Masarykova univerzita

21.Optimalizace parametrů LC-MS/MS analýzy simulantů BCHL

Pro LC-ESI-MS/MS analýzu je třeba z hlediska dosažení podmínek pro maximální citlivost detekce a dosažení co nejnižších limitů detekce a kvantifikace optimalizovat podmínky ESI ionizace (tlak zmlžovacího plynu, teplotu sušicího plynu, kapilární napětí), transportu iontů z iontového zdroje do hmotnostního spektrometru (napětí fragmentoru) a vznik produktových iontů (kolizní energie) pro konkrétní analyty. Na obrázcích 11-13 a v příloze 1-3 jsou uvedeny závislosti odezev hmotnostního detektoru v režimu MRM na kapilárním napětí, napětí fragmentoru a kolizní energii. Teplota sušicího plynu 300 °C, průtok sušicího plynu 11 l.min^-1 a tlak plynu ve zmlžovači 40 p.s.i. byly vybrány z výrobcem doporučených hodnot podle průtoku a složení mobilní fáze. Optimalizace zbývajících parametrů hmotnostní detekce (kapilární napětí, napětí fragmentoru a kolizní energie) byla provedena pro prekurzorové a produktové ionty DEEP, DMMP a TEP vybrané ze SCAN a PI hmotnostních spekter získaných při použití ESI ionizace, viz tab. č. 5.
Tabulka č. 5; Prekurzorové a produktové ionty zvolené pro hmotnostní detekci DEEP, DMMP a TEP

Simulant BCHL	Prekurzorový iont	Produktový iont
DEEP	167,2	111
DMMP	125,1	93
TEP	183,2	99

V režimu SIM (Selected Ion Monitoring) byly měřeny závislosti odezvy hmotnostního detektoru (plocha chromatografického píku příslušného simulantu BCHL (DEEP, DMMP, TEP) na velikosti kapilárního napětí v rozmezí 1500 až 4000 V. K analýze byly použity simulanty o koncentraci 10 µg.ml^-1, viz obr. č. 11 pro DEEP a v příloze 1 pro DMMP.

Obr. č. 11; DEEP - Vliv kapilárního napětí na plochu chromatografického píku DEEP v režimu SIM (m/z 167,2), napětí fragmentoru 100 V
V režimu SIM (Selected Ion Monitoring) byly měřeny závislosti odezvy hmotnostního detektoru (plocha chromatografického píku příslušného simulantu BCHL (DEEP, DMMP, TEP) na velikosti napětí fragmentoru v rozmezí 80 až 200 V při velikosti kapilárního napětí 4000 V. K analýze byly použity simulanty o koncentraci 10 µg.ml^-1, viz obr. č. 12 pro DEEP, v příloze 2 pro DMMP a TEP.

Obr. č. 12; DEEP - Vliv napětí fragmentoru na plochu chromatografického píku DEEP v režimu SIM (m/z 167,2), kapilární napětí 4000 V

V režimu MRM (multiple reaction monitoring) byly měřeny závislosti odezvy hmotnostního detektoru (plocha chromatografického píku příslušného simulantu BCHL (DEEP, DMMP, TEP), na hodnotě kolizní energie v rozsahu 5 až 50 eV při napětí na fragmentoru 100 V a kapilárním napětí 4000 V. K analýze byly použity simulanty o koncentraci 10 µg.ml^-1,viz obr. 13 pro DEEP, v příloze 3 pro DMMP a TEP.

Obr. č. 13; DEEP - Vliv kolizní energie na plochu chromatografického píku DEEP v režimu MRM (167,2→111), kapilární napětí 4000 V, napětí fragmentoru 100 V

Z naměřených závislostí byly vybrány optimální hodnoty sledovaných parametrů pro LC-ESI-MS/MS analýzu DEEP, DMMP a TEP, viz tab. 6.

Tabulka č. 6; Parametry MS/MS zvolené pro analýzu simulantů BCHL

Simulant BCHL	MRM	Kapilární napětí [V]	Napětí fragmentoru [V]	Dwell time [ms]	Kolizní energie [eV]
DEEP	167,2  111	4000	100	200	10
DMMP	125,1  93	4000	100	200	10
TEP	183,2  99	4000	100	200	10

22.Kalibrační závislosti

Pro účely kvantifikace byly připraveny kalibrační křivky simulantů BCHL pro hmotnostní detekci (DEEP, DMMP a TEP) a pro UV detekci (CEES, CEMS a MS) v rozsazích pokrývajících koncentrace očekávané ve vzorcích získaných z experimentů zaměřených na studium kontaminace a dekontaminace ochranných materiálů a z experimentů zaměřených na extrakci simulantů BCHL z modelových obohacených vzorků půdy. Příklady kalibračních závislostí jsou uvedeny na obr. č. 14.

Obr. č. 14; Kalibrační křivky simulantů BCHL a) DEEP, b) DMMP, c) TEP. MS/MS detekce. Roztoky standardů o koncentracích 10, 50, 100, 500 a 1000 ng.ml¹.

Obr. č. 14a) Kalibrační křivka DEEP; MRM 167,2→111, kapilární napětí 4000 V, napětí fragmentoru 100 V, kolizní energie 10 eV

Obr. č. 14b) Kalibrační křivka DMMP; MRM 125,1→93, kapilární napětí 4000 V, napětí fragmentoru 100 V, kolizní energie 10 eV

Obr. č. 14c) Kalibrační křivka TEP; MRM 183,2→99, kapilární napětí 4000 V, napětí fragmentoru 100 V, kolizní energie 10 eV

Obr. č. 15; Kalibrační křivky simulantů BCHL a) CEES, b) CEMS, c) MS. UV detekce. Roztoky standardů o koncentracích 1, 4, 6, 10, 20, 30, 40, 50 a 100 µg.ml^-1

Obr. č. 15a) Kalibrační křivka CEES; UV 205 nm

Obr. č. 15b) Kalibrační křivka CEMS; UV 205 nm

Obr. č. 15c) Kalibrační křivka MS; UV 205 nm