Baki universitetiNİn xəBƏRLƏRİ
Yüklə 246,64 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- POLYMERASE CHAIN REACTION BASED DIAGNOSTIC METHODS AND AREAS OF THEIR USE K.A.ALIYEVA, Z.F.AFANDIBAYLI, E.M.RASULOV, E.E.RASULOV
|
BAKI UNİVERSİTETİNİN XƏBƏRLƏRİ №3 Təbiət elmləri seriyası 2010
POLİMERAZA-ZƏNCİRVARİ REAKSİYASINA ƏSASLANAN DİAQNOSTİK METODLAR VƏ TƏTBİQ SAHƏLƏRİ K.Ə.ƏLİYEVA, Z.F.ƏFƏNDİBƏYLİ, E.M.RƏSULOV, E.E.RƏSULOV Bakı Dövlət Universiteti, GEN LAB kama_fuadik@mail.ru Polimeraza-zəncirvari reaksiyası metodunun prinsipləri və tətbiq sahələri şərh edilir. Azərbaycan Respublikasının Quba və Xaçmaz rayonlarının əhalisində yüksək temperaturlu allel-spesifik amplifikasiya metodu vasitəsilə beta-talassemiya mutasiyasının və qlükoza-6- fosfatdehidrogenaza fermentinin çatışmazlığının öyrənilməsinin eksperimental nəticələri verilir. Molekulyar biologiya və molekulyar genetika elmlərinin inkişafı bir sıra yeni diaqnostika üsullarının işlənib hazırlanmasına səbəb olmuşdur ki, bu da öz növbə- sində molekulyar diaqnostikanın, molekulyar təbabətin sürətlə inkişafına səbəb olmuşdur. Kəşflərdən ən əhəmiyyətlisi hüceyrə bölünməsində mövcud replikasiya prosesinin in vitro təkrarı olan “Polimeraza Zəncirvari Reaksiyasıdır” (PZR). PZR üsulunun kəşfinə görə yapon mənşəli amerika alimi Saiki 1988-ci ildə biologiya elmi sahəsində Nobel mükafatına layiq görülmüşdür. PZR metodu üçün çox az bioloji material (DNT və RNT) tələb olunur. Hətta bir hüceyrədən alınmış genetik material səviyyəsində belə genetik patalogiyası məlum olan istənilən irsi xəstəliyin diaqnos- tikasını aparmaq mümkündür. Bioloji materialın – cift hüceyrələrinin (xorion hü- ceyrələri), amniotik məhlulun fibroblastlarının az miqdarı ilə PZR metodunun iştirakı ilə bir sıra irsi xəstəliklərin ana bətnində erkən prenatal diaqnostikası mümkün olmuş- dur. Prenatal diaqnostikası mümkün olan irsi xəstəliklərdən; α-talassemiyanı, β-talas- semiyanı, ayparaşəkilli anemiyanı, Hemofiliya A və Hemofiliya B-ni, Qentinqton Xoreyasını, Düşen Sindromunu, Hemoxromatozu, qlyukozo-6-fosfatdehidroqenaza fermentinin (Q6FD) çatışmazlığını, Zandqoff xəstəliyini və s. göstərmək olar (4, 5, 10, 11, 12). 1988-1994-cü illər ərzində Azərbaycan Respublikasının ET Mamalıq və Gine- kologiya İnstitutunun Tibbi-genetika laboratoriyasının əməkdaşları PZR-na əsaslanan molekulyar diaqnostikadan istifadə edərək Rusiya Elmlər Akademiyasının Mole- kulyar Genetika İnstitutunun “İnsan Genetikası”, Tibbi Elmlər Akademiyasının Tibbi- Genenika İnstitutunun “Prenatal Diaqnostika” laboratoriyaları və İtaliyanın Sardiniya adasında yerləşən “Prenatal Diaqnostika” mərkəzi (Kalyari şəhəri) ilə birlikdə Res- publikanın əhalisində β-talassemiyanın 23 müxtəlif mutasiyası aşkar edilərək identifi- kasiyasını aparmışdır (3,7,8).
41
1989-cu ildə SSRİ-də ilk dəfə olaraq β-talassemiyanın, 1990-cı ildə oraqvari hüceyrə anemiyasının ana bətnində prenatal diaqnostikası Azərbaycan Respub- likasının ET Mamalıq və Ginekologiya İnstitutunun Tibbi-genetika laboratoriyasının və Rusiyanın Tibbi Genetika İnstitutunun Prenatal Diaqnostika laboratoriyasının əməkdaşları tərəfindən iki azərbaycanlı ailəsində aparılmışdır (1,2). Tədqiqatlarımızda məqsədimiz PZR əsaslanan metodlar kompleksindən istifadə edərək Azərbaycan Respublikasının əhalisində təsadüf edən irsi qan xəstəliklərindən, beta-talassemiyanın və Q6FD molekulyar tiplərinin identifikasiyası olmuşdur.
Eksperimental material Quba və Xaçmaz rayonlarının əhalisinin genetik tədqi- qatları zamanı toplanmışdır. Analiz üçün həcmi 3-5 ml olan venoz qandan istifadə edilmişdir. Talassemiyanın diaqnostikası izoelektrofokuslaşdırma, Q6FD fermentinin aktivliyi Beutler tərəfindən təklif edilmiş metodlar vasitəsilə aparılmışdır (6). Polimeraza-zəncirvari reaksiyası metodunun prinsipi (9). Metodun əsasında nuk- lein turşularının (DNT və RNT) unikal xüsusiyyəti – ozünün reproduksiyası durur. Bu xüsusiyyətdən istifadə edərək sınaq şüşəsində in vitro süni olaraq nuklein turşusunun spesifik fraqmentinin əlavə kopiyası alınır. PZR metodunu aparmazdan əvvəl kopiya- sının çıxarılması tələb olunan nuklein turşusunun birincili strukturu – nukleotid ardı- cıllığı müəyyən edilməlidir. Fraqmentin nukleotid ardıcıllığı müəyyən edildikdən sonar hədəf nukleotid fraqmentinə komplementar olan iki sintetik DNT-zond və ya praymer sintez edilir. Praymer PZR-da ən əsas element olaraq spesifik reaksiyanın başlanmasına təkan verir. Beləliklə, PZR üçün test tədqiq edilən nuklein turşuların- dan, praymerdən, dezoksiribonukleotidlərdən (dATF, dTTF, dQTF və dSTF), ter- moatabil DNT-polimerazadan (Termus aquaticus adlı termofil bakteriyanın fermenti) ibarət olmalıdır. Nuklein turşusunun fraqmentinin sintezi məqsədilə reaksiya qarışığı olan PZR testi sınaq süsəsi ilə birlikdə təkrar olaraq DNT və ya RNT fraqmentinin denaturasiyası məqsədilə qızdırılaraq, praymer ilə nuklein turşularının hibridizasiyası üçün soyudulur. Bir dəfə qızdırılma (denaturasiya), bir dəfə soyudulma (otjiq) və bir dəfə reaksiyanın aparılması, bir mərhələ kimi qəbul edilərsə, PZR-i tam şəkildə aparmaq üçün 30-50 sikldən istifadə edilir. Reaksiya tam bitdikdən sonra sintez olun- muş genetik materialın – DNT fraqmentinin miqdarı 200-250 min dəfə artaraq molekulyar diaqnostikanın aparılmasına kifayət edir. PZR proqramlaşdırılan avtoma- tik termostatda – termosikler (amplifikator) adlı cihazda aparılır. Amplifikator qısa zaman ərzində reaksiya məhlulunu metodika üzrə tələb olunan sayda qızdıraraq soyu- dur. Birinci siklda – denaturasiya adlanan mərhələdə, nuklein turşusunun ikiləşmə prosesi gedir; bir cüt nuklein turşusundan ibarət olan nuklein turşusu iki zəncirə ayrılır. Ayrılmış hər bir nuklein turşusunun zənciri sintetik oliqonukleotid praymerlə birləşir. Bu mərhələ otjiq adlanır. Reaksiya mərhələsində fermentin iştirakı ilə pray- merin yerləşdiyi yerdən başlayaraq tələb olunan DNT fraqmentinin sintezi gedir. Proqramlaşdırılmış üç temperatur rejiminin təkrar olunması reaksiyanın zəncirvari xarakter almasına və tələb olunan DNT fraqmentinin nüsxələrinin həndəsi silsilə üzrə artmasına gətirib çıxarır. Aparılan reaksiya təbii replikasiya prosesinə bənzəyir, lakin süni sintez edilmiş cintetik oliqonukleotid praymerlər tərəfindən konkret fraqmentin sintezi aparılır. Bir mərhələyə orta hesabla 3 dəqiqə tələb olunursa, təxminən iki saat ərzində tələb olunan DNT fraqmentinin bir milyard nüsxəsini əldə etmək müm-
42
kündür. İstifadə edilən praymerə uyğun nuklein ardıcıllığı olmayan halda milyon digər nuklein ardıcıllıqları olan halda belə PZR getmir. DNT-polimeraza fermenti seçicilik qabiliyyətinə malik olaraq lazımsız nukleotidləri qeyri-komplementar nuk- leotidləri istifadə etmir. PZR nəticəsində əldə edilmiş nukleotid fraqmenti – amplifikat elektroforez vasitəsilə aşkarlanır. PZR-na məruz qalmış DNT fraqmentinin nukleotid ardıcıllığı “Sekam”, miqdarı “Real-Time” cihazlarında aparılır. PZR metodunun digər kli- niki-laborator metodlarından üstünlüyü: 1. universallığında; 2. spesifikliyində; 3. həssas- lığında; 4. nəticələrin tezliyində; 5. klinikaya qədər və retrospektiv nəticələrin əldə edil- məsində; 6. miqdarca kiçik obyektlərin analizinin aparılmasında; 7. bir neçə infeksiyanın eyni zamanda aşkarlanmasında və 8. əldə edilmiş nəticələrin ekspertizasının müm- künlüyündədir. PZR-nın çatışmayan cəhəti ondan ibarətdir ki, analiz yüksək texnologiyanın məh- sulu olan cihazlardan, yüksək təmizlik və spesifikliyə malik reaktivlərdən istifadə edərək, hazırlıqlı mütəxəssislərin iştirakı ilə aparılmalıdır. PZR metodunun kliniki və praktiki əhəmiyyəti olaraq üç suala cavab verir: 1. anormal genin və patogen mikrobun olub-olmamasını müəyyənləşdirir; 2. müalicə etməli və ya etməməli suallarına əksər hallarda cavab verir və 3. aparılan terapiyanın keyfiyyətinə törədicinin və anormal genin olub-olmamasından asılı olaraq nəzarətin aparılması. PZR-nın aparılmasına olan ümumi tələbat: 1-ci mərhələ - xəstənin şikayətlərinin, anamnezinin toplanması, kliniki və fiziki müayinəsi; 2-ci mərhələ - kliniki müa- yinədən irəli gələn rutin kliniki analizlərin; sidiyin, qanın, nəcisin və digər müayinələrin aparılması və 3-cü mərhələ - əvvəlki iki mərhələyə əsasən xüsusi təyinatlı analizlərin; seroloji, immunoloji və instrumental müayinələrin aparılması və 4-cü mərhələ - molekulyar genetik, əsasən də PZR-nın aparılması.
Həcmi 0,2 ml olan eppendorf sınaq şüşəsinə 5 mkl genom DNT-si, 20 mkl sintetik oliqonukleotid praymerlər, dezoksiribonukleotidlərdən (dATF, dTTF, dQTF və dSTF), və 0,2 mkl termostabil DNT-polimeraza fermenti əlavə edilir. DNT fraqmen- tinin sintezi məqsədilə reaksiya qarışığı bir dəfə qızdırılma-denaturasiya (92 o S, 20 saniyə), bir dəfə soyudulma- otjiq (55 o S, 30 saniyə) və bir dəfə reaksiyanın aparılması ilə bir mərhələ kimi qəbul edilərsə (72 o S, 40 saniyə), PZR-nı tam şəkildə aparmaq üçün 30 sikldən istifadə edilmişdir. Əldə edilmiş DNT fraqmentinin miqdarı qarşımıza qoyulmuş molekulyar diaqnostikanın aparılmasına kifayət etmişdir. β-talassemiyanın üç mutasiyası aşkar edilmişdir: 1. β-Qlobin Geninin (β-QG) bi- rinci ekzonunun 8-ci kodonunda iki adenin nukleotidinin delesiyası (kodon 8, -AA); 2. β-QG birinci kiçik intronunda 110-cu vəziyyətdə quanin nukleotidinin adenin nuk- leotidi ilə əvəzi (IVS-1-110, G-A) və 3. β-QG ikinci böyük intronunda birinci vəziy- yətdə olan quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə əvəzi (IVS-II-1, G-A). Hər üç mutasiya Respublikanın əhalisində aşkar edilmiş talassemiya mutasiyaları arasında üstunlük təşkil edərək aşkar edilmiş bütün mutasiyaların 65-70%-ni təşkil edir (3,4,7,8 ). Ədəbiyyatın analizinə istinad edərək qeyd edilməlidir ki, o -IVS-2-1 (Q-A) və + - IVS-1-110 (Q-A) mutasiyaları -qlobin polipeptidinin biosintezini prosessinq mərhə- ləsini,
o -kodon 8 (-AA) mikrodelesiyası stop kodon əmələ gətirərək transkripsiya 43
prosesini pozur (7). İdentifikasiya edilmiş mutasiyalardan o
+ -fenotopinə malik olmuşdur. o - fenotipində, + -fenotopindən fərqli olaraq beta qlobin geninin ekspressiyası tamamilə pozulur. DNT analizində identifikasiya edilmiz mutasiyalar izoelektrofokuslaşdırma yolu ilə alınmış nəticələri təsdiq etmişdir. Q6FD fermentinin iki müxtəlif molekulyar tipləri aşkar edilmişdir. Mutasiyanın identifikasiyası fermentin “0” aktivliyi olan hemiziqotlarda aparılmışdır. Birinci genin tədqiqi zamanı genin daxilində iki müxtəlif mutasiya identifikasiya edilmişdir: 202-ci vəziyyətdə quanin nukleotidinin adeninlə əvəzi və 376-cı vəziyyətdə adenin nukleoti- dinin quaninlə əvəzi Q6FD A (-) tipinə xarakterdir. İkinci mutasiya zamanı genin 563-cü vəziyyətində sitozin nukleotidinin timinlə əvəzi aşkar edilmişdir. Bu mutasiya Q6FD B (-) tipinə xarakterdir. Tədqiqatlarımızda talassemiya və Q6FD fermentinin Quba və Xaçmaz rayonlarının əhalisində aşkar edilmiş mutasiyaları öncədən elmə məlum olaraq Aralıq Dənizi hövzəsində yerləşən dövlətlərin əhalisində aşkar edilmişdir. Beləliklə, PZR-na əsaslanan metodlar kompleksindən istifadə edərək Quba və Xaçmaz rayonlarının əhalisində təsadüf olunan -talassemiya və Q6FD fermentinin defisitində xəstəliyin molekulyar tipi identifikasiya edilmişdir. -talassemiyanın üç, Q6FD fermentinin defisitində iki mütasiya aşkar edilmişdir.
1. β-talassemiyanın üç mutasiyası aşkar edilmişdir: 1. β-QG birinci ekzonunun 8-ci kodonunda iki adenin nukleotidinin delesiyası (kodon 8, -AA); 2. β-QG birinci kiçik intronunda 110-cu vəziyyətdə quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə əvəzi (IVS-1-110, G-A) və 3. β-QG ikinci böyük intronunda birinci vəziyyətdə olan quanin nukleotidinin adenin nukleotidi ilə əvəzi (IVS-II-1, G-A). 2. Q6FD fermentinin iki müxtəlif molekulyar tipləri aşkar edilmişdir. 1. Birinci genin daxilində iki mutasiya identifikasiya edilmişdir: 202-ci vəziyyətdə quanin nukleotidinin adeninlə əvəzi və 376-cı vəziyyətdə adenin nukleotidinin quaninlə əvəzi Q6FD A (-) tipinə xarakterdir. İkinci mutasiyada genin 563-cü vəziyyətində sitozinin timinlə əvəzi aşkar edilmişdir. Bu mutasiya Q6FD B (-) tipinə xarakterdir.
1. Кулиев А.М., Мазурова О.Л., Бирюков В.Б., Матвеева Е.В., Расулов Э.М. и др. Прена- тальная диагностика бета-талассемии. Акушерство и гинекология, 1991, №7, с. 16-18. 2. Кулиев А.М., Мазурова О.Л., Бирюков В.Б., Расулов Э.М. и др. Первый случай пре- натальной диагностики серповидноклеточной анемии в СССР. Гематология и транс- фузиология, 1990, №3, с. 8-9. 3. Расулов Э.М., Ифраимова З.Н., Ширинова И.Л. Молекулярные формы талассемии у населения двух регионов Азербайджанской ССР. Азмеджурнал, 1990, №9, с. 28-31. 4. Chemberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Caskey C.T. Multipleks PCR for the Diaqnosis of Duchenne Muskular Dystrophy. A Guide to Methods and Applications. Edited by M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. Academic press inc. New York. 2000, p. 272.. 5. Crescent M. B-Cell Lymphoma: t (14;18) Chromosome Rearrangement. A Guide to Me- thods and Applications. Edited by M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. Academic press inc. New York. 2000, p. 392.
44
45 6. Dacie S.J., Levis S.M. Practical Haematology.London,1999. p.453. 7. Fyodorov A.P., Rasulov E.M., Nasyrova F., et al. Molecular analysis of -thalassemia in two Soviet populations. 8 th World Congress on Human Genetics, USA, Washington, 1991, p.78. 8. Rasulov E.M., Mamedov K. Yu., Haji-zade B. et al. Thalassemia mutant gene geographical distribution in Azerbaijan population. European Association of Gynaecologists and Obstetrians, 6 th Meeting, Moscow, 1991, p. 101-2. 9. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 1985, 230, p. 1350-1354. 10. Rorbart H.A. PCR Amplification of Enteroviruses. A Guide to Methods and Applications. Edited by M.A.Innis, D.H.Gelfan, J.J. Sninsky and T.J.White. Academic press inc. New York, 2000, p. 372. 11. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Попов В.О. и др. Системы экпрессной иммунодетекции биологически активных соединений // Клин. лаб. диагн. 2002, в.8, с.25-32. 12. Pope CF, Capaldi K. Comparison of the analytical sensitivity of three commercial real time PCR assays for the detection of MRSA. Poster session presented at: Seventh International Conference of the Hospital Infection Society; Liverpool, UK, 2010, Oct. 10- 13.
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ, И ОБЛАСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ К.А.АЛИЕВА, З.Ф.ЭФЕНДИБЕЙЛИ, Э.М.РАСУЛОВ, Э.Э.РАСУЛОВ РЕЗЮМЕ Описываются принципы и области применения метода полимеразно-цепной реак- ции. Представлены экспериментальные результаты по изучению мутаций β-талассемии и гена недостаточности фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы методом высоко- температурной аллель-специфической амплификации у населения Кубинского и Хач- масского районов Азербайджанской Республики.
METHODS AND AREAS OF THEIR USE K.A.ALIYEVA, Z.F.AFANDIBAYLI, E.M.RASULOV, E.E.RASULOV SUMMARY The principle and areas of use for polymerase chain reaction are described. Experimental results on β-thalassaemia and glucose-6 phosphate-dehydrogenase mutations are studied by the amplification refractory mutation system method in the population of Guba and Khachmas regions of the Azerbaijan Republic . Document Outline
Yüklə 246,64 Kb. Dostları ilə paylaş:
|