Combinatorial thinking in chemistry and biology

www.pnas.org
.
Abbreviation: hGH, human growth hormone.
2779
Downloaded from https://www.pnas.org by 213.230.111.12 on June 5, 2023 from IP address 213.230.111.12.

---

specifically encode enormous numbers of molecular sequences
in a retrievable format (i.e., the DNA sequence of viral or
bacterial clones), a synthetic small-molecule library must
either incorporate an interpretable, unique synthetic code that
is physically associated with each molecule or alternatively the
library must be designed in a ‘‘spatially addressable’’ manner,
meaning that the chemical structure of each molecule may be
inferred from its actual position in the library. Since such
methods require that each individual molecular type be syn-
thesized in a separate reaction ‘‘vessel,’’ the resulting synthetic
combinatorial libraries are usually limited to a diversity of
thousands of compounds, reflecting the current limits of
hardware and software in addressing individual compounds.
The third feature of combinatorial experimentation, after
the design and synthesis of the library, is the screening process
itself. The methods employed can be very diverse, ranging
from chromatographic affinity selection for specific binding
partners from a communal pool of all the members of the
library to enzyme inhibition assays performed on each indi-
vidual compound in a spatially addressable system. Finally,
with the right screening procedure, any combinatorial strategy
in which library diversity is created through recombinant DNA
methods can be improved by a cyclical process of selection and
optimization, in a manner that has been likened to ‘‘molecular
evolution’’ in the test tube. In such a manner, initial hits can
be transformed into tight-binding leads for further develop-
ment.
As illustrated in two different examples during the session,
combinatorial methods are now being used to select for a wide
array of potentially useful molecules (Fig. 1 and Table 1). The
F
IG
. 1.
Schematic illustrations of two strategies of combinatorial synthesis and screening summarized in this session. (A) Small molecule libraries
synthesized using separate types of reactants for each variable position on the final molecule. The theoretical diversity of the library of compounds
is limited only by the number of available reagents for each position on the growing molecule. In practice, however, the compounds in the library
are not ‘‘encoded’’ with decipherable information that describes their chemical composition. Therefore, most small molecule libraries are
synthesized so that each compound is ‘‘spatially addressable.’’ For example, compounds may be synthesized while immobilized on a resin so that
aliquots of the growing sets of molecules may be split at each step, resulting in a single molecular species at each position in the library. Alternatively,
a unique combination of reagents may be coupled in each of many different reaction ‘‘vessels,’’ such as wells in microtiter plates. In either case,
the identity of any compound in the library is defined by its physical position in the synthetic matrix. The limiting factor is generally the ability of
the experimenter and the hardware to cope with a large number of separate reaction products and the difficulty of adapting synthetic reactions
to proceed to completion in a spatially addressable format. (B) The combinatorial synthesis or mutational variation of proteins or oligonucleotides
can often be used to create a library of many millions of separate DNA, RNA, or protein molecules. Such molecules may be encoded by recombinant
DNA and expressed with high fidelity (synthesized) by bacterial or viral clones containing that DNA. Therefore, any single clone possesses both
the actual molecule being screened and the genetic information encoding that molecule. Enormous numbers of clones may be screened en masse;
a single positive clone may be amplified by passaging that virus to regenerate all the unique information relating to that molecule. For example,
in the work described by Wells, variants of the hGH protein were all produced and displayed by virus clones on their external surface, using a method
called ‘‘phage (viral) display.’’ The recovery of a single viral copy with the desired binding affinity of the mutated hormone for its receptor allows
subsequent amplification and sequencing of the DNA information for that particular molecule.
2780
From the Academy: Ellman et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)
Downloaded from https://www.pnas.org by 213.230.111.12 on June 5, 2023 from IP address 213.230.111.12.

---

first talk described the synthesis and screening of synthetic
libraries of small organic compounds, all related to a parent
molecule that is capable of inhibiting a specific class of
enzymes. The second talk described the generation and screen-
ing of mutant variants of a cytokine growth factor, in search of
a protein molecule that acts as an antagonist of the normal
hormone receptor. These two talks provided a direct contrast
between synthetic and genetic combinatorial techniques. The
diversity of the libraries and the methods of screening and
identifying useful compounds are quite different; however, a
number of unifying features are present in both projects
(summarized in Table 1):
(i) Both projects generate and screen a huge number of
molecules that might bind to a specific macromolecule target
(an enzyme or receptor) with the goal of discovering novel
molecules that elicit a desired therapeutic effect in the organ-
ism.
(ii) Both projects are designed to generate a drug lead
through combinatorial diversification of an initial molecule.
An important issue addressed by both investigators is whether
to bias the design of the library toward a specific ‘‘privileged’’
structure or conduct a more random combinatorial synthesis.
(iii) Both projects describe a library in which the theoretical
diversity (defined by the number of synthetically available sites
and the number of building blocks to be selected from at each
site) is much greater than the actual diversity of the library
attained during screening. In both cases, a successful screen is
conducted for useful molecules, indicating that sparse sam-
pling of all possible variants using combinatorial screening is
an effective strategy.