Mundarija kirish I bob alfa Beta gidrolazalar supero ilasi fermentlari katalitik aminokislotalarining qiyosiy bioinformasion taxlili

Yangi alfa/beta gidrolaza domen oqsilining K. marxianusning lignoselülozik biomassadan olingan ingibitorlarga chidamliligiga ta'siri.

M
ikroorganizmning ko'p inhibitorlarga chidamliligi bioyoqilg'i va boshqa kimyoviy moddalar uchun istiqbolli qayta tiklanadigan va barqaror manba bo'lgan lignoselülozik biomassaning biokonversiyasida muhim ahamiyatga ega. Ushbu tadqiqotda KmYME deb nomlangan va mitoxondriyada joylashgan noma'lum a/b gidrolazaning buzilishi xamirturushning lignoselülozadan olingan inhibitorlarga, xususan, sirka kislotasi, furfural va 5-HMFga nisbatan sezgir bo'lishiga olib keldi. KmYME buzilgan shtamm ko'proq mitoxondriyal membrana potentsialini yo'qotdi, plazma membranasining o'tkazuvchanligini, qattiq redoks nisbati nomutanosibligini va ROS to'planishini ko'rsatdi, xuddi shu inhibitorlar ishtirokida buzilmagan shtamm bilan solishtirganda. KmYME buzilgan shtammdagi ATP, NAD va NADP ning hujayra ichidagi kontsentratsiyasi kamaydi. Biroq, KmYME ning buzilishi transkripsiya darajasida gen ifodasining sezilarli o'zgarishiga olib kelmadi. KmYME inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan esteraza/tioesteraza faolligiga ega edi. Bundan tashqari, etanol, harorat va osmotik bosim kabi boshqa stresslarga qarshilik ko'rsatish uchun KmYME ham talab qilingan. S. cerevisiae da ikki mumkin boʻlgan gomologik genlarning buzilishi ham uning ingibitorlarga chidamliligini pasaytirdi.
2-rasm
Grafik abstrakt. K. marxianusdagi KmYME ingibitorlariga mumkin bo'lgan bardoshlik mexanizmlari.
Lignoselülozik biomassa arzonligi, keng miqyosda mavjudligi va oziq-ovqat ishlab chiqarish bilan raqobatlashmasligi tufayli qayta tiklanadigan bioyoqilg'i va boshqa kimyoviy moddalar uchun istiqbolli manba hisoblanadi (Kamm va Kamm, 2004; Yinbo va boshq., 2006; Somerville va boshqalar. , 2010). Biroq, lignoselülozik biomassani oldindan tozalash jarayonida ingibitorlar shakar va lignin degradatsiyasining yon mahsuloti, shu jumladan zaif kislotalar, furan hosilalari va fenolik birikmalar sifatida hosil bo'ladi. Ushbu birikmalar mikrob hujayralari metabolizmi va fermentatsiyasini inhibe qiluvchi turli xil toksik mexanizmlar va sinergik ta'sirga ega (Palmqvist va Hahn-Hägerdal, 2000; Almeida va boshq., 2007). Demak, ushbu inhibitorlarga chidamlilik mexanizmini aniqlash sanoat fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni qurishda muhim ahamiyatga ega.
Kluyveromyces marxianus "umuman xavfsiz deb hisoblanadigan" (GRAS) mikroorganizm bo'lib, u termobardoshliligi, yuqori o'sish tezligi va keng substrat spektri tufayli lignoselülozik biomassaning bioetanol fermentatsiyasida tobora ko'proq e'tiborni tortdi (Zhang va boshq., 2015). K. marxianus shtammlari 40°C haroratda 0,86–0,99 soat–1 oʻsish tezligi bilan oʻsishi mumkin, baʼzi shtammlar esa 52°C gacha boʻlgan haroratda ham oʻsadi (Banat va Marchant, 1995). Ko'tarilgan harorat lignotsellyulozani shakarlashda ishlatiladigan tsellyulolitik fermentlar uchun mos keladi (optimal harorat 45-50 ° C) va bir vaqtning o'zida shakarlanish va fermentatsiya (SSF), shuningdek, bir vaqtning o'zida shakarlash va kofermentatsiya (SSCF) uchun afzalliklarni beradi (Chjan va boshq. , 2016; Kong va boshqalar, 2019). Bundan tashqari, yuqori haroratda sanoat fermentatsiyasi sovutish narxini va ifloslanish xavfini kamaytiradi (Banat va Marchant, 1995). Ksiloza glyukozadan tashqari lignoselülozik biomassaning asosiy gidroliz mahsulotlaridan biridir va K. marxianus tabiiy ravishda ksilozadan foydalanishi mumkin (Wilkins va boshq., 2008). Biroq, K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi juda kuchli emas va K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi haqidagi bilim oldingi tadqiqotlarda kam edi (Oliva va boshq., 2003; Oliva va boshq., 2004).
Oldingi tadqiqotimizda, K. marxianusning xarakterlanmagan a/b-gidrolaz domenini (ABHD) o'z ichiga olgan gen (GenBank BAP69980, joylashuv yorlig'i KMAR_10772) ifodasi lignoselülozik bilan oldindan ishlov berishdan olingan inhibitorlar ishtirokida sezilarli darajada yuqori tartibga solingan. biomassa (Vang va boshq., 2018). Bu erda biz uning ingibitorlarga tolerantlikka ta'siriga, oqsil xususiyatiga va uning inhibitorlariga bardoshlik mexanizmiga e'tibor qaratdik. Biz ushbu genning buzilishi K. marxianusdagi inhibitorlarga nisbatan tolerantlikni kamaytirishini aniqladik. Ushbu noma'lum protein mitoxondriya matritsasida joylashganligi va inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan in vitro esteraza/tioesteraza faolligiga ega ekanligi aniqlandi. Biz ushbu genning buzilishi ingibitorlar ishtirokida ATP va NAD(P)H sinteziga xalaqit beradigan hujayra ichidagi CoASH hovuzini buzish orqali inhibitorlarga nisbatan bardoshlikni pasaytiradi, degan xulosaga keldik. Bundan tashqari, KmYME osmik bosim (shakar va tuz), etanol va haroratni o'z ichiga olgan boshqa stresslarga qarshilikning keng spektrini ko'rsatdi. Saccharomyces cerevisiae tarkibidagi gomologik oqsil ham bir nechta inhibitorlarga qarshilik ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot bir nechta inhibitorlarning qarshilik mexanizmini yaxshiroq tushunish uchun foydali ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin, bu esa tsellyuloza biomassasini substrat sifatida ishlatishi mumkin bo'lgan sanoat fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni yaratishda muhim ahamiyatga ega.
Xamirturush ekstrakti/pepton dekstrozi (YPD) 10 g/l xamirturush ekstrakti, 20 g/l pepton, 20 g/l glyukoza o'z ichiga olgan achitqilarni etishtirish uchun ishlatilgan. Aminokislotalarsiz 6,7 g/L achitqi azot asosini o'z ichiga olgan sintetik tomchi (SD) muhiti, tegishli qo'shimchalar bilan to'ldirilgan 20 g / l glyukoza xamirturush transformantlarini tekshirish uchun ishlatilgan. 100 mkg/ml ampitsillinli Luria-Bertani (LB) muhiti gen klonlash uchun Escherichia coli Top10 va oqsilni ifodalash uchun BL21 (DE3) ni etishtirish uchun ishlatilgan. K. marxianus NBRC1777 NITE Biologik Resurs Markazidan (Tokio, Yaponiya) olingan. K. marxianus YHJ010 NBRC1777 ning TRP1, LEU2, URA3 auksotrofik shtammidir (Hong va boshq., 2007). S. cerevisiae W303 1A ADE2, TRP1, LEU2, URA3 va HIS3 oksotrofik shtammidir (ATCC 208352).
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha plazmidlar 1-jadvalda keltirilgan. Plazmid konstruktsiyasi 1-qo'shimcha faylda batafsil tavsiflangan. Primer juftlari qo'shimcha fayl 1da keltirilgan: qo'shimcha jadval S1.