Opis projektu Analiza molekularna w chorobach neurodegeneracyjnych spowodowanych mutacjami dynamicznymi. Charakterystyka chorób spowodowanych mutacjami dynamicznymi

Projekt finansowany i realizowany w ramach Mechanizmu Finansowego Europejskiego Obszaru Gospodarczego i Norweskiego Mechanizmu Finansowego

Numer: PL0076

Tytuł: Analiza molekularna w chorobach neurodegeneracyjnych spowodowanych mutacjami dynamicznymi

Termin realizacji: kwiecień 2007 – marzec 2010

Kierownik: prof. Jacek Zaremba

Miejsce realizacji: Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa, ul. Sobieskiego 9; tel.: [phone]

Przyznana kwota dofinansowania: 359 600 EURO

Opis projektu

Analiza molekularna w chorobach neurodegeneracyjnych spowodowanych mutacjami dynamicznymi.
Charakterystyka chorób spowodowanych mutacjami dynamicznymi

1. Zespół drżenia i ataksji związany z łamliwym chromosomem X (FXTAS)

Gen FMR1 odpowiedzialny jest występowanie zespołu kruchego chromosomu X (FraX, Fragile X Syndrome) - najczęstszej przyczyny upośledzenia umysłowego.

Gen ten zlokalizowany jest na chromosomie X, w pozycji q27.3 i charakteryzuje się występowaniem polimorficznego regionu, zawierającego powtórzenia CGG w niekodującej części pierwszego eksonu. Prawidłowy zakres powtórzeń obejmuje od 5 do 44 trójek CGG, natomiast pełna mutacja związana jest z ekspansją powtórzeń CGG powyżej 200 i utratą stabilności tego obszaru.

Dotychczas sądzono, że osoby z premutacją w genie FMR1 (zakres powtórzeń od 50 do 200 CGG) są bezobjawowymi nosicielami i charakteryzuje je wyłącznie podwyższone prawdopodobieństwo przekazania genu z ekspansją potomstwu.

Doniesienia opublikowane przez Hagermann i wsp. wskazują na występowanie u wspomnianych nosicieli premutacji zespołu chorobowego odmiennego od FraX, określonego jako zespół drżenia i ataksji związany z chromosomem X (FXTAS, Fragile X tremor ataxia syndrome). Objawia się m.in. narastającym drżeniem kończyn, problemami z chodzeniem i utrzymaniem równowagi oraz innymi objawami parkinsonizmu obserwowanymi głównie u dziadków osób z zespołem kruchego chromosomu X .

Obserwacje nosicieli premutacji wskazują na późny wiek występowania choroby po 50 r.ż.) i szerokie spektrum obserwowanych objawów. Głównymi objawami wspomnianego zespołu jest drżenie zamiarowe, ataksja móżdżkowa, chód na szerokiej podstawie, zaburzenia erekcji i zwieraczy, neuropatia obwodowa, umiarkowany parkinsonizm oraz demencja. Neuroobrazowanie wykazuje obecność wewnątrzkomórkowych ubikwityno-pozytywnych inkluzji w mózgu, móżdżku i hipokampie będących najprawdopodobniej wynikiem zwiększonej traskrypcji białka FMRP. Obecność takich inkluzji stwierdzono także w mózgach osób z ataksjami rdzeniowo-móżdżkowymi oraz chorobą Huntingtona. Charakterystyczne są szybko postępujące problemy z chodzeniem, znaczne obniżenie aktywności życiowej związanej z zaburzeniami pisania, jedzenia, trudności z ubieraniem się i wykonywaniem codziennych czynności higienicznych.

U wszystkich pacjentów z premutacją obserwuje się atrofię mózgu połączoną z utratą zdolności poznawczych i stopniową utratą pamięci. Ciekawą obserwacją jest, że wśród osób nosicieli premutacji obserwuje się wyższy aniżeli w populacji generalnej iloraz inteligencji i odsetek osób z wyższym wykształceniem.

Najnowsze doniesienia wskazują na występowanie FXTAS także u kobiet, nosicielek premutacji. Niezależnie od występowania objawów neurologicznych, u wspomnianych kobiet stwierdza się podwyższone prawdopodobieństwo wystąpienia przedwczesnego klimakterium (przed 40 r.ż.) o nieznanej etiologii.
2. Postępująca padaczka miokloniczna typu 1 (EPM1)

Postępująca padaczka miokloniczna typu EPM1 (progressive myoclonus epilepsy type 1) (MIM 254800), inaczej postępująca padaczka miokloniczna Unverrichta-Lundborga (Unverricht Lundborg diesease - ULD), mioklonia bałtycka (Baltic myoclonus) lub mioklonia śródziemnomorska (Mediterranean myoclonus) jest genetycznie uwarunkowaną chorobą ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym. Po raz pierwszy została opisana przez Unverrichta w Estonii w 1891 roku i przez Lundborga w Szwecji w 1903 roku. EPM1 jest najbardziej rozpowszechniona w obszarze morza bałtyckiego, szczególnie w Finlandii, gdzie częstość zachorowania wynosi 1:20 000 urodzeń. Znaczną częstość zaobserwowano również w południowej Francji, północnej Afryce oraz wschodnim regionie śródziemnomorskim. Do charakterystycznych objawów należą: ciężkie mioklonie, ogólne ataki toniczno-kloniczne, otępienie, zróżnicowany stopień progresji, pojawiające się w późniejszym okresie choroby (10-20 rok trwania) ataksje, dyzartia i zmiany w EEG z wyraźną fotowrażliwością. Objawy są wynikiem ubytku neuronów i glejozy móżdżku, przyśrodkowego wzgórza oraz rdzenia kręgowego. Pierwsze objawy choroby pojawiają się w wieku 6 -18 lat, zaś diagnoza następuje zwykle ok. 11 roku życia.

Podłoże molekularne EPM1 stanowią mutacje w genie CSTB. Gen zlokalizowany jest na 21 chromosomie w pozycji q22.3.

EPM1 uwarunkowana jest mutacją dynamiczną dwunastonukleotydowego obszaru minisatelitarnego położonego w regionie 5’flankującym genu CSTB. Analizy próbek DNA wszystkich dostępnych pacjentów wykazały zwielokrotnienie liczby powtórzeń sekwencji minisatelitarnej C₄GC₄GCG, która zlokalizowana jest 174 nukleotydy powyżej kodonu startu (ATG) translacji.

Sekwencje minisatelitarne zaliczane są do sekwencji powtórzonych, tzn. sekwencji występujących w genomie człowieka w wielu kopiach. Są to krótkie sekwencje tandemowe (od 7 do 100 nukleotydów) powtórzone w pojedynczym lokus od 2 do 400 razy. Funkcjonują one również pod nazwą VNTR (variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń. Ich charakterystyczną cechą jest wysoki polimorfizm. Oznacza to, że w populacji występują w wielu formach allelicznych, które różnią się między sobą liczbą powtórzeń motywu. W przypadku sekwencji minisatelitarnych związanych z jednostkami chorobowymi można wyróżnić zakres prawidłowy (niechorobotwórczy) i nieprawidłowy (chorobotwórczy) powtórzeń. Czasami występuje również tzw. premutacja. Premutacja pojawia się z chwilą kiedy zakres motywu jest większy od prawidłowego ale nie wywołuje objawów klinicznych i jest wysoce niestabilny. Prawidłowy zakres powtórzeń C₄GC₄GCG w genie CSTB wynosi 2-3, premutacja 12-17 a zakres chorobotwórczy obejmuje 30-80 powtórzeń.

Mutacja ta występuje z ok. 90% częstością w przebadanych allelach pochodzących od osób chorych. Ponadto w obrębie regionu transkrypcyjnego może pojawiać się 6 mutacji punktowych. U chorych mutacje te zaobserwowano w 10% przebadanych alleli. Pod względem rodzaju mutacji wywołującej objawy choroby, pacjenci mogą być homogeniczni (ekspansja C₄GC₄GCGwystępuje na obu allelach) lub heterogeniczni (ekspansja C₄GC₄GCG na jednym allelu a na drugim mutacja punktowa).

Do tej pory poznano 6 mutacji punktowych genu CSTB. Trzy spośród nich: G1925C, G2027A i A2353G zakłócają procesy splicingowe. Dwie mutacje obecne w egzonie 3: C2388T i del2400TC powodują zmianę ramki odczytu lub powstanie kodonu nonsensownego; konsekwencją tych procesów jest skrócenie długości kodowanego peptydu. Szóstą znaną mutacją jest transwersja w egzonie 1: G426C, w rezultacie czego dochodzi do zmiany sekwencji aminokwasowej białka - glicyna zostaje zastąpiona przez argininę w pozycji 4 (Gly4Arg).

Wydłużone sekwencje w zakresie chorobotwórczym i związane z premutacją charakteryzują się niestabilnością. Mutacje CSTB są przekazywane z pokolenia na pokolenie jako zmienione, wydłużone lub skrócone sekwencje. Długie fragmenty (600-800 bp) w 100% składające się z guaniny i cytozyny łatwo ulegają błędom replikacyjnym czego skutkiem są ekspansje alleli EPM1.

Gen CSTB koduje białko – cystatynę B. Ten, zbudowany z dziewięćdziesięciu ośmiu aminokwasów, peptyd jest odwracalnym inhibitorem proteazy cysteinowej. Występuje praktycznie we wszystkich tkankach zarówno zewnątrz- jak i wewnątrzkomórkowo. Kontroluje aktywność endogennych proteaz i chroni organizm przed degradacją białek przez egzogenne proteazy cysteinowe.

Obecna u pacjentów z EPM1 mutacja sekwencji minisatelitarnej C₄GC₄GCG genu CSTB znajduje się poza obszarem transkrypcyjnym i powoduje obniżenie poziomu ekspresji tego genu. Jak udowodniono, do bardzo znacznej redukcji poziomu mRNA dochodzi w komórkach leukocytów krwi pacjentów. W fibroblastach i limfoblastach poziom mRNA utrzymuje się na normalnym poziomie lub ulega redukcji tylko w niewielkim stopniu.

EPM1 jest dobrze klinicznie zdefiniowaną jednostką. Choroba ta może pojawić się w każdej populacji. Jednakże łatwo pomylić ją z młodzieńczą padaczką miokloniczną (juvenile myoclonic epilepsy – JME) lub chorobą ciałek Lafora (Lafora body disease). Wszystkie trzy zespoły chorobowe charakteryzują się miokloniami, uogólnionymi napadami toniczno-klonicznymi, napadami nieświadomości, otępieniem oraz tym, że pierwsze objawy pojawiają się w wieku dziecięcym. To powoduje, że w krajach, gdzie EPM1 nie jest dobrze poznana i częstość jej występowania jest niska, symptomy tej choroby nie zawsze muszą być prawidłowo rozpoznane lub zakwalifikowane, rezultatem czego jest błędna albo spóźniona diagnoza.

Opisane powyżej zjawisko zaobserwowano ostatnio w Holandii. W obrębie 21 osobowej grupy pacjentów, u których wcześniej klinicznie zdiagnozowano młodzieńczą padaczkę miokloniczną lub epilepsję z miokloniami jako głównymi objawami choroby.

3. Ataksje rdzeniowo-móżdżkowe

Ataksje rdzeniowo-móżdżkowe (SCA) to choroby neurodegeneracyjne cechujące się autosomalnym dominującym wzorem dziedziczenia. Ponadto charakteryzują je inne wspólne cechy takie jak: postępujące zaburzenia neurologiczne, późny wiek zachorowania i antycypacja.

Defekt genetyczny warunkujący wystąpienie tych chorób określa się mianem mutacji dynamicznych, które polegają na zwielokrotnieniu trójnukleotydowej sekwencji CAG. Obecnie znanych jest 9 typów ataksji rdzeniowo-móżdżkowych powodowanych mutacjami dynamicznymi: SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA12, SCA17.

W populacji ogólnej liczba powtórzeń CAG w obrębie genów SCA1 i SCA2 wykazuje duży polimorfizm, ale ma specyficzny zakres prawidłowych wartości. Jeżeli liczba powtórzeń CAG przekroczy ów zakres to staje się przyczyną patologicznych zmian prowadzących do wystąpienia ciężkich chorób neurodegeneracyjnych.

SCA charakteryzuje również zjawisko antycypacji czyli tendencja do wcześniejszego występowania objawów i cięższego przebiegu choroby w kolejnych pokoleniach. Przyczynę tego zjawiska upatruje się w dużej niestabilności alleli zawierających patogenną liczbę powtórzeń CAG, szczególnie w przypadku gdy gen z ekspansją przekazywany jest dziecku przez chorego ojca (ma to duże znaczenie w poradnictwie genetycznym).

Ataksje rdzeniowo- móżdżkowe charakteryzują się również wyraźnym zróżnicowaniem rozmieszczenia geograficznego chorych z poszczególnymi typami SCA. Na podstawie kilkuletnich badań molekularnych przeprowadzonych w IPiN wiadomo iż na terenie Polski występują głównie dwa typy ataksji: SCA 1 i 2, co znacznie różni nasz kraj od pozostałych krajów w Europie i Azji. Na przykład w sąsiednich Niemczech dominującym typem ataksji jest SCA3, jak również w Portugalii i Brazylii. Taki nierównomierny rozkład geograficzny występowania tych chorób może wskazywać na istnienie tzw. efektu założyciela.

Zjawisko to polega na tym, że współcześni nosiciele zmutowanego genu odpowiadającego za określoną jednostkę chorobową są potomkami jednej osoby, która miała allel genu SCA powtórzeń liczbą powtórzeń CAG jeszcze w zakresie prawidłowym, ale wyższą niż ogólnej populacji, predysponujący do wystąpienia choroby w następnych pokoleniach; w niedużej populacji może to wiązać się zwiększeniem częstości występowania zmutowanego genu. Zjawisko to pojawia się więc na obszarze, gdzie znajdują się allele ze stosunkowo dużą liczbą powtórzeń CAG, i w związku z tym z większą tendencją do ekspansji.

Jednym z celów projektu badawczego będzie zatem analiza molekularna wybranych zestawów markerów genetycznych współwystępujących z genami SCA1 lub SCA2 i segregującymi łącznie z nimi. Określane są one jako haplotyp. Jeżeli loci tych markerów znajdują się w bardzo bliskim sąsiedztwie analizowanych genów to wystąpienie rekombinacji pomiędzy nimi zdarza się bardzo rzadko. Stąd odpowiednie allele na ogół przekazywane są łącznie w danej rodzinie (populacji, grupie).

4. Choroba Huntingtona (HD)

Choroba Huntingtona (HD) jest dziedziczną chorobą zwyrodnieniową oun obejmującą korę mózgu i jądra podkorowe. Następstwem uszkodzeń tych obszarów są zaburzenia neurologiczne i psychiczne prowadzące do całkowitej utraty zdolności do samodzielnego życia.

Podstawowymi objawami choroby są postępujące otępienie i mimowolne ruchy pląsawicze, początkowo dotyczące tylko ograniczonych grup mięśniowych, głównie twarzy i kończyn górnych, a w późniejszym stadium choroby prowadzące do stałego niepokoju ruchowego pacjenta. Choroba Huntingtona występuje w większości populacji kaukaskich z częstością 1:10.000 osób. Jest chorobą nieuleczalną, która ze względu na wyjątkowo uciążliwy przebieg zarówno dla chorego jak i jego otoczenia oraz rodzinny charakter występowania stanowi poważny problem społeczny. Jest to choroba dziedziczna, przekazywana jako cecha autosomalna dominująca o pełnej penetracji. Ponadto obserwuje się również występowanie zjawiska antycypacji czyli wcześniejszego wystąpienia objawów choroby i cięższego jej przebiegu w kolejnych pokoleniach. U większości chorych kliniczne objawy występują pomiędzy 35 a 50 rokiem życia. W części przypadków choroba może ujawnić się już przed 20 rokiem życia jako młodzieńcza postać choroby.

Badania nad podłożem genetycznym pozwoliły na odkrycie genu związanego z wystąpieniem choroby i wyjaśnienie zjawisk antycypacji. Już w 1983 r. wiadomo było, że obszar odpowiedzialny za wystąpienie choroby znajduje się w regionie telomerowym krótkiego ramienia chromosomu 4. Po 10 latach intensywnych badań gen IT15, którego mutacja powodowała wystąpienie choroby Huntingtona został sklonowany i zsekwencjonowany.

Okazało się, że w pierwszym egzonie tego genu znajduje się szlak złożony z powtórzonych sekwencji CAG. Region powtórzeń jest silnie polimorficzny a liczba powtórzeń CAG może mieć zakres 9 – 34 powtórzeń CAG u osób zdrowych.

Mutacja powodująca chorobę Huntingtona jest mutacją dynamiczną i polega na ekspansji liczby powtórzeń CAG poza zakres prawidłowy. Nieprawidłowa liczba powtórzeń jest na ogół dziedziczona w sposób niestabilny i ulega dalszej ekspansji przy przekazywaniu z pokolenia na pokolenie, przy czym w przypadku dziedziczenia odojcowskiego częściej obserwuje większe zmiany liczby CAG. Diagnostyka genetyczna polega na ustaleniu liczby powtórzeń CAG w genie IT15 u badanej osoby.

Zespół badawczy

Zespół badawczy wyodrębniony do realizacji projektu składa się z pracowników Zakładu Genetyki, Instytutu Psychiatrii i Neurologii.

1. Profesor doc. dr hab. Jacek Zaremba – kierownik Zakładu Genetyki, specjalista w dziedzinie neurologii i genetyki klinicznej oraz poradnictwa genetycznego

2. dr n. med. Anna Sułek-Piątkowska – genetyk molekularny specjalizujący się w dziedzinie laboratoryjnej diagnostyki molekularnej

3. dr n. med. Elżbieta Zdzienicka, specjalista w dziedzinie neurologii i genetyki klinicznej oraz poradnictwa genetycznego

4. dr n. med. Jolanta Kubalska, specjalista w dziedzinie pediatrii i genetyki klinicznej oraz poradnictwa genetycznego

5. mgr Wioletta Krysa, genetyk molekularny specjalizujący się w dziedzinie laboratoryjnej diagnostyki molekularnej

6. mgr Marta Rajkiewicz – doktorantka specjalizująca się w genetyce molekularnej

7. lek. med. Anna Tomankiewicz-Zawadzka, lekarz specjalizujący się w dziedzinie genetyki klinicznej oraz poradnictwa genetycznego

8. doc. dr n. med. Elżbieta Fidziańska

Znaczenie przewidywanych wyników dla nauki i praktyki,
Uzyskane wyniki pozwolą na określenie haplotypów dziedziczonych wraz ze zmutowanymi genami SCA1 i SCA2 oraz zbadanie czy na terenie naszego kraju występuje efekt założyciela. Analiza wewnątrzrodzinnej zmienności sekwencji CAG pozwoli dokładnie scharakteryzować zjawisko antycypacji bardzo znamienne dla chorób wywołanych przez mutacje dynamiczne. Ponadto możliwe będzie porównanie rezultatów z podobnymi badaniami przeprowadzonymi w innych krajach. Dotychczas nie zbadano efektu założyciela w SCA1, a materiał, którym dysponujemy jest unikalny pod względem liczebności. Uzyskane wyniki badań będą miały duże znaczenie dla poradnictwa genetycznego i profilaktyki ataksji rdzeniowo-móżdżkowych w Polsce.
Innowacyjność projektu „Analiza molekularna w chorobach neurodegeneracyjnych spowodowanych mutacjami dynamicznymi”.
Wszystkie aspekty badawcze mają charakter unikatowy. Do tej pory w Polsce nie zostały przez nikogo podjęte badania zespołu FXTAS, EPM1 i badania efektu założyciela chorób neurodegeneracyjnych takich jak SCA i HD. Z uwagi na to, że częstość występowania chorób neurodegeneracyjnych spowodowanych mutacjami dynamicznymi może być odmienna w różnych populacjach, wyniki badań dla polskiej populacji będą cennym uzupełnieniem danych światowym. Możliwość podjęcia tych badań związana jest prowadzona wcześniej działalnością diagnostyczną i naukową Zakładu Genetyki oraz zgromadzoną wcześniej wielką liczbą próbek DNA (ok. 10 000), co stanowi materiał do dalszych planów naukowych.
Znaczenie przewidywanych wyników realizacji całego projektu w wymiarze opieki zdrowotnej i profilaktyki zdrowia

1. 
   Wprowadzenie w skali kraju diagnostyki molekularnej trzech jednostek chorobowych: FXTAS, wczesnego klimakterium i padaczki mioklonicznej typu 1
   
2. 
   Rozwinięcie poradnictwa genetycznego w oparciu o lepsze możliwości diagnostyczne
   
3. 
   Wprowadzenie badań przedobjawowych i prenatalnych związanych z planowaniem rodziny
   
4. 
   Wszystkie uzyskane wyniki będę miały znaczenie poznawcze i przyczynią się do planowania dalszych badań w dziedzinie neurogenetyki
   

Ponadto wyniki uzyskane w ramach realizacji projektu będą miały wymiar społeczny związany z poprawą świadomości lekarzy i pacjentów, wzajemnym wspieraniem się rodzin pacjentów zrzeszonych w stowarzyszeniach i świadomym planowaniem życia i rodziny.