Combinatorial thinking in chemistry and biology

Combinatorial Synthesis and Screening of a Small
Molecule Library of Cathepsin D Inhibitors (Ellman)
The identification of a number of nonpeptide inhibitors of
cathepsin D, a proteolytic enzyme implicated in a number of
inflammation processes, provided a good example of the issues
to be considered when using combinatorial synthesis and
evaluation approaches. Cathepsin D is a proteolytic enzyme (it
cleaves other proteins) that induces localized increases in
vascular permeability, fluid accumulation, and inflammation.
Any specific inhibitor of cathepsin D could be an effective
anti-inflammatory agent, as well as a potentially useful drug
for several other pathogenic conditions. A number of relatively
nonspecific inhibitors of the enzyme have been characterized.
The experimental problem is to alter any of these compounds
to make it bind more tightly, while also increasing its speci-
ficity. Stated differently, the goal is to produce an inhibitor that
only binds to cathepsin D at low concentrations, while avoiding
the hundreds of similar enzymes in the body. The one-by-one
synthesis of individual variants of these inhibitors would be a
slow and costly endeavor. However, methods have been de-
veloped by the Ellman Lab (ref. 10 and E. K. Kick, D. C. Roe,
A. G. Skillman, G. Liu, T. J. A. Ewing, Y. Sun, I. D. Kuntz, and
J.A.E., unpublished work) that describe how to create a
‘‘scaffold’’ or precursor of an inhibitor with several positions
capable of coupling to many different chemical groups of
similar reactivity, but different structure (Fig. 1 A). This is an
excellent problem for combinatorial methods, because the
investigators need to sample a large number of variations of a
specific molecule through many different combinations of
chemical groups.
Rather than conducting a ‘‘random’’ combinatorial synthe-
sis, diverse chemical groups were incorporated at two specific
positions on a hydroxyethylamine molecule (Fig. 1), which is a
stable analog of a reaction intermediate formed by cathepsin
D. Amines were used to introduce diversity at one site on the
scaffold, and acylating agents, such as carboxylic acids and
sulfonyl chlorides served to introduce various groups at an
additional site. Exhaustive combination of all commercially
available amines and acylating agents would provide a library
of over 10 billion compounds. While a library of this size could
theoretically be prepared, it would require that thousands of
building blocks be introduced at each position resulting in
considerable expense and effort in both synthesis and evalu-
ation.
The Ellman group, in collaboration with Irwin Kuntz and
coworkers at University of California, San Francisco, chose to
design two smaller libraries. Two alternative computational
methods were used to select the chemical groups to be
combined and displayed. A computational program designed
to maximize diversity was used to select the building blocks for
one library (the diverse library). Structure-based design, using
the crystal structure of cathepsin D, was used to select the
building blocks for the second library (the directed library).
The chemical reactions were optimized for solid-phase
synthesis and both libraries, each containing 1000 separate
compounds, were prepared by parallel synthesis (Fig. 1 A). The
key feature of this strategy was the development of useful,
highly reactive leaving groups, incorporated at specific posi-
tions on the scaffold of the core molecule. These groups ensure
uniform, high yields of coupling with many different com-
pounds, so that the final product at each position in the library
is of sufficient amount and purity to be directly assayed without
further purification. The ability to successfully optimize and
exploit this strategy has been the critical step in creating and
screening combinatorial libraries of small molecules. Spatial
addressing was achieved by synthesizing the compounds on
plastic pins in different reaction vessels. Each compound in the
libraries was then screened for inhibitory activity against
cathepsin D with the assay performed simultaneously in the
reaction vessels. The directed library yielded a ‘‘hit rate’’ of
6–7% at inhibitor concentrations of 1
3
10
2
6
M, with the most
potent compound having a relatively tight inhibitor dissocia-
tion constant of 78
3
10
2
9
M. The diverse library provided
Table 1.
Summary of combinatorial experiments described in this session
Cathepsin D inhibitors
Human growth hormone
Library type
Small organic molecules
Protein site-directed mutants
Synthesis method
Solid-state, spatially addressable
Recombinant DNA and viral
display
Theoretical diversity
Greater than 10
9
Greater than 20
185
(based on available synthetic reagents)
(total randomization)
Actual library size
Two libraries, 1,000 members each
Greater than 10
7
Target molecule
Cathepsin D (protease enzyme)
Growth hormone receptor
Desired effect
Inhibition of enzyme
Binding to receptor and
antagonism of signalling
Screening method
Individual enzyme inhibition assays
Collective screening of
recombinant virus
Optimization?
Use of directed library starting with
crystal structure of enzyme complex
Selection and amplification of
tight-binding viral clones
From the Academy: Ellman et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997)
2781
Downloaded from https://www.pnas.org by 213.230.111.12 on June 5, 2023 from IP address 213.230.111.12.

---

inhibitors
.
4-fold less potent, indicating the superiority of the
directed library. A number of more potent inhibitors of
cathepsin D were then rapidly identified by synthesizing and
screening a small second library that explored variants of the
most active compounds. It is anticipated that these general
methods will be extended to many other enzyme targets.