İnvazif aspergillozun mikrobiyolojik tanisinda karşilaşilan sorunlar dr. Şebnem Şenol celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi

İNVAZİF ASPERGİLLOZUN MİKROBİYOLOJİK TANISINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR
Dr. Şebnem ŞENOL

Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi

İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Son yıllarda invazif aspergilloz klinik mikolojinin en çok önemsenen konularından biri olmuştur. Başta kök hücre nakli yapılan hematolojik maligniteli hastalar olmak üzere pek çok BSB, yoğun bakımda kalan, kronik akciğer hastalığı olan, hatta bağışıklık sistemi tamamıyla normal hastalarda neden olduğu mortalitesi yüksek bu infeksiyona rastlanma olasılığı giderek artmaktadır (1,2). Erken tanı ve zamanında tedavi kritik bir önem taşır ancak prognozu etkileyen tek faktör erken tanı değildir. Hastanın bağışıklık sisteminin toparlanması tedavi yanıtında önemli faktörlerden biridir (1). Bu nedenle prognoz için değiştirilebilir en önemli faktör tanı süresini kısaltmak gibi görülmektedir. Ancak günümüzde uygulanan tanı yöntemleri ya zor yöntemlerdir ya da her klinik tablo için uygun olmayabilir (2).

Günümüzde halen çözülmemiş bir klinik konu olan invazif aspergillozun tanısı için kullanılan pek çok yöntem olmasında karşın tanı yöntemlerinin standardizasyonu için uluslar arası kararlar alınmaktadır (3). Tanıda kullanılabilecek pek çok yöntem olmasına karşın kimi zaman hastanın durumu kimi zaman da etkenin özellikleri nedeni ile tanının geç koyulması tedaviyi geciktirerek hastalığın prognozunu daha da kötüleştirebilir.

Direkt yöntemler ve kültür
İnvazif aspergillozun kesin tanısında etkenin doğrudan yöntemler ile gösterilmesi en az kültür kadar duyarlıdır ve kültürden daha hızlı sonuçlanır. Doku biyopsisinde doku invazyonunun gösterilmesi diğer filamentöz mantarlar (Penicillium spp ve Scedosporium spp) ile ayrımının yapılması gereklidir. Direkt yayma veya %10 potasyum hidroksit ile hazırlanan preparatlarda da hifler görülebilirse de spesifik boyalar ve flüoresans tekniklerin sensitiviteleri daha yüksektir (4). Yaygın kullanılan periyodik asit-Schiff (PAS) veya Gomori’nin metenamin gümüş boyası (Gomori’s methenamine silver stain; GMS) ile Aspergillus’un hyalin septalı hiflerinin, septalı hiflerin dar açı ile biribirine eşit dallanması (dichotomous), doku invazyonunun tipik özelliğidir. GMS ile mantar elemanlarını daha iyi boyamakla birlikte, PAS konak doku strüktürünü, hücresel yapıyı daha iyi göstermektedir. Bu nedenle GMS ve PAS birbirinin tamamlayıcısı olarak kullanılmaktadır (4,5).

Fungal hücre duvarındaki polisakkaritlere bağlanarak flüoresan mikroskopta görünür hale getiren flüoresan boyalar Aspergillus’lar için spesifik olmamakla birlikte oldukça sensitiftir. Frozen veya parafin bloklar için kullanılabildiği gibi korneal kazıntı ve bronko-alveoler lavaj örnekleri de bu yöntemle mantarlar açısından incelenebilir (6). İmmünhistokimyasal yöntemler (in situ hibridizasyon ve immünflüoresan yöntemler) henüz çok yaygınlaşmamış yöntemlerdir. Tür spesifik verileri ve tanısal kesinliği çok avantajlı olsa da rutin klinik mikrobiyoloji laboratuarına ne kadar girdiği tartışmalıdır (7).

Aspergillus’un kültür ile elde edilmesi antifungal duyarlılığın da bilinmesini sağlar. Tedaviyi de yönlendiren ideal tanı yöntemlerinden biridir. Ancak kültür diğer yöntemlere göre az duyarlı ve yavaştır. Aspergillus pek çok katı veya sıvı besiyerinde kolayca ürer. Ancak örnek alımı sırasında Aspergillus şüphesi varsa Saburaud dekstroz agar (SDA) gibi mantar spesifik besiyeri kullanılması etkeni üretme şansını arttıracaktır. Besiyerlerine patojen olmayan mantarların üremesini engellemek için koyulan sikloheksimid Aspergillus’ların da üremesini engelleyebilir. Steril bölgelerden alınan örnekler kesin tanı koydurucu olur. Uygun alınan ve enkübe edilen steril örneklerde (beyin omurilik sıvısı veya iğne biyopsileri) etken üretilebilir. Kan kültüründe üreme çok nadirdir (8,9). Buna karşın steril olmayan örneklerde, solunum sekresyonları gibi, etkenin üretilmesinin duyarlılığı düşüktür (8). Üreyen etkenin tanımlanması ve duyarlılık testlerinin, basit mikrobiyoloji laboratuarında ve bu konuda özel eğitim almamış kişiler tarafından yapılması mümkün değildir.

Tüm bu avantajlarına rağmen örneklerin elde edilmesi için muhakkak invazif prosedürler gereklidir. Ancak biyopsi alınacak olan hastalar genelde immünsüpresif, eşlik eden ciddi hastalıkları olan veya yoğun bakımda kalan hastalar olduğundan invazif prosedürler potansiyel riskler nedeni ile uygulanamamaktadır. Ayrıca direkt teknikler –tür spesifik sonuç veren in situ hibridizasyon türe dayalı olarak antifungal duyarlılık kakında kısmen fikir verebilir- antifungal duyarlılık hakkında hiçbir fikir vermez. Ayrıca tekniklerin uygulanabilirliği merkezin laboratuar olanakları ile yakından ilişkilidir. Tekniklerin tümü iyi laboratuar şartları ve tecrübeli personel gerektirir (10).

Galaktomannan antijeninin saptanması
Galaktomannan Aspergillus ve Penicilium türlerinin hücre duvarlarında bulunan ısıya dayanıklı bir heteropolisakkarittir. Saptanması için kullanılan ticari kitler mevcuttur. Galaktomannan salınımı ve dolaşımdaki kinetiği bilinmemektedir. Galaktomannan salınımını etkenin çoğalma fazı, infeksiyon odağının mikroçevresi ve konak bağışıklık yanıtı yakından etkiler. Tüm bunlar galaktomannanın spesifik tanı değerini azaltabilmektedir.

Örneklerde galaktomannan antijeninin saptanması için iki yöntem bulunmaktadır, biri lateks aglütinasyon diğeri de sandviç “Enzym Immun Assay” (EIA) yöntemidir. Her iki test de rutinde kullanılmaktadır, ancak nükslerde LA testinin belirleyiciliği EIA’den daha düşüktür (11).

Galaktomannan LA testinin invazif aspergillozun erken tanısında duyarlılığı düşük olmakla birilikte, kültürler negatif kaldığında ve seri örnekler alınması durumunda tanıya katkıda bulunduğu bilinmektedir (12). Son yayınlarda allojeneik kemik iliği transplantasyonu (AKİT) yapılan hastalarda invazif aspergilloz tanısında EIA ile galaktomannan antijeni aranması yönteminin özgüllüğü % 97.5, duyarlılığı % 92.1, pozitif prediktif değeri % 87.5, negatif prediktif değeri % 98.5 olarak bulunmuştur (13). Penack ve arkadaşları galaktomannan antijeni saptanmasının BAL’da seruma göre daha duyarlı olduğunu göstermişlerdir (14). BAL’da kistik fibrozlularla kronik obstrüktif akciğer hastalığı olanlarda geçici bir yalancı pozitiflikle karşılaşılabildiği bilinmektedir. Serum galaktomannan antijeni için monoklonal sandviç EIA’ya ilişkin deneyimler arttıkça, yalancı pozitif deneylerin de artma eğilimi gösterdiği ve subklinik infeksiyon, sindirim sisteminde kolonizasyon, siklofosfamid ile çapraz reaksiyon, piperasilin tazobaktam başta olmak üzere beta laktam antibiyotik kullanımı, aspergillus dışındaki mantar infeksiyonları, çoklu elektrolitler içeren sıvılar ile uygulanan tedavi gibi çeşitli koşullarla ilişkili olarak yalancı pozitiflikler saptandığı belirtilmiştir (8). Galaktomannan antijeninin AKİT hastalarında İA açısından izlem amacıyla kullanıldığında yalancı pozitif sonuçların en sıklıkla hücre baskılayıcı tedaviden sonraki ilk iki haftada gözlendiği bilinmektedir. Kemoterapi veya radyasyonla yıkıma uğrayan bağırsak mukozasından gıdalarla alınan galaktomannan antijeninin fazla absorpsiyonuna bağlanmıştır. (15).
(1,3)-β-D glukan saptanması
(1,3)-β-D glukan, mantar hücre duvarının tanısal amaçla kullanılan bir elemanıdır. Cryptococcus spp. ve Zigomiçetes türleri gibi istisnalar dışında pek çok mantarın yapısında vardır. Aspergillus dışında Candida spp, Fusarium spp, Acremonium spp, ve Pneumocystis jiroveci gibi benzer hasta grubunda sık karşılaşılabilen invazif fungal infeksiyona neden olabilen bazı türlerin duvar yapısında bulunuyor olması testin invazif aspergillozdaki spesifik tanı rolünü kısıtlamaktadır. İnvaziv fungal infeksiyonların tanısını koyabilmek amacı ile (1,3)-β-D glukan saptayabilen pek çok kit mevcuttur.

Kanda bulunan serin proteaz inhibitörlerinin ön işlem ile etkisiz hale getirilmesi gerekliliği testin ihmal edilmemesi gereken bir komponentidir. Kandidaların neden olduğu invazif infeksiyonlarda nötropenik olmayan hastalarda pozitif sınır değeri belirlenmiş olmasına karşın, aspergillus türleri ile oluşan infeksiyonlarda bu sınırlar bilinmemektedir (16).

(1,3)-β-D glukan testinin antifungal tedavi sırasındaki durumu hakkında kesinleşmiş bir bilgi yoktur. Hemodiyaliz, kalp akciğer cerrahisi, immünglobülinler ile yapılan tedaviler, glukan içeren tıbbi malzemelere maruziyet durumlarında yalancı pozitif sonuçlar alınabilir. Çevresel (1,3)-β-D glukan maruziyeti olasılığı testin değerini azaltmaktadır (16).
Aspergillus türlerine karşı oluşan antikorların saptanması
Kronik pulmoner aspergillozun tanısında Aspergillus’lara karşı spesifik antikor tanımlanması önemli bir yer tutar. Ancak akut invazif aspergillozun tanısında değer taşımadığını gösteren çalışmalar mevcuttur (17). Kanıtlanmış invazif aspergillozlu hastaların sadece 1/3’ünde antikor saptanabilmektedir. Bu test nötropenik olmayan hastaların subakut Aspergillus infeksiyonlarının tanısında yardımcı olabilir. Bağışıklık sistemi toparlanma döneminde olan daha önceden ciddi bir şekilde BSB dönemi geçirmiş olan hastalarda geriye dönük olarak invazif aspergilloz öyküsünü kanıtlayabilecek bir test olabilir (10).
Aspergillus metabolitlerinin saptanması
Aspergillus’lar neden oldukları infeksiyonlar sırasında çeşitli metabolitler üretirler. Bunlardan en iyi bilinenler metalloproteazlar, fosfolipazlar, D-mannitol ve gliotoksindir (10). Üzerinde en çok araştırma yapılan ve en eski bilinen D-mannitol iyi bir tanı testi olmasına rağmen ölçüm metodunun zor olması klinik kullanımını sınırlamaktadır (10,18). Mikotoksin başta olmak üzere diğer metabolitler araştırma aşamasında olan yöntemlerdir (19).
Nükleik asit tespit yöntemleri
Mantar infeksiyonlarında konağın özelliği ve hastalığın ağır seyri nedeni ile hız ve kesin sonuç alınan tanı yöntemleri hayati önem taşımaktadır. Dolayısıyla nükleik asit tespitine dayalı tanı yolları gündeme gelmiş, daha çok yeni ve klinik kullanımları maliyet ve profesyonel personel ihtiyacı nedeni ile sınırlı olmakla beraber giderek önem kazanmaktadır.

Sistemik mantar infeksiyonlarının tanısında polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) kullanımının kültür ve serolojik yöntemlereden daha duyarlı ve özgül olduğu bilinmektedir (20). Hatta kan örneklerinde PZR’nin 1CFU/ml’ye kadar mantarları belirlemede duyarlı olduğu bildirilmektedir (20-22). Ancak küf mantarlarının dolaşımda saptanma olasılıklarının düşük olduğu da bir gerçektir (10).

Nükleik asit tespitine dayalı yöntemlerin ilk basamağı amplifikasyondur. Bu PZR ya da başka bir yol ile olabilir. Solunum yolu örnekleri aspergillus infeksiyonlarının tanısında sık kullanılır. Ne yazık ki bu örnekler patojen olmayan mantar ve bakteriler ile karışık olduklarından bu örneklerden doğru amplifikasyon kolay değildir. Ayrıca klinik örneklerde mantar DNA ve RNA’sını ekstrakte edici standart prosedürlerin olmaması ve inhibitörlerin elimine edilememesi nedeni ile prosedürlerin tam oluşmaması testin duyarlılığını da azaltabilmektedir (23).

Moleküler yöntemler arasında insitu hibridizasyon yöntemi en basit yöntemdir. Ancak duyarlılığı diğer yöntemlere göre düşüktür. Kültürde üretilen, morfolojik tanı yapılamayan Aspergillus, Candida ve diğer mantarları değerlendirmek için yararlanılabilir (24).

Steril vücut sıvılarında küf mantarları nadiren saptanır. Aspergilluslar için pek çok çalışma “gerçek zamanlı PZR” ı en ümit vadeden yöntem olarak vurgulamaktadır. Bu yöntem, amplifikasyon ürününü standarize eder, “turn-around” zamanını kısaltır bu nedenle kısa sürede sonuç verir. Probun tanımlamasına dayanarak tür/cins düzeyinde tanı yapar ve hedef DNA’nın sayısını vererek tedavi takibinde de kullanıma imkân verir (25).

“Nested PZR” tekniği en yaygın kullanılan ve üzerinde en çok çalışma bulunan yöntem olmasına rağmen prosedür nedeni ile kontaminasyona açıktır ve yalancı pozitiflik verme ihtimali fazladır (10).

Her ne kadar mükemmele yakın bir yöntem gibi görünse de invazif aspergilloz tanısında nükleik asit saptama yöntemlerinin yeri sınırlıdır. Çünkü karmaşık bir prosedürdür ve özel teçhizat ihtiyacı vardır. Pahalı olması da yöntemin rutin kullanımını kısıtlamaktadır.

Tek örnekte, özellikle kanda pozitiflik saptanması durumunda yalancı pozitiflikten şüphe edilmelidir. Galaktomannan ile birlikte PZR tekrarlayan takipler ile erken veya olası invazif aspergilloz tanısında kullanılabilmektedir (10,13,26).

Nükleik asit saptama yöntemlerinin gelecekte tüm mikrobiyolojide birincil tanı yöntemi olacağından hiç şüphe yoktur. Ancak uygulamalar henüz araştırma programları olan akademik merkezlerle sınırlı kalmıştır.
KAYNAKLAR
1. Walsh TJ, Anaissie EJ, Denning DWet al. Treatment of aspergillosis: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2008 Feb 1;46(3): 327-60

2. Patterson TF, Kirkpatrick WR, White M. Et al. ; for the I³ Aspergillus Study Group. Invasive aspergillosis. Disease spectrum, treatment practices, and outcomes. Medicine (Baltimore). 2000 Jul;79(4): 250-60

3. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP et al Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clin Infect Dis. 2008 Jun 15;46(12):1813-21.

4. Denning DW, Kibbler CC, Barnes RA. British Society for Medical Mycology proposed standards of care for patients with invasive fungal infections. Lancet Infect Dis 2003; 3: 230–40.

5. Grocott RG. A stain for fungi in tissue sections and smears using Gomori’s methenamine-silver nitrate technic. Am J Clin Pathol 1955; 25: 975–79.(özet)

6. Ruchel R, Schaffrinski M. Versatile fluorescent staining of fungi in clinical specimens by using the optical brightener Blankophor. J Clin Microbiol 1999; 37: 2694–96.

7. Verweij PE, Smedts F, Poot T, Bult P, Hoogkamp-Korstanje JA, Meis JF. Immunoperoxidase staining for identification of Aspergillus species in routinely processed tissue sections. J Clin Pathol. 1996 Oct;49(10):798-801.

8. Del Bono V, Mikulska M, Viscoli C. Invasive aspergillosis: diagnosis, prophylaxis and treatment Curr Opin Hematol. 2008 Nov;15(6): 586-93

9. Kontoyiannis DP, Sumoza D, Tarrand J, Bodey GP, Storey R, Raad II. Significance of aspergillemia in patients with cancer: a 10-year study. Clin Infect Dis. 2000 Jul;31(1): 188-9

10. W W Hope, T J Walsh, D W Denning. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect Dis 2005; 5: 609–22

11. Haynes K, Rogers TR. Retrospective evaluation of a latex agglutination test for diagnosis of invasive aspergillosis in immunocompromised patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994: 13: 670-674.

12. Hopwood V, Johnson EM, Cornish JM, Foot AB, Evans EG, Warnock DW. Use of the Pastorex aspergillus antigen test for the diagnosis of invasive aspergillosis. J Clin Pathol 1995; 48: 210-213.

13. Maertens JA, Klont R, Masson C, et al. Optimization of the cutoff value for the Aspergillus double-sandwich enzyme immunoassay. Clin Infect Dis 2007; 44:1329–1336.

14. Penack O, Rempf P, Graf B, et al. Aspergillus galactomannan testing in patients with long-term neutropenia: implications for clinical management. Ann Oncol 2008; 19:984–989.

15. Maertens J, Verhaegen J, Demuynck H et al. Autopsycontrolled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandvich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 1999;37:3223-28.

16. Denning DW, Riniotis K, Dobrashian R, Sambatakou H. Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis: case series, proposed nomenclature change, and review. Clin Infect Dis 2003; 37 (suppl 3): S265–80

17. Chan CM, Woo PC, Leung AS, et al. Detection of antibodies specific to an antigenic cell wall galactomannoprotein for serodiagnosis of Aspergillus fumigatus aspergillosis. J Clin Microbiol 2002; 40: 2041–45.

18.Wong B, Brauer KL, Tsai RR, Jayasimhulu K. Increased amounts of the Aspergillus metabolite D-mannitol in tissue and serum of rats with experimental aspergillosis. J Infect Dis 1989; 160: 95–103 (abs).

19. Lewis RE, Wiederhold NP, Chi J, et al. Detection of gliotoxin in experimental and human aspergillosis. Infect Immun 2005; 73: 635–37.

20. Klingspor L, Jalal S. Molecular detection and identification of Candida and Aspergillus spp. from clinical samples using real-time PCR. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 745-753.

21. Francesconi A, Kasai M, Petraitiene R, et al. Characterization and comparison of galactomannan enzyme immunoassay and quantitative real-time PCR assay for detection of Aspergillus fumigatus in bonchoalveolar lavage fluid from experimental invasive pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 2006; 44: 2475–2480.

22. White PL, Archer AE, Barnes RA. Comprison of non-culter-based methods for detection of systemic fungal infections, whit an emphasis on invasive Candida infection. J Clin Microbiol 2005; 43: 2181–2187

23. Lindsley MD, Warnock DW, Morrison CJ. Serology and diagnosis of fungal Infections. In: Dentrick B, Hamilton RG, Folds JD, eds. 7th ed. Washington, DC: ASM Pres, 2006.

24. Shea YR. Algorithms for detection and identifica­tion of fungi, “Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (eds). Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.” kitabında s.1745-61, ASM Press, Washington DC (2007).

25. Costa C, Vidaud D, Olivi M, Bart-Delabesse E, Vidaud M, Bretagne S. Development of two real-time quantitative TaqMan PCR assays to detect circulating Aspergillus fumigatus DNA in serum, J Microbiol Methods 2001;44(3):263-9.

26. Loeffler J, Schmidt K, Hebart H, Schumacher U, Einsele H. Automated extraction of genomic DNA from medically imported yeast species and filamentous fungi by using the MagNA Pure LC system. J Clin Microbiol 2002; 40: 2240-2243