Mavzu: Genomlardagi oqsil strukturasini aniqlash
Genomning DNK darajasidagi tahlili
Yüklə 0,52 Mb. Pdf görüntüsü
|
|
Genomning DNK darajasidagi tahlili
DNKni to’qimalardan ajratish uchun hujayra organoidlari va membranalarining bo’laklari sentrifugalsh uslubi yordamida homogenatdan olinadi. DNKni to’qimalardan ajratish jarayonida u parchalanadi. Olingan DNK molekulalari dastlabki molekulalarga qaraganda ancha kichik, ammo ular yuqori molukulyar massaga ega bo’ladi. Bunday molekulalar tadqiqot uchun qulay emas va ular yana parchalanishi kerak. Parchalanish uchun bakteriyalardan ajratilgan restrikataza fermentlari ishlatiladi.Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PZR)- Ba‘zi tadqiqotlar uchun juda ko’p miqdordagi yaxshi tozalangan yuqori molekulyar og‘irlikdagi DNK juda muhimdir. PCR usuli DNKning in vitro kichik qismlarini tanlab sintez qilishga va 3-4 soat ichida o’rganilayotgan fragmentning bir necha million nusxasini olishga imkon beradi. DNK ob‘ektlari sifatida qon, to’qima biopsiyasi, so’lak, siydik, amniotik suyuqlik va boshqalarni ishlatish mumkin. Gibridizatsiya. Gibridlanish usuli nuklein kislotalarning turlarga xosligini o’rganish uchun ishlatiladi. U DNKni qizdirilganda (80-90°C) denaturatsiya 18 qilish va sovutilganda qayta tiklanish qobiliyatiga asoslangan. Gibridlanish usuli nuklein kislotalarning birlamchi tuzilishidagi o’xshashlik va farqlarni o’rnatishi mumkin.DNK biosintezi (replikatsiya). Replikatsiya - bu matritsali jarayon. Replikatsiya paytida DNKning 2 ta zanjirining har biri yangi zanjirning shakllanishi uchun shablon bo’lib xizmat qiladi. Insonning DNK molekulasi juda katta, bunday katta molekulaning replikatsiyasi (daqiqada 50 nukleotidning sitezi tezligi) 800 soatni tashkil qiladi. Shu nuqtai nazardan, DNK sintezining boshlanishi xromosomaning bir nechta nuqtalarida sodir bo’ladi, ular replikatsiya boshlanish nuqtalari yoki kelib chiqishi deb nomlanadi. Replikatsiya tugagandan so’ng, ikkitadan ikkita DNK molekulasi hosil bo’ladi, ularning har biri bittadan ona va bitta yangi sintezlangan zanjirni o’z ichiga oladi. Mitoz natijasida ular qiz hujayralariga taqsimlanadi. Shunga ko’ra, replikatsiya jarayoni yangi avlodlarda genotipning ko’payishini ta‘minlaydi. Agar 19-asr jahon tsivilizatsiyasi tarixiga haqli ravishda Fizika asri sifatida kirgan bo’lsa, 20-asrda Biologiya va Genetika asri deb tan olindi. Mendel qonunlari qayta kashf etilgandan 100 yil o’tmay, genetika sohasida irsiyat va o’zgaruvchanlik qonunlarini tabiiy-falsafiy ma‘nosini ocib berishdan, genetika fanining mohiyati, genlar tuzilishi va funktsiyasini molekulyarbiologik nuqtai nazardan anglashgacha bo’lgan yo’lni bosib o’tdi. Irsiyatning mavhum birligi sifatida gen haqidagi nazariy tadqiqotlardan tortib, uning moddiy mohiyatini, oqsilning aminokislota tuzilishini kodlovchi DNK molekulasining bo’lagi sifatida anglashgacha, individual genlarni klonlash, odam va hayvonlarning batafsil genetik xaritalarini yaratish, mutatsiyalari- og‘ir irsiy kasalliklar bilan bog‘liq genlarni aniqlash, belgilangan irsiy xususiyatlarga ega organizmlarni maqsadli ravishda ishlab chiqarishga imkon beradigan biotexnologiya va gen muhandisligi usullarini ishlab chiqish, shuningdek, mutant odam genlarini maqsadli tuzatishni, ya‘ni irsiy kasalliklarning gen terapiyasini amalga oshirish kabi ishlar amalga oshirildi. 19 Molekulyar genetika hayotning mohiyati, tirik tabiat evolyutsiyasi, individual rivojlanishni boshqarishning tarkibiy va funktsional mexanizmlari haqidagi tushunchalarimizni sezilarli darajada chuqurlashtirdi. Uning yutuqlari tufayli insoniyatning genofondini himoya qilish bilan bog ‘liq global muammolarini hal qilish boshlandi.Tabiiyki, odamlar va hayvonlarning individual genlarini manipulyatsiya qilish imkoniyati hali ham butun genomning funktsiyasini, uning tashkil etilishini, ontogenez mexanizmlarining butun xilma-xilligini ta‘minlashda uning qismlarining o’zaro ta‘sirini, ya‘ni butun bir organizmga bitta hujayraning rivojlanishini tushunish uchun etarli emas. Agar har qanday turdagi genomda nafaqat individual rivojlanish dasturi, balki evolyutsiyasi, ya‘ni uning filogenezi kodlanganligini qo’shsak, "Inson genomi" Xalqaro ilmiy dasturi qanchalik mantiqiy va metodik jihatdan o’z vaqtida bo’lganligi aniq bo’ladi. Boshqa turlarga laboratoriya sichqonlari, nematodalarni genomini tadqiqot qilish kabi dasturlar bilan bir qatorda. Inson Genom dasturi, 2000 yilga kelib DNKning birlamchi tuzilishini to’liq ochib berishga, ya‘ni barcha inson genlarini aniqlashga imkon berdi, ularning boshqaruvchi elementlari aniqlandi. DNKni har qanday turdagi to’qima va yadro o’z ichiga olgan hujayradan ajratish mumkin. DNK izolatsiyasi bosqichlari hujayralarni lizis qilish, hujayra organoidlari va membranalarining parchalarini sentrifugalash yo’li bilan olib tashlash, oqsillarni fermentativ yo’q qilish va ularni fenol va xloroform yordamida eritmadan ajratib olish va DNK molekulalarining etanolda konsentratsiyasini o’z ichiga oladi. Odatda 1 gramm xom to’qimadan yoki hujayradan 2 milligramm DNK olinadi. 20 Odamlarda DNK ko’pincha qon leykotsitlaridan ajratib olinadi, buning uchun 5 dan 20 ml gacha venoz qon steril naychada qon ivishining oldini oluvchi eritma bilan to’planadi (masalan, geparin bilan). Keyinchalik, leykotsitlar ajratiladi va hujayralar va yadro membranalari denatuartsiya qiluvchi moddalar bo’lgan bufer eritmalar qo’shib yo’q qilinadi. DNK izolatsiyasida eng yaxshi natijalar proteinaza-K yordamida parchalanib fenol-xloroform bilan ekstraktsiyasidan olinadi. DNK etanolda cho’ktiriladi va bufer eritmasida eritiladi. Ekstraktsiya qilingan DNKning sifatini baholash oqsil va nuklein kislotalaar yutilish spektrlari mintaqasidagi DNK eritmasining optik zichligini o’lchash asosida amalga oshiriladi. Sof DNK namunalarida A (260) / A (280)> 1.8 nisbati bo’lishi kerak. Aks holda, tozalash jarayonini takrorlash kerak, chunki DNKni muvaffaqiyatli ishlatish va saqlash uchun oqsillarni butunlay yo’q qilish kerak.Murakkab va xilma-xil ishlash jarayonida xromosomalarning va DNKning turli qismlari turli xil tartibga solinadigan va asosan qaytariladigan o’zgarishlarga uchraydi. Ushbu modifikatsiyalar maxsus oqsillar - fermentlar yordamida amalga oshiriladi. Zamonaviy molekulyar diagnostika asoslarini tushunish uchun ayniqsa muhim bo’lgan DNK fermentlarining faqat ikkita sinfi- polimerazalar va restriksion endonukleazalarni qisqacha ko’rib chiqamiz.DNK sintezini olib boradigan fermentlar DNK polimerazalari deb ataladi. Ham bakterial hujayralar, ham eukariothujayralar DNK polimerazalarining uch xil shaklini o’z ichiga oladi, ularning barchasi sintez qiluvchi faollikka ega va DNK zanjirlarini 5 - 3 yo’nalishda uzaytira oladi, ketma-ket bitta nukleotidni 3-OH oxirigacha hosil qiladi va sintezning aniqligi asoslar juftlikning o’ziga xosligi bilan belgilanadi. Shunday qilib, DNK-polimeraza uchun molekulaning 3 ‘uchida ikkita ipli mintaqasi bo’lgan bitta zanjirli shablon DNK kerak. Bundan tashqari, trifosfatlarning to’rt turi (dATP, dCTP, dGTP va dTTP) - asoslardan- A, C, G yoki T, shakar – deoksiriboza va uchta fosfat qoldiqlaridan iborat molekulalar muhitda bo’lishi kerak. Eukariothujayralarda replikatsiya DNK-polimeraza alfa, va E. 21 coli hujayralarida - DNKpolimeraza III ishlatiladi. DNK-polimerazalar turli xil faolliklarga ega, shu jumladan 3 - 5 yo’nalishda ekzonukleaza, bu ularni raparatsiyalash - tiklash, nuqsonlarni yaratishga imkon beradi, bir-birini to’ldiruvchi asoslarni tanlashda tan olingan. E. coli DNK polimeraza I DNK sinishida replikatsiyani boshlashga va DNK qo’sh zanjiridagi gomologik mintaqani almashtirishga qodirEndonukleaza faolligi bo’lgan bakterial fermentlarning kashf etilishi - restriksion endonukleazalar yoki restriksion endonukleazalar - DNK tuzilishini o’rganish va DNK molekulalarini genetik muhandislik sohasida manipulyatsiya qilish imkoniyatlarini sezilarli darajada rivojlantirdi. In vivo jonli sharoitda bu fermentlar tanib olish va himoya qilishda va begona DNKni yo’q qilishda ishtirok etadi. Kesishfermentlari DNKning ikki zanjirli molekulasida 4-6, kam hollarda 8- 12 nukleotidning aniq ketma-ketligini tan oladi va uni ushbu ketma-ketliklarni lokalizatsiya joylarida, kesish joylari deb nomlangan qismlarga ajratadi. Natijada paydo bo’lgan restriksiya DNK fragmentlarining soni kesish joylarining paydo bo’lish chastotasi bilan belgilanadi va ularning kattaligi ushbu joylarning asl DNK molekulasi uzunligi bo’yicha tarqalish xarakteriga ko’ra belgilanadi. Kesish joylari qanchalik tez-tez joylashgan bo’lsa, uzilgandan keyin DNK bo’laklari shuncha qisqa bo’ladi. Hozirgi vaqtda bakteriyalar 500 dan ortiq har xil turdagi restriktiv fermentlari ma‘lum va bu fermentlarning har biri o’ziga xos ketma- ketlikni tan oladi. Kesish fermentlari har xil turdagi bakteriyalardan biokimyoviy tozalash yo’li bilan ajratiladi va bakteriyalar turlarining lotincha nomining birinchi uchta harfiga mos keladigan uchta harf bilan belgilanadi va ushbu turdagi bakteriyalarda ushbu fermentni kashf etish xronologiyasiga mos keladigan rim raqami bilan belgilanadi. DNK molekulasida uzilish joylari paydo bo’lishining chastotasiga qarab, uchta, ko’pincha, to’rta va kamdan-kam bo’linadigan fermentlar sinfiajratiladi. Tabiiyki, uzun ketma-ketlikni taniydigan kesish fermentlari (8-12 bp), qoida tariqasida, kamdan-kam hollarda parchalanadi (masalan, Nor1), kalta (4-5 bp) ni 22 nukleotid qatorlarini taniydiganlar Taq1, EcoR1 larni kiritish mumkin. Kesishjoylari genetik DNK markerlari sifatida ishlatilishi mumkin. Darhaqiqat, uzilish natijasida hosil bo’lgan DNK fragmentlari agaroza yoki poliakrilamid gelida elektroforez uslubi bilan uzunligi bo’yicha va shu bilan ularning molekulyar og‘irligi va nukleotidlar orasidagi fizik masofani aniqlash mumkin. Geldagi DNKni, shuningdek RNKni aniqlashning odatiy usuli, ko’pincha etidiyum bromid bilan bo’yash va geldan o’tuvchi ultrabinafsha rangda k o’rish mumkin. Bunday sharoitda DNKni lokalizatsiya qilish joylari qizil rangga ega bo’ladi. Kesish uchun bir nechta endonukleazadan foydalanilganda, so’ngra nuleotidlar umumiy uzunligi aniqlash uchun, DNK bo’laklarini elektroforetik tahlil qilishda, fermentlarning har biri uchun va o’rganilayotgan DNK molekulasida mavjud bo’lgan boshqa belgilarga nisbatan tanib olish joylarini to’liq tartiblash asosida erishish mumkin. Ushbu jarayon fizik xaritalash deb ataladi va plazmid, virusli, bakterial DNK va eukariotDNKning nisbatan kichik bo’laklarini tahlil qilishning ajralmas elementidir.Asl DNKni restriktaza fermenti bilan qayta ishlagandan so’ng, uzunligi bo’yicha DNK molekulasining uchlaridan tortib uzilish joylariga qadar uzunligiga mos keladigan ikkita bo’lak hosil bo’ladi. Ikkala endonukleaza bilan birgalikda ta‘sir ettirilganda, elektroforegrammada yangi parcha paydo bo’ladi, uning kattaligi kesishjoylari orasidagi masofaga to’g‘ri keladi. Shubhasiz, ushbu 23 ma‘lumotlar kesishjoylarining DNK molekulasinin g uchlariga nisbatan o’rnini aniq belgilashga hali imkon bermaydi. Ammo, asl DNK molekulasini, unda joylashgan uzilish joylari sonidan qat‘i nazar, aniq fizik xaritasini tuzish uchun kamida bitta markerning joylashishini bilish kifoya.Umumiy genom, eukariot DNKsi, xususan inson DNKsi qayta ishlanganda juda ko’p turli uzunlikdagi (o’rtacha 1 millionga yaqin) bo’laklar hosil bo’ladi, ularni elektroforez bilan ajratib b o’lmaydi, ya‘ni elektroforezda individual DNK bo’laklarini vizual ravishda aniqlash mumkin emas. Genom DNKsining elektroforezi to’xtatilgandan so’ng, gelning butun uzunligi bo’ylab bir xil bo’yash o’tkaziladi. Bunday gelda kerakli DNK fragmentlarini aniqlash faqat belgilangan DNK zondlari bilan gibridlanish orqali amalga oshirilishi mumkin. Bunga Southern blot duragaylash usuli yordamida erishiladi.Southern blot duragaylash usuli. Elektroforez bilan ajratilgan bo’laklar orasida ma‘lum DNK molekulalarini aniqlashning eng samarali usullaridan biri 1975 yilda ushbu usulni taklif qilgan muallif Edvard Southern nomi bilan atalgan hozirgi kunda klassik Southern blot duragaylash usuli hisoblanadi. Usulning mohiyati shundan iboratki, genom DNKsi bir yoki bir nechta restriktiv fermentlar tomonidan kesiladi, shundan so’ng hosil bo’lgan bo’laklar agaroza yoki akrilamidgjellarida molekulyar og‘irligi orqali ajratiladi. Keyin DNK denaturatsiya qilinadi va gjeldan qattiq tashuvchiga, odatda nitrosellyuloza filtri yoki neylon membranaga ko’chiriladi. O’tkazgichda blotting, kapillyar kuchlar, elektr maydon yoki vakuum ta‘sirida amalga oshiriladi. Filtrga ko’chirilgan va yopishgan DNK, radioelementli DNK yoki RNK zond bilan gibridlanadi. Genom DNKsining kerakli qismining elektroforegramdagi o’rni avtoradiografiya usuli bilan aniqlanadi. Blot gibridizatsiyasi DNKning aniq sekvenirlangan qismlarini aniqlash uchun juda sezgir usuldir. Yetarli darajada uzoq vaqt ta‘sir qilishda bir necha kun ichida va DNK zondining yuqori o’ziga xos radioaktivligi asosida, 0,1 pikoggacha 24 bo’lgan DNKni aniqlashga imkon beradi. Usul shuningdek, juda qisqa oligonukleotid zondlari (20 bp) bilan ishlashga imkon beradi, shu bilan birga, usul namunalarni nishonlash va filtrning uzoq vaqt ta‘sirlanishini talab qiladi. Sof DNK preparatlari bilan ishlash zarurati, aniq yuqori darajada nishonlangan radioaktiv zondlardan foydalanish, umumiy tadqiqotlaningdavomiyligi va unga ketadigan mehnat sarfi usulni juda qimmatga tushiradi. Shunga qaramay, bir qator holatlarda, bugungi kunda ham bu usul o’z ahamiyatini yo’qotmagan, shu jumladan genetik kasalliklar diagnostikasida keng qo’llaniladi. So’nggi paytlarda DNKni nitrat kislota kumush bilan bo’yashning radioaktiv bo’lmagan nishonlash yoki bo’yashning turli xil versiyalari ko’pincha qo’llanilmoqda. Oldindan fragmentlarga bo’lish va elektroforezsiz, qattiq matritsaga tomchilab tomizilgan DNK yoki RNK preparatlarining nishonlangan DNK namunasini gibridlash, mos ravishda dumaloq yoki cho’zinchoq filtrda DNK dog‘ining konfiguratsiyasiga qarab nuqta yoki teshikli duraga ylash usuli qo’llanilmoqda. Bunday DNK zondlarini elektroforez yordamida ajratilgan RNK molekulalari bilan duragaylash usuli Nothern blot deb ataladi. Western blot yoki immunoblot esa filtrlarga o’rnatilgan elektroforez usulida ajratilgan oqsillarni nishonlangan antitanalarga bog‘lash tushuniladi. Ushbu usullarning nomi - DNKni tahlil qilish uchun q o’llaniladigan eksperimental yondashuvlarning rivojlanishiga beqiyos hissa qo’shgan molekulyar genetika fanlari doktori Edvard Soutern hissasi katta bo’lib, ba‘zi hollarda DNK zondlari bilan duragaylash DNKni oldindan ajratib olish va tozalashni talab qilmaydi.Gibridizatsiya uslubi nafaqat gel, filtrlarda yoki eritmada, shuningdek gistologik yoki xromosoma namunalarida o’tkaziladi. Ushbu usul duragaylash deb ataladi. Ftorxromlar bilan nishonlangan DNK yoki RNK namunalari zond sifatida ishlatilishi usulining bir variantiga FISH (fluretssein in situ hybridization) deyiladi. Nishonlangan DNK namunasi turli xil rangga bo’yalgan va hibridizatsiya uchun 25 tayyorlangan denaturatsiya qilingan metafazaxromosomalarining namunalariga qo’llaniladi. Gibridizatsiya jarayonini maksimal darajada engillashtiradigan shartlarni tanlash ham muhimdir. Bog‘lanmagan DNK molekulalarini yuvgandan so’ng, nurga sezgir emultsiyani, biotin yoki lyuminestsin bilan belgilangan DNK zondlaridan foydalanganda, ishlatilgan DNK zondini to’ldiruvchi DNK sekvenirlashlarini lokalizatsiya joylarini mikroskop ostida ,ma‘lum xromosomalarning tegishli maydonlari ustidagi xarakterli nuqtalarni to’g‘ridan- to’g‘ri kuzatish mumkin. Insitu sharoitida gibridizatsiya qilish, xromosomalardagi DNK zondini to’ldiruvchi DNK sekvenirlashlarini xaritalashning eng samarali usullaridan biridir. Ushbu uslub, xususan, takrorlanadigan DNK ketma-ketliklarining genom bo’yicha tarqalishini o’rganishda, noma‘lum kelib chiqadigan klonlangan DNK ketma-ketliklarida, nafaqat xromosoma bog‘liqligini, balki tegishli DNK zondlari mavjud bo’lgan holatlarda xromosomalararo lokalizatsiyasini va noyob genlarini aniqlashda ham samaralidir. So’nggi ma‘lumotlarga ko’ra, odamlarda maxsus tayyorlangan va uzaytirilgan fazalararo xromosomalari bo’yicha o’tkazilgan tajribalarda FISH usulining natijalari 50 kb ga yetishi mumkin, bu o’rtacha xromosoma bandining atigi 1/20 qismidir. Klonlangan DNK parchalarini bir xil xromosoma joylashuvi ichida ham o’zaro joylashtirish muammolari FISH usuli bilan muvaffaqiyatli hal qilinmoqda, gistologik namunalarda olib boriladigan RNK molekulalari va kDNA zondlari o’rtasida in situ sharoitida o’tkazilgan gibridizatsiya iRNK to’qimalarga xos tarqalishini va hujayra ichidagi lokalizatsiyasini tahlil qilishning eng samarali usullaridan biridir. Yüklə 0,52 Mb. Dostları ilə paylaş:
|