliyin diaqnos-

tikasını aparmaq mümkündür. Bioloji materialın – cift hüceyrələrinin (xorion hü-

ceyrələri), amniotik məhlulun fibroblastlarının az miqdarı ilə PZR metodunun  iştirakı 

ilə bir sıra irsi xəstəliklərin ana bətnində erkən prenatal diaqnostikası mümkün olmuş-

dur. Prenatal diaqnostikası mümkün olan irsi xəstəliklərdən; α-talassemiyanı, β-talas-

semiyanı, ayparaşəkilli anemiyanı, Hemofiliya A və Hemofiliya B-ni, Qentinqton 

Xoreyasını, Düşen Sindromunu, Hemoxromatozu, qlyukozo-6-fosfatdehidroqenaza 

fermentinin (Q6FD) çatışmazlığını, Zandqoff xəstəliyini və s. göstərmək olar (4, 5, 

10, 11, 12). 

          1988-1994-cü illər ərzində Azərbaycan Respublikasının ET Mamalıq və Gine-

kologiya İnstitutunun Tibbi-genetika laboratoriyasının əməkdaşları PZR-na əsaslanan 

molekulyar diaqnostikadan istifadə edərək Rusiya Elmlər Akademiyasının Mole-

kulyar Genetika İnstitutunun “İnsan Genetikası”, Tibbi Elmlər Akademiyasının Tibbi-

Genenika İnstitutunun “Prenatal Diaqnostika” laboratoriyaları və İtaliyanın Sardiniya 

adasında yerləşən “Prenatal Diaqnostika” mərkəzi (Kalyari şəhəri) ilə birlikdə Res-

publikanın əhalisində β-talassemiyanın 23 müxtəlif mutasiyası aşkar edilərək identifi-

kasiyasını aparmışdır (3,7,8).  

 

41


     1989-cu  ildə SSRİ-də ilk dəfə olaraq β-talassemiyanın, 1990-cı ildə oraqvari 

hüceyrə anemiyasının ana bətnində prenatal diaqnostikası Azərbaycan Respub-

likasının ET Mamalıq və Ginekologiya İnstitutunun Tibbi-genetika laboratoriyasının 

və Rusiyanın Tibbi Genetika İnstitutunun Prenatal Diaqnostika laboratoriyasının 

əməkdaşları tərəfindən iki azərbaycanlı ailəsində aparılmışdır (1,2). 

       Tədqiqatlarımızda məqsədimiz PZR əsaslanan metodlar kompleksindən istifadə 

edərək Azərbaycan Respublikasının əhalisində təsadüf edən irsi qan xəstəliklərindən, 

beta-talassemiyanın və Q6FD molekulyar tiplərinin identifikasiyası olmuşdur. 

 

Material və metodika 

     Eksperimental  material  Quba  və Xaçmaz rayonlarının  əhalisinin genetik tədqi-

qatları zamanı toplanmışdır. Analiz üçün həcmi 3-5 ml olan venoz qandan istifadə 

edilmişdir. Talassemiyanın diaqnostikası izoelektrofokuslaşdırma, Q6FD fermentinin 

aktivliyi Beutler tərəfindən təklif edilmiş metodlar vasitəsilə aparılmışdır (6). 

     Polimeraza-zəncirvari reaksiyası metodunun prinsipi (9). Metodun əsasında nuk-

lein turşularının (DNT və RNT) unikal xüsusiyyəti – ozünün reproduksiyası durur. Bu 

xüsusiyyətdən istifadə edərək sınaq şüşəsində in vitro süni olaraq nuklein turşusunun 

spesifik fraqmentinin əlavə kopiyası alınır. PZR metodunu aparmazdan əvvəl kopiya-

sının çıxarılması tələb olunan nuklein turşusunun birincili strukturu – nukleotid ardı-

cıllığı müəyyən edilməlidir. Fraqmentin nukleotid ardıcıllığı müəyyən edildikdən 

sonar hədəf nukleotid fraqmentinə komplementar olan iki sintetik DNT-zond və ya 

praymer sintez edilir. Praymer PZR-da ən  əsas element olaraq spesifik reaksiyanın 

başlanmasına təkan verir. Beləliklə, PZR üçün test tədqiq edilən nuklein turşuların-

dan, praymerdən, dezoksiribonukleotidlərdən (dATF, dTTF, dQTF və dSTF), ter-

moatabil DNT-polimerazadan (Termus aquaticus adlı termofil bakteriyanın fermenti) 

ibarət olmalıdır. Nuklein turşusunun fraqmentinin sintezi məqsədilə reaksiya qarışığı 

olan PZR testi sınaq süsəsi ilə birlikdə təkrar olaraq DNT və ya  RNT fraqmentinin 

denaturasiyası məqsədilə qızdırılaraq, praymer ilə nuklein turşularının hibridizasiyası 

üçün soyudulur. Bir dəfə qızdırılma (denaturasiya), bir dəfə soyudulma (otjiq) və bir 

dəfə reaksiyanın aparılması, bir mərhələ kimi qəbul edilərsə, PZR-i tam şəkildə 

aparmaq üçün 30-50 sikldən istifadə edilir. Reaksiya tam bitdikdən sonra sintez olun-

muş genetik materialın – DNT fraqmentinin miqdarı 200-250 min dəfə artaraq 

molekulyar diaqnostikanın aparılmasına kifayət edir. PZR proqramlaşdırılan avtoma-

tik termostatda – termosikler (amplifikator) adlı cihazda aparılır. Amplifikator qısa 

zaman ərzində reaksiya məhlulunu metodika üzrə tələb olunan sayda qızdıraraq soyu-

dur. 

     Birinci  siklda  –  denaturasiya  adlanan  mərhələdə, nuklein turşusunun ikiləşmə 

prosesi gedir; bir cüt nuklein turşusundan ibarət olan nuklein turşusu iki zəncirə 

ayrılır. Ayrılmış hər bir nuklein turşusunun zənciri sintetik oliqonukleotid praymerlə 

birləşir. Bu mərhələ otjiq adlanır. Reaksiya mərhələsində fermentin iştirakı ilə pray-

merin yerləşdiyi yerdən başlayaraq tələb olunan DNT fraqmentinin sintezi gedir. 

Proqramlaşdırılmış üç temperatur rejiminin təkrar olunması reaksiyanın zəncirvari 

xarakter almasına və tələb olunan DNT fraqmentinin nüsxələrinin həndəsi silsilə üzrə 

artmasına gətirib çıxarır. Aparılan reaksiya təbii replikasiya prosesinə bənzəyir, lakin 

süni sintez edilmiş cintetik oliqonukleotid praymerlər tərəfindən  konkret fraqmentin 

sintezi aparılır. Bir mərhələyə orta hesabla 3 dəqiqə tələb olunursa, təxminən iki saat 

ərzində  tələb olunan DNT fraqmentinin bir milyard nüsxəsini  əldə etmək müm-

 

42


kündür.  İstifadə edilən praymerə uyğun nuklein ardıcıllığı olmayan halda milyon 

digər nuklein ardıcıllıqları olan halda belə PZR getmir. DNT-polimeraza fermenti 

seçicilik qabiliyyətinə malik olaraq lazımsız nukleotidləri qeyri-komplementar nuk-

leotidləri istifadə etmir. PZR nəticəsində əldə edilmiş nukleotid fraqmenti – amplifikat 

elektroforez vasitəsilə  aşkarlanır. PZR-na məruz qalmış DNT fraqmentinin nukleotid 

ardıcıllığı “Sekam”, miqdarı “Real-Time” cihazlarında aparılır. PZR metodunun digər kli-

niki-laborator metodlarından üstünlüyü: 1. universallığında; 2. spesifikliyində; 3. həssas-

lığında; 4. nəticələrin tezliyində; 5. klinikaya qədər və retrospektiv nəticələrin əldə edil-

məsində; 6. miqdarca kiçik obyektlərin analizinin aparılmasında; 7. bir neçə infeksiyanın 

eyni zamanda aşkarlanmasında və 8. əldə edilmiş  nəticələrin ekspertizasının müm-

künlüyündədir. 

     PZR-nın çatışmayan cəhəti ondan ibarətdir ki, analiz yüksək texnologiyanın məh-

sulu olan cihazlardan, yüksək təmizlik və spesifikliyə malik reaktivlərdən istifadə 

edərək, hazırlıqlı mütəxəssislərin iştirakı ilə aparılmalıdır.  

     PZR  metodunun  kliniki  və praktiki əhəmiyyəti olaraq üç suala cavab verir: 1. 

anormal genin və patogen mikrobun olub-olmamasını müəyyənləşdirir; 2. müalicə 

etməli və ya etməməli suallarına əksər hallarda cavab verir  və 3. aparılan terapiyanın 

keyfiyyətinə törədicinin və anormal genin olub-olmamasından asılı olaraq nəzarətin 

aparılması. 

     PZR-nın aparılmasına olan ümumi tələbat: 1-ci mərhələ - xəstənin şikayətlərinin, 

anamnezinin toplanması, kliniki və fiziki müayinəsi; 2-ci mərhələ - kliniki müa-

yinədən irəli gələn rutin kliniki analizlərin; sidiyin, qanın, nəcisin və digər 

müayinələrin aparılması  və 3-cü mərhələ - əvvəlki iki mərhələyə  əsasən xüsusi 

təyinatlı analizlərin; seroloji, immunoloji və instrumental müayinələrin aparılması və 

4-cü mərhələ - molekulyar genetik, əsasən də PZR-nın aparılması. 

 

Nəticələr və onların müzakirəsi 

    Həcmi 0,2 ml olan eppendorf sınaq şüşəsinə 5 mkl genom DNT-si, 20 mkl sintetik 

oliqonukleotid praymerlər, dezoksiribonukleotidlərdən (dATF, dTTF, dQTF və 

dSTF), və 0,2 mkl termostabil DNT-polimeraza fermenti əlavə edilir. DNT fraqmen-

tinin sintezi məqsədilə reaksiya qarışığı bir dəfə  qızdırılma-denaturasiya (92

o

S, 20 



saniyə), bir dəfə soyudulma- otjiq (55

o

S, 30 saniyə) və bir dəfə reaksiyanın aparılması 



ilə bir mərhələ kimi qəbul edilərsə (72

o

S, 40 saniyə), PZR-nı tam şəkildə aparmaq 



üçün 30 sikldən istifadə edilmişdir.  Əldə edilmiş DNT fraqmentinin miqdarı 

qarşımıza qoyulmuş molekulyar diaqnostikanın aparılmasına kifayət etmişdir.  

     β-talassemiyanın üç mutasiyası aşkar edilmişdir: 1. β-Qlobin Geninin (β-QG) bi-

rinci ekzonunun 8-ci kodonunda iki adenin nukleotidinin delesiyası (kodon 8, -AA);  

2. β-QG birinci kiçik intronunda 110-cu vəziyyətdə quanin nukleotidinin adenin nuk-

leotidi ilə əvəzi (IVS-1-110, G-A) və 3. β-QG ikinci böyük intronunda birinci vəziy-

yətdə olan quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə  əvəzi (IVS-II-1, G-A). Hər üç 

mutasiya Respublikanın  əhalisində  aşkar edilmiş talassemiya mutasiyaları arasında 

üstunlük təşkil edərək aşkar edilmiş bütün mutasiyaların 65-70%-ni təşkil edir 

(3,4,7,8 ). 

     Ədəbiyyatın analizinə istinad edərək qeyd edilməlidir ki

o



-IVS-2-1 (Q-A) və 

+



-

IVS-1-110 (Q-A) mutasiyaları 

-qlobin polipeptidinin biosintezini prosessinq mərhə-

ləsini, 


o

-kodon 8 (-AA) mikrodelesiyası stop kodon əmələ  gətirərək transkripsiya 



 

43


prosesini pozur (7).  

     İdentifikasiya edilmiş mutasiyalardan 

o

- və 



+

-fenotopinə malik olmuşdur. 



o

-



fenotipində, 

+



-fenotopindən fərqli olaraq beta qlobin geninin ekspressiyası tamamilə 

pozulur. DNT analizində identifikasiya edilmiz mutasiyalar izoelektrofokuslaşdırma 

yolu ilə alınmış nəticələri təsdiq etmişdir.  

     Q6FD  fermentinin  iki  müxtəlif molekulyar tipləri aşkar edilmişdir. Mutasiyanın 

identifikasiyası fermentin “0” aktivliyi olan hemiziqotlarda aparılmışdır. Birinci genin 

tədqiqi zamanı genin daxilində iki müxtəlif mutasiya identifikasiya edilmişdir: 202-ci 

vəziyyətdə quanin nukleotidinin adeninlə əvəzi və 376-cı vəziyyətdə adenin nukleoti-

dinin quaninlə  əvəzi Q6FD A (-) tipinə xarakterdir. İkinci mutasiya zamanı genin 

563-cü vəziyyətində sitozin nukleotidinin timinlə əvəzi aşkar edilmişdir. Bu mutasiya 

Q6FD B (-) tipinə xarakterdir. Tədqiqatlarımızda talassemiya və Q6FD fermentinin 

Quba və Xaçmaz rayonlarının  əhalisində  aşkar edilmiş mutasiyaları öncədən elmə 

məlum olaraq Aralıq Dənizi hövzəsində yerləşən dövlətlərin  əhalisində  aşkar 

edilmişdir.  

          Beləliklə, PZR-na əsaslanan metodlar kompleksindən istifadə edərək Quba və 

Xaçmaz rayonlarının  əhalisində  təsadüf olunan 

-talassemiya və Q6FD fermentinin 

defisitində  xəstəliyin molekulyar tipi identifikasiya edilmişdir. 

-talassemiyanın üç, 

Q6FD fermentinin defisitində iki mütasiya aşkar edilmişdir. 

 

Nəticə 

1.  β-talassemiyanın üç mutasiyası  aşkar edilmişdir: 1. β-QG birinci ekzonunun 8-ci 

kodonunda iki adenin nukleotidinin delesiyası (kodon 8, -AA);  2. β-QG birinci 

kiçik intronunda 110-cu vəziyyətdə quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə əvəzi 

(IVS-1-110, G-A) və 3. β-QG ikinci böyük intronunda birinci vəziyyətdə olan 

quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə əvəzi (IVS-II-1, G-A). 

2. Q6FD fermentinin iki müxtəlif molekulyar tipləri aşkar edilmişdir. 1. Birinci genin 

daxilində iki mutasiya identifikasiya edilmişdir: 202-ci vəziyyətdə quanin 

nukleotidinin adeninlə  əvəzi və 376-cı  vəziyyətdə adenin nukleotidinin quaninlə 

əvəzi Q6FD A (-) tipinə xarakterdir. İkinci mutasiyada genin 563-cü vəziyyətində 

sitozinin timinlə əvəzi aşkar edilmişdir. Bu mutasiya Q6FD B (-) tipinə xarakterdir. 

 

ƏDƏBİYYAT 

1. Кулиев А.М., Мазурова О.Л., Бирюков В.Б., Матвеева Е.В., Расулов Э.М. и др. Прена-

тальная диагностика бета-талассемии. Акушерство и гинекология, 1991, №7, с. 16-18. 

2. Кулиев А.М., Мазурова О.Л., Бирюков В.Б., Расулов Э.М. и др. Первый случай пре-

натальной диагностики серповидноклеточной анемии в СССР. Гематология и транс-

фузиология, 1990, №3, с. 8-9. 

3.  Расулов Э.М., Ифраимова З.Н., Ширинова И.Л.  Молекулярные формы талассемии у 

населения двух регионов Азербайджанской ССР. Азмеджурнал, 1990, №9, с. 28-31. 

4. Chemberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Caskey C.T. Multipleks PCR for the Diaqnosis 

of Duchenne Muskular Dystrophy. A Guide to Methods and Applications. Edited by 

M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. Academic press inc. New York. 2000, 

p. 272.. 

5. Crescent M. B-Cell Lymphoma: t (14;18) Chromosome Rearrangement. A Guide to Me-

thods and Applications. Edited by M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. 

Academic press inc. New York. 2000,  p. 392. 

 

44


 

45

6. Dacie S.J., Levis S.M. Practical Haematology.London,1999. p.453. 



7. Fyodorov A.P., Rasulov E.M., Nasyrova F., et al. Molecular analysis of 

-thalassemia in 

two Soviet populations. 8

th

 World Congress on Human Genetics, USA, Washington, 1991, 



p.78. 

8. Rasulov E.M., Mamedov K. Yu., Haji-zade B. et al. Thalassemia mutant gene geographical 

distribution in Azerbaijan population. European Association of Gynaecologists and 

Obstetrians, 6

th

 Meeting, Moscow, 1991, p. 101-2. 



9. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. 

Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for 

diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985,  230, p. 1350-1354. 

10. Rorbart H.A. PCR Amplification of Enteroviruses. A Guide to Methods and Applications. 

Edited by M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. Academic press inc. New 

York, 2000, p. 372. 

11. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Попов В.О. и др. Системы экпрессной иммунодетекции 

биологически активных соединений // Клин. лаб. диагн. 2002, в.8, с.25-32. 

12. Pope CF, Capaldi K. Comparison of the analytical sensitivity of three commercial real 

time PCR assays for the detection of MRSA. Poster session presented at: Seventh 

International Conference of the Hospital Infection Society; Liverpool, UK, 2010, Oct. 10-

13. 


 

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА  

ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ  РЕАКЦИИ, И ОБЛАСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 

 

К.А.АЛИЕВА, З.Ф.ЭФЕНДИБЕЙЛИ, Э.М.РАСУЛОВ, Э.Э.РАСУЛОВ  

 

РЕЗЮМЕ 

 

     Описываются  принципы  и  области  применения  метода  полимеразно-цепной  реак-

ции. Представлены экспериментальные результаты по изучению мутаций β-талассемии 

и  гена  недостаточности  фермента  глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы  методом  высоко-

температурной  аллель-специфической  амплификации  у  населения  Кубинского  и  Хач-

масского районов Азербайджанской Республики. 

 

 

POLYMERASE CHAIN REACTION BASED DIAGNOSTIC  



METHODS AND AREAS OF THEIR USE 

 

K.A.ALIYEVA, Z.F.AFANDIBAYLI, E.M.RASULOV, E.E.RASULOV  

 

SUMMARY 

 

       The principle and areas of use for polymerase chain reaction are described. Experimental 

results on β-thalassaemia and glucose-6 phosphate-dehydrogenase mutations are studied by 

the amplification refractory mutation system method in the population of Guba and Khachmas 



regions of the Azerbaijan Republic . 

 

Document Outline

  •  BAKI UNİVERSİTETİNİN XƏBƏRLƏRİ


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2016
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə