Proteazlar biotizimlarda hamma joyda mavjud bo'lib, ular hujayralar va organizmlarning biokimyoviy, fiziologik va tartibga solish jihatlarida turli XIL rollarga EGA

Abstrakt
Proteazlar biotizimlarda hamma joyda mavjud bo'lib, ular hujayralar va organizmlarning biokimyoviy, fiziologik va tartibga solish jihatlarida turli xil rollarga ega. Proteazlar sanoat fermenti bozorining eng katta segmentini ifodalaydi, ular yuvish vositalarida, oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda, teri va matolarni yangilashda, organik sintezda katalizator sifatida va terapevtik vositalar sifatida ishlatiladi. Mikrobial proteazalarni haddan tashqari ishlab chiqaradigan shtammlar an'anaviy skrining, mutatsiya/tanlash strategiyalari va genetik muhandislik yo'li bilan ishlab chiqilgan va o'ziga xosligi yoki barqarorligi o'zgargan butunlay yangi fermentlar saytga yo'naltirilgan mutagenez va yo'naltirilgan evolyutsiya kabi usullar orqali ishlab chiqilgan. Asosiy Bacillus va Aspergillus ishlaydigan hujayradan tashqari ferment ishlab chiqaruvchilari va boshqa qiziqish turlarining genomlarining to'liq ketma-ketligi mahalliy proteazalarning ishlab chiqarish rentabelligini oshirishga, shuningdek, geterologik proteazalarni ishlab chiqarishga yordam berdi. Yillik proteaz sotuvi taxminan 1,5-1,8 milliard dollarni tashkil qiladi, proteazlar fermentlar umumiy bozorining 60 foizini tashkil qiladi. Yillik bozori taxminan 1 milliard dollar bo'lgan detarjan proteazlari eng katta proteazlarni qo'llash segmentini tashkil qiladi. Subtilisin Carlsberg va tegishli subtilisin serin proteazalari pH optimalligi 9-10 bo'lgan detarjan proteazlarining birinchi avlodini ifodalaydi. Ikkinchi avlod, yuqori pH optima (10-11) va yuqori harorat barqarorligi, Bacillusclausii va B. halodurans, shu jumladan, ishqoriy shtammlari ishlab chiqarilgan. Uchinchi avlod detarjen proteazlaridan iborat bo'lib, ularning faol joylari va / yoki barqarorligi oqsil muhandisligi bilan o'zgartirilgan. Oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda proteazlarning asosiy qo'llanilishi pivo tayyorlash, don pyuresi va pivo tumanini tozalash, pishloq tayyorlashda koagulyatsiya bosqichida, pishirishda xamirning viskoelastik xususiyatlarini o'zgartirish va oqsil gidrolizatlarini ishlab chiqarishda. Organik sintezda proteazlar karboksilik kislotalarni o'z ichiga olgan peptid, ester va amid bog'larining sintezi va/yoki gidrolizida qo'llaniladi va enantiomerlar juftligini ajratish uchun samarali vositadir. Proteazlar ovqatlanishda ovqat hazm qilish uchun yordamchi vosita sifatida, tromboz va saratonni davolashda qo'llaniladi. Giperproteolitik endogen faollik g'ayritabiiy fiziologik faoliyatda, shuningdek, mikrobial va virusli patofiziologik sharoitlarda muhim rol o'ynashi mumkin va bu proteaz inhibitörlerini kasallik qo'zg'atuvchi proteazalarga qarshi terapevtik vositalar sifatida rivojlanishi uchun sezilarli impuls yaratdi.

Bu O.P. Uordning qayta nashri, 3.49 - Proteazlar, muharrir: Murray Mu-Yang, Kompleks biotexnologiya (ikkinchi nashr), Akademik nashriyot, 2011, 571-582-betlar.

O'tish:
Lug'at
Aspartam, l-phenilalanin va l-aspartik kislotadan ishlab chiqarilgan, l-phe-l-asp-metil ester tuzilishga ega bo'lgan sintetik past kaloriyali tatlandırıcı.BOTOX, BoNT, botulinum toksinClostridium botulinum tomonidan ishlab chiqarilgan neyrotoksin, oziq-ovqat zaharlanishi uchun javobgardir. ruxga bog'liq metalloproteaza. Ximozin emizayotgan buzoqning haqiqiy oshqozoni yoki abomasumidan olingan ustun sut ivish fermenti. Yo'naltirilgan evolyutsiya. Protein muhandisligida kerakli xususiyatlarga ega oqsillarni ishlab chiqarish uchun Darvin tanlovi kuchidan foydalanish uchun ishlatiladigan usul. Endoproteazlar Ichki peptidlarga hujum qiluvchi proteazlar peptid zanjiri C- yoki N-terminaldan uzoqda. GRAS roʻyxati. Fermentatsiya va oziq-ovqat jarayonlarida qoʻllaniladigan, AQSh oziq-ovqat va farmatsevtika idorasi tomonidan “umuman xavfsiz deb topilgan” mikroorganizmlar roʻyxati. Geterologik oqsil ishlab chiqarish Xostda xorijiy oqsillarning sintezi boshqa organizm genlarini tashuvchi vektor tomonidan bu organizmning transformatsiyasidan keyin organizm.k-pishloqdagi kazein koagulyatsiya k-kazein sutdagi mitsellalarni suspenziyada saqlashga xizmat qiladi. Pishloq ishlab chiqaruvchi protea, shirdon sutning k-kazein fraktsiyasidagi yagona o'ziga xos peptid bog'lanishini gidrolizlaydi, natijada sut mitsellalari va koagulyatsiyasi beqarorlashadi. Proteaza muhandisligi Yangi yoki sun'iy aminokislotalar ketma-ketligi bilan proteazalarni yaratish texnikasi. Proteazoma Katta ko'p komponentli bochka. -turli xil oqsillarni qisqa polipeptidlar va aminokislotalarga aylantiruvchi proteaza kompleksi.SubtilisinA serin endopeptidaza dastlab B. subtilisdan xarakterlanadi, lekin ko'p Bacillus turlaridan ko'p miqdorda ajralib chiqadi.
3.49.1. Kirish
Proteazlar gidrolitik fermentlarning katta va xilma-xil guruhini ifodalaydi, ular ta'sir qilish joyi, ferment faol joyining tuzilishi va o'ziga xos reaktsiya mexanizmlari bo'yicha tasniflanadi. Proteazlar biologiyada hamma joyda mavjud bo'lib, ular hujayra va organizm funktsiyalarining ko'p jihatlarida, jumladan ovqatlanish, oqsil almashinuvi, o'sish, moslashish, tartibga solish, sporulyatsiya va unib chiqish, kasallik va o'limda biokimyoviy va yoki fiziologik ishtirokga ega. Proteazlar inson tanasida sodir bo'ladigan ko'p narsalarni, shu jumladan differentsiatsiya, harakatlanish, bo'linish va hujayra o'limi kabi muhim hujayra funktsiyalarini tartibga soladi. Proteazlar fiziologik jihatdan hujayra ichidagi oqsil parchalanish jarayonlarida, shu jumladan lizosomalar (proteazalarni o'z ichiga olgan membrana bilan bog'langan organellalar) va tashqi halqalari juda katta oqsil barreliga o'xshash to'rt halqali komplekslardan tashkil topgan yaqinda tavsiflangan proteazoma tizimi yordamida fiziologik jihatdan ishtirok etadi. markaziy teshikka kiradigan oqsillar uchun eshik vazifasini bajaradi, ichki halqalarning ichki yuzalarida esa proteolitik faol joylar mavjud.9 Proteazoma proteolitik mexanizmlari treoninning faol joyini o'z ichiga oladi va uch xil ximotripsinga o'xshash, tripsinga o'xshash va peptidil-glutamilni o'z ichiga oladi. peptid gidrolizlovchi substratning o'ziga xos xususiyatlari. Proteoliz fiziologik jihatdan fermentlarni va boshqa oqsilga asoslangan yoki bog'langan effektorlarni kovalent faollashtirish, tartibga solish va inhibe qilish uchun ishlatiladi, masalan, qon ivishiga olib keladigan biokimyoviy kaskadda va insulin ishlab chiqarishda. Proteazlar membranalar orqali tashish/sekretsiyasidan keyin peptidlarning signal ketma-ketligini olib tashlaydi va tarjimadan keyin N-terminal metionin qoldiqlarini olib tashlaydi.

Hayvonlar, o'simliklar va, ayniqsa, mikrobial proteazlar sanoat fermenti bozorining eng katta va eng muhim segmentini ifodalaydi, ular yuvish vositalarida, oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda, teri sanoatida, organik sintezda biokatalizatorlar va terapevtik vositalar sifatida ishlatiladi. Proteazlar ba'zi kasalliklarning qo'zg'atuvchisi sifatida ham ishlaganligi sababli, proteaz inhibitörleri terapevtiklar sinfi sifatida ham ishlab chiqilgan. Mikrobial proteazlarni ishlab chiqarish uchun tijorat fermentatsiya jarayonlari taxminan 1950-yillardan boshlab ishlab chiqilgan. Aspergillus, Rhizopus va Bacillus turlarini o'z ichiga olgan ishchi proteaz ishlab chiqaradigan ba'zi shtammlar an'anaviy fermentlangan oziq-ovqat fermentatsiyasida topilgan turlar bilan bir xil bo'lib, ularning proteazlari oqsillarning parchalanishida ishtirok etgan va shu bilan bog'liq holda qattiq pyure substratlarida turli xil ta'mlar paydo bo'lgan. soya loviya, don donalari va boshqa o'simlikka asoslangan oziq-ovqat materiallari. Proteaz ishlab chiqarish fermentatsiya jarayonlari va sharoitlari mikroblarning o'sishi va ferment ishlab chiqarishga ta'sir qiluvchi omillarni tavsiflash va nazorat qilish orqali optimallashtirildi. Haddan tashqari ishlab chiqaruvchi shtammlar keng qamrovli skrining jarayonlari orqali ajratildi va murakkab mutatsiya/seleksiya protseduralarini qo'llash orqali yanada takomillashtirildi. Gen injeneriyasidagi ishlanmalar, shu jumladan turli xost organizmlarida rekombinant oqsillarni ifodalash qobiliyati, transkripsiya, translatsiya, sekretsiya va boshqa jarayonlarni manipulyatsiya qilish va kuchaytirish qobiliyati proteaz ishlab chiqarishni kuchaytirish va ulardan foydalanish texnoiqtisodiyotini ta'kidlash uchun foydalanilgan. Kinetika, o'ziga xoslik va barqarorlik kabi xususiyatlarni o'zgartirish uchun oqsillarni muhandislik qilish qobiliyati proteaz ilovalarini yaxshilash yoki kengaytirish uchun qo'llanilgan. Tasodifiy va saytga yo'naltirilgan mutagenez va boshqa usullar, ayniqsa, butunlay yangi proteaz tuzilmalarining biokatalitik va barqarorlik xususiyatlarini loyihalash, qurish va tavsiflashda foydali bo'ldi.

Sanoat fermentlari bozorining taxminiy hajmi yiliga taxminan 2,5-3 milliard dollarni tashkil etadi, bu oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda qo'llaniladigan fermentlardan (~ 800 million dollar), hayvonlar uchun ozuqa uchun fermentlardan (~ 400 million dollar) va nooziq-ovqat/oziq-ovqat fermentlaridan iborat. 1,4–1,7 milliard dollar). Fermentlar bozorining eng katta ulushiga ega bo'lgan kompaniyalar Novozymes (http://www.novozymes.com/en), Genencor International (http://www.genencor.com) va DSM (http://DSM. com/en_US/dnp/anh_enzymes.htm), tegishli bozor ulushlari taxminan 41%–44%, 21% va 8%. Ba'zi yapon kompaniyalari, shu jumladan Shin Nihon, qattiq madaniyat (koji) jarayonidan foydalangan holda fermentlarni ishlab chiqarish va tijoratlashtirishda davom etmoqda (http://www.aichi-brand.jp/corporate/type/chemical/shin-nihon-e.html). Amano Enzyme Group biotransformatsiyalar, diagnostika va xun takviyeleri (http://www.amano-enzyme.co.jp/aeu/product/presentation.html) sifatida asosiy qo'llanilishi bilan ko'proq ixtisoslashgan fermentlarni ishlab chiqaradi.
Ko'rsatilgan internet saytlari va boshqalar proteazlarning asosiy qo'llanilishi, shuningdek, yangi tadqiqotlar, texnologiya va texnik hisobotlar va nashrlarga havolalar haqida qimmatli ma'lumotlarni taqdim etadi. Asosan Osiyo, Yevropa va Shimoliy Amerikada joylashgan boshqa kompaniyalar qoldiq taxminan 27-30% ni tashkil qiladi. Proteazlar fermentlar bozorining 60 foizini yoki yiliga 1,5-1,8 milliard dollarni tashkil qiladi. Proteaz ilovalari orasida eng ko'p foydalanish yuvish vositalarida bo'lib, yiliga taxminan 1 milliard dollarlik gidroksidi proteazni sotishni hisobga oladi.

Proteazlarning sanoatdagi ahamiyati haqidagi dalillarni AQSh Patent va savdo belgilari idorasi (USPTO) saytida (http:/) berilgan AQSh patentlari (1976-2010-yil iyul) va patent talabnomalarini (2001-2010-yil iyul) oddiy qidiruvdan ham olish mumkin. /patft.uspto.gov/netahtml/PTO/search-bool.html) 1-jadvalda ko'rsatilganidek. Shuni ta'kidlash kerakki, ma'lumotlarning bir-biriga o'xshashligi bor, chunki 2001 yildan beri so'ralgan va berilgan patentlar ikkala sarlavha ostida ham hisobga olinadi. "Proteaz" qidiruvda "mavhum" va "da'volar" maydonlariga alohida qo'llaniladigan dastlabki "atama" sifatida ishlatilgan. Ikkinchi qidiruvda "proteaz inhibitori" qidiruv so'zi ishlatilgan. Taxminlarga ko'ra, bu ikki raqam o'rtasidagi farq, ya'ni "proteaz inhibitörleri" emas, balki proteazlar, berilgan patentlar va proteazlarni o'z ichiga olgan arizalar sonining yaxshi ko'rsatkichini beradi. So'nggi 10 yil ichida proteaz bilan bog'liq da'volar bilan 6000 ga yaqin patentlar topshirildi.

AQSh Patent idorasi tomonidan chiqarilgan proteazlar va proteaz ingibitorlariga tegishli tanlangan so'nggi patentlarning (2008-10) namunalari mos ravishda 2 va 3,3-jadvallarda keltirilgan. Proteaz patentlari orasida shtammi va detarjen bilan bog'liq proteazlar, hayvonlar uchun ozuqalar, terapevtik ilovalar, tozalash usullari, diagnostika va aniqlash tahlillari va molekulyar usullarni qo'llash, shu jumladan ekspression tizimlar, immunogen proteaz vositachiligidagi usullar va proteazalarga qaratilgan antikorlar, ishlab chiqilgan proteazlar va proteazni faollashtiruvchi omillar. Proteaz inhibitörlerinin patentlari orasida proteaz faol toifalariga, xususan aspartik, serin va sistein proteazalariga yoki patogen proteazalarga, shu jumladan gepatit, inson immunitet tanqisligi virusi (OIV), og'ir o'tkir respirator sindrom (SARS) yoki bezgakka qarshi qaratilgan inhibitorlar diqqatga sazovordir. kasalliklarga, shu jumladan ba'zi diabetik holatlarga qarshi. Bundan tashqari, ko'plab hujjatlar ingibitorlar, jumladan, heterosikllar, sulfanilamidlar, pirimidinlar, xinolinlar, ketoamidlar, aminoalkanlar va almashtirilgan peptidlar sifatida harakat qiluvchi maxsus kimyoviy guruhlar yoki analoglarga qaratilgan. Ushbu jadvallar intellektual mulkni himoya qilish kontekstida ushbu sohadagi joriy tadqiqotlar va texnologik ishlanmalarning keng ko'lamini ko'rsatadi.
Proteaz turlari
Turli xil proteazlar bu erda qisqacha tavsiflanadi va iloji bo'lsa, har bir turning tijorat ahamiyatga ega misollariga urg'u beriladi. Reaktsiya mexanizmlarini batafsilroq muhokama qilish uchun o'quvchi, shuningdek, Rao va boshqalar, 12 Ward va boshqalar, 20 va Fujinami va Fujisawa ga murojaat qilinadi. , aminopeptidazalar va karboksipeptidazalar sifatida tasvirlangan, ularning ta'siri peptid substratlarining N- yoki C-terminallarida ekanligini ko'rsatadi. Ushbu fermentlar, masalan, aminokislota, dipeptid yoki tripeptid bo'ladimi, ajratilgan qismning hajmiga qarab yanada farqlanishi mumkin. Aminopeptidazalarni ishlab chiqaradigan sanoat organizmlariga Aspergillus oryzae, Bacillus licheniformis, B otulinum stearothermophilus va Escherichia coli kiradi. Aspergillus, Penicillium va Saccharomyces kabi turlar tomonidan ishlab chiqariladigan karboksipeptidazalar, ularning faol joylarida ma'lum aminokislota o'rnini bosuvchi moddalar mavjudligiga ko'ra yana uch guruhga, ya'ni serin karboksiproteaza, metallokarboksiproteaz va sistein karboksiga ajratiladi.

C- yoki N-terminaldan uzoqda joylashgan peptid zanjiridagi ichki peptid aloqalariga hujum qiluvchi endoproteazlar o'ziga xos ta'sir mexanizmiga qarab quyidagi kichik guruhlarga bo'linadi:

1.
Katalitik reaksiyada ishtirok etuvchi faol joylarida serin qoldig'iga ega bo'lgan serin endoproteazlar keng o'ziga xos xususiyatlarga ega va haqiqatan ham bu fermentlar efir va amidlar hamda peptidlar ishtirokidagi gidrolitik reaksiyalarni katalizlaydi. Ushbu kichik guruhning muhim taniqli fermentlari orasida ximotripsinlar va subtilisinlar mavjud. Ko'pgina serin proteazlar 7-12 oralig'ida yuqori pH optimasiga ega, pH 9-10 oralig'idagilar serin gidroksidi proteazlar yoki birinchi avlod detarjen proteazalari deb nomlanadi va pH optimalligi 11-12 bo'lganlar yuqori deb nomlanadi. gidroksidi proteazlar, detarjen proteazlarning ikkinchi avlodi. Subtilisinlar Bacillus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan serin proteazlarning muhim oilasidir. Bu fermentlar, shuningdek, oksidlanishga chidamli aminokislota bilan fermentning faol joyi yaqinida oksidlanishga sezgir aminokislotalarni almashtirishni o'z ichiga olgan sayqallash va tegishli detarjan oksidlovchilari bilan oksidlanishga chidamli uchinchi avlod detarjen fermentlarini ishlab chiqish uchun boshlang'ich material bo'lgan. kislota. Ushbu fermentlar quyida tijorat Bacillus proteazlari ostida ko'rib chiqiladi.
2.
Aspartik endoproteazlar past pH optimasiga (3-4) ega, faol joylarida bir juft aspartik kislota qoldiqlarini o'z ichiga oladi va ikki guruhga bo'linadi: pepsinlar va pepsinga o'xshash fermentlar (masalan, Aspergillus, Penicillium va Rhizopus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan) va shirdon va shirdonga o'xshash fermentlar (masalan, Mucor pusillus, M. Miehei va Endothia turlari tomonidan ishlab chiqarilgan).
3.
Sistein/tiol endoproteazalari katalitik joylarida sistein-gistidin juftini o'z ichiga oladi va odatda katalitik faollikni ushlab turish uchun qaytaruvchi vositalarni talab qiladi va sulfidril reagentlar tomonidan denatüratsiya qilinadi yoki inhibe qilinadi. Kichik guruhlarga papain va papaga o'xshash fermentlar kiradi (jumladan, Clostridium histolyticum va Streptomyces turlaridan klostripain va streptopain).
4.
Metalloendoproteazlar. Biokataliz bog'langan ikki valentli kationning mavjudligini talab qiladi. Bu fermentlar etilendiamintetraasetik kislota tomonidan inhibe qilinadi, ammo sulfhidril reagentlar yoki diizopropilflorofosfat bilan emas. B. stearothermophilus tomonidan ishlab chiqarilgan yuqori termostabil neytral sink proteaz, termolizin ushbu kichik guruhning taniqli a'zosidir. Proteinning barqarorligi to'rtta kaltsiy atomi tomonidan kuchaytiriladi. Boshqa guruh aʼzolari orasida metalloproteaza kollagenazalar (C. histolyticum mikrob namunasi), neytral metalloproteaza elastaz (P. aeruginosa mikrob namunasi) va Myxobacter sp.dan ishqoriy hujayra devori litik proteaza I kiradi.
5.
Glutamik kislota va treonin endoproteazlari mos ravishda faol joydagi glutamik kislota va treoninning o'ziga xos ishtirokini o'z ichiga olgan reaktsiya mexanizmlariga ega bo'lgan yaqinda tavsiflangan yangi fermentlar oilalarini ifodalaydi.
Proteazlarning tasnifi va proteaz ta'sir mexanizmlari bilan bog'liq muhim havola MEROPS ni o'z ichiga oladi: peptidaza ma'lumotlar bazasi (http://merops.sanger.ac.uk/).

3.49.3. Asosiy sanoat manbalari/ishlab chiqarish jarayonlari

3.49.3.1. Hayvon va o'simlik fermentlarini ishlab chiqarish
Fermentlar qadim zamonlardan beri hayvonlardan olingan bo'lib, ularda buzoqning oshqozonida olib borilgan sutning ivishi kuzatilgan (buzoq shirdon yoki ximozin faolligi tufayli). Fermentning eng yaxshi manbai to'qilmagan buzoqlarning to'rtinchi oshqozoni bo'lib, u erda pepsin bilan birga mavjud, ammo pepsin va shirdon nisbati past. Daniyada Kristian Xansen buzoqning oshqozonini sho'r suv bilan ajratib olish orqali ximozinni tijorat ishlab chiqarishni boshladi. Xuddi shunday yondashuvlar sigir pepsini ishlab chiqarish uchun ishlatilgan. Odatda, ferment o'z ichiga olgan to'qimalar so'yish joyida tuzlash, muzlatish yoki quritish orqali saqlanadi. Tuzlangan oshqozon shirdonni olishdan oldin yuvilishi va quritilishi mumkin. Quritilgan buzoqning oshqozoni tilimga kesilishi, aralashtirilishi yoki maydalanishi va 5% dan 10% NaCl o'z ichiga olgan suv bilan ekstraktsiya qilinishi mumkin, bu esa bitta kuchli shirdon deb ataladi. Ikki yoki uch kuchli shirdon ishlab chiqarish uchun ultrafiltratsiya yordamida bitta quvvatli suyuq mahsulotning konsentratsiyasi qo'llaniladi.

Karika papayyasidan papain va Bromeliaceae ananas oilasidan bromelin kabi o'simlik proteolitik fermentlari ham tijorat maqsadida ishlab chiqarilgan. Bromelin bo'lsa, meva yig'ib olingandan keyin ananas o'simlikining ildiz komponenti tozalanadi, maydalanadi va eriydigan bromelin fermentini o'z ichiga olgan sharbat ekstraktini olish uchun presslanadi. Papain yashil mevalardan olinadi. Lateks erta tongda suyuqlik bilan to'ldirilgan mevalarda kesmalar qilish orqali chiqariladi. Lateks to'planishi mumkin bo'lgan meva yuzasida qotib qolishga moyildir. Yig'ilgan jelga o'xshash lateks majburiy havo yordamida 55 °C gacha bo'lgan haroratda tovoqlar ustida quritilishi yoki muqobil ravishda suyultirilishi, filtrlanishi va xom ferment ishlab chiqarish uchun purkagich bilan quritilishi mumkin. Keyingi tozalash suvning ekstraktsiyasini va erituvchini cho'ktirishni o'z ichiga olishi mumkin. Xom suvli ekstraktlardan bulutli va yopishqoq o'simlik polisaxaridlarini olib tashlash uchun uglevod/o'simlik saqichini depolimerizatsiya qiluvchi fermentlar qo'shilishi mumkin. Qayta ishlash jarayonida yoki yakuniy mahsulot suyuqlik shaklida bo'lganda, labil faol joy sulfhidril guruhlari natriy bisulfit qo'shilishi bilan himoyalangan.

Mikrob proteazlarini ishlab chiqarish
Fermentatsiya orqali fermentlarning dastlabki tijorat ishlab chiqarilishi bug'doy, kepak, soya fasulyesi va boshqalar kabi kraxmalli-oqsilli tarkibiy qismlardan foydalangan holda an'anaviy koji qattiq substratli sharqona oziq-ovqat fermentatsiyasidan kelib chiqqan. Ushbu usullar 1950-yillarning o'rtalarigacha Qo'shma Shtatlarda qo'llanilgan va hali ham Yaponiyada qo'llaniladi. AQShning Shimoliy mintaqaviy tadqiqot laboratoriyalarida penitsillin bilan suv osti madaniyati fermentatsiyasini ishlab chiqishdan so'ng, suv ostida fermentatsiyalar, shu jumladan proteazlar ishlab chiqarish, dastlab AQSh va Evropada oziq-ovqat va ichimliklarni qayta ishlashda qo'llash uchun ferment ishlab chiqarish uchun ishlab chiqilgan. Ushbu chuqur aralashtirilgan va gazlangan ishlab chiqarish fermentatorlari odatda 50-200 m3 ish hajmiga ega va "avtoklavlanish" sharoitlariga, ya'ni >15 psi va sterilizatsiya uchun >121 °C ga bardosh berishga mo'ljallangan. Shuni ta'kidlash kerakki, qattiq substrat fermentatsiyasida hosil bo'lgan fermentlarning umumiy aralashmasi suv osti madaniyatida bir xil shtamm tomonidan ishlab chiqarilgan tegishli ferment profiliga qaraganda ancha murakkabroq bo'ladi, bu substratning yanada murakkab tabiatini aks ettiradi. qattiq substrat fermentatsiyasida ishlatiladigan komponentlar. Qizig'i shundaki, qattiq substratda va suv ostida qolgan kulturalarda rekombinant Aspergillus shtammi tomonidan ishlab chiqarilgan ximozin hosildorliklari qattiq holatda kulturada ancha yuqori bo'lgan.

Sanoat fermentlari bozori 1960-yillarda ishqoriy proteazlar yuvish vositalarida foydalanish uchun birinchi marta tijoratlashtirilganida sezilarli darajada kengaydi. Proteaza ishlab chiqarishda ishlatiladigan eng muhim mikrobial shtammlar yuvish vositalarida va oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlashda qo'llaniladigan gidroksidi serin proteazlarini ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan Bacillus turlari va pivo tayyorlash va don pyuresi bilan bog'liq dasturlarda, shuningdek umumiy oziq-ovqatda ishlatiladigan neytral proteazlardir. qayta ishlash. Qo'ziqorin proteazlari oziq-ovqat mahsulotlarini qo'llash uchun ham ishlab chiqariladi, Aspergillus turlari dominant ishlab chiqaruvchilar sifatida. Bacillus va Aspergillus turlari oziq-ovqat proteazlarini ishlab chiqarish uchun jozibali xostlardir, chunki bu avlodlarning ko'p turlari an'anaviy oziq-ovqat fermentatsiyasida va ba'zi shtammlarda (B acillus subtilis, B. licheniformis, A spergillus niger va A.) ishtirok etishi uzoq vaqtdan beri ma'lum. oryzae) AQSh oziq-ovqat va farmatsevtika idorasining (FDA; http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/fcnNavigation.cfm?rpt=grasListing) GRAS ro‘yxatiga kiritilgan bo‘lib, bu organizmlar va ularning mahsulotlari ' odatda xavfsiz deb hisoblanadi.

Barcha asosiy sanoat mikrobial proteazlar madaniyat muhitiga hujayradan tashqari fermentlar sifatida chiqariladi. Bacillus va Aspergillus turlari yuqori o'sish sur'atlarini namoyish etadi va bu fermentatsiyaning qisqa muddatlariga yordam beradi. Ushbu turlarning biotexnologik jihatlari Schallmey va boshq.13 va Uord va boshqalar tomonidan muhokama qilingan. 19 Bakterial va zamburug'li fermentning yakuniy ishlab chiqarish fermentatsiya jarayonlari mos ravishda 2-4 va 3-5 kun davom etadi. Hujayradan tashqari ferment kontsentratsiyasiga 30 g L-1 gacha erishish mumkin. Fermentatsiyadan so'ng, biomassa santrifüjlash (bakteriyalar uchun) yoki filtrlash (filamentli zamburug'lar) bilan ajratiladi va tiniqlangan supernatant/filtrat odatda tijorat maqsadlarida foydalanish uchun kerakli yakuniy mahsulot kuchiga suyuqlik sifatida konsentratsiyalanadi. Ishqoriy proteazlar detarjan kukunlariga qo'shilishi kerak bo'lganda, suyuq konsentratlardagi fermentlar kukun shaklida quritiladi va keyinchalik ferment detarjenlarida mavjud bo'lgan xarakterli mum o'z ichiga olgan granulalar sifatida tayyorlanadi, bu esa foydalanuvchini proteaz changlarining kiruvchi inhalatsiyasidan himoya qiladi.

"Yovvoyi tipdagi" Bacillus ishqoriy proteazalari manba organizmlari va pH optimalligiga qarab fermentlarning ikki avlodiga ajratilgan. Ishqoriy proteaza fermentlarining uchinchi avlodi ularning xususiyatlarini yaxshilash uchun aminokislotalarni almashtirish orqali sun'iy ravishda ishlab chiqilgan. Bu detarjan fermenti bo'limida batafsilroq muhokama qilinadi. Bacillus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan tijoriy neytral proteazlar odatda pH optimalligi 7,0 yoki unga yaqin bo'lgan rux metalloproteazlari bo'lib, xamirturush o'sishini qo'llab-quvvatlash uchun aminokislotalar ishlab chiqarish, pyuresi paytida don ekstraktining tiklanishini optimallashtirish, ichimliklardan sovuqqa chidamli tumanni olib tashlash uchun pivo tayyorlashda qo'llaniladi. pivo kabi va soya, sut yoki boshqa tijorat protein preparatlarini o'zgartirish uchun.

Aspergillus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan eng muhim sanoat proteazlaridan biri bu A spergillus saitoi tomonidan ishlab chiqarilgan pepsinga o'xshash kislota proteazasi bo'lib, soya sousini ishlab chiqarishda soya oqsilini gidrolizlash uchun keng qo'llaniladi. A. oryzae tomonidan ishlab chiqariladigan asosiy tijorat kislota proteazasi endokimulyator fermenti bo'lib, natijada faqat oz miqdordagi erkin aminokislotalarni hosil qiladi, pH optimalligi 4-4,5. Ushbu ferment soya sousini ishlab chiqarishda foydalanish uchun yuqori karboksipeptidaza faolligiga ega bo'lgan proteaza bilan birlashtirilishi kerak, chunki bu soya sousida bo'sh aminokislotalarning yuqori konsentratsiyasi xarakterli lazzatga hissa qo'shadi. Aspergillusning turli xil turlari Aspergillopeptidaza A ishlab chiqaradi, bu past pH optimumiga ega, bu esa uni inson hazm qilish uchun yordam sifatida ishlatishga yaroqli qiladi.

3.49.3.3. Rekombinant texnologiyaning mikrobial proteaz ishlab chiqarishga ta'siri

Gram-musbat bakteriyalar orasida B. subtilis genomini tavsiflashga ustuvor ahamiyat berildi va uning to'liq ketma-ketligi Kunst va boshqalarda nashr etildi. 7 Bacillus turlarining asosiy sekretsiya yo'li bilan bog'liq bo'lgan genlarni identifikatsiyalash, besh turdagi I va II turdagi signal peptidazasini kodlash, bu turlarning hujayradan tashqari fermentlarni katta miqdorda ajratish qobiliyati uchun muhim deb qabul qilindi. B acillus halodurans 15 ning butun genomi ham ketma-ketlik bilan ajratilgan, bu shtammning hujayradan tashqari fermentlarni, shu jumladan yuqori gidroksidi faollik va barqarorlikka ega bo'lgan proteazalarni ishlab chiqarish qobiliyatini hisobga olgan holda ayniqsa muhimdir. B. subtilis bilan dastlabki rekombinant tadqiqot strategiyalari, ya'ni muhandislik plazmidlarini joriy qilish muammoli edi, chunki ko'p avlodlar davomida rekombinatsiya jarayonlari plazmidlar ketma-ketligini yo'q qilishga olib keldi, bu muammo muayyan rekombinant fermentlarga ega bo'lmagan mutant shtammlarni ishlab chiqish orqali biroz hal qilindi. B. subtilis genlarining yuqori darajadagi ekspressiyasining rivojlanishi bilan bog'liq bir nechta misollar keltirildi, bu mahalliy alfa-amilaza yuqori ferment ishlab chiqaruvchi promotordan foydalanishni o'z ichiga oladi. Rekombinant DNKni xromosomaga to'g'ridan-to'g'ri kiritishni o'z ichiga olgan strategiyalar orqali yanada barqaror klonlarga erishildi va gen nusxalari sonini kuchaytirish strategiyalari ham muvaffaqiyatli bo'ldi.
Molekulyar va genetik tadqiqotlar sanoatda muhim bo'lgan bir qator Aspergillus turlariga, jumladan A spergillus nidulans va tabiiy ravishda hosil bo'lgan ferment ishlab chiqarish xostlariga, A. niger va A. oryzaega qaratilgan. Ushbu organizmlarning genomlari ketma-ketlashtirilgan. Ushbu Aspergillus turlari bo'yicha molekulyar va genetik ma'lumotlarni taqdim etuvchi veb-saytlar Ward va boshqalarda umumlashtirilgan. 19 Bundan tashqari, oxirgi sharhda Aspergillus turlari tomonidan geterologik oqsillarni ishlab chiqarishning past darajasi sabablari, shu jumladan transkripsiya, translatsiya va posttranslatsiya darajalari joylaridagi cheklovlar va gen sintezi, proteaz etishmovchiligi bo'lgan mutantlar orqali geterologik gen ekspressiyasini yaxshilash strategiyalari muhokama qilinadi. va boshqa yondashuvlar.

AQSh FDA ma'qullagan birinchi rekombinant heterologik mahsulot Aspergillus turi tomonidan ishlab chiqarilgan pishloq ishlab chiqarishda foydalanish uchun buzoq ximozinidir. Prekursor, preproximozin birinchi bo'lib sintezlanadi, shundan so'ng sekretsiya jarayonida 16-aminokislota presekansi ajraladi. 42-aminokislotalik ketma-ketligi past pH da oqsilni keyingi qayta ishlash jarayonida keyinchalik olib tashlanadi. Ximozinning yaxshilangan hosildorligiga genlar sintezi, klassik mutatsiya/seleksiya va aspergillopepsin-minus mutantlaridan foydalanish kabi strategiyalar kombinatsiyasi yordamida erishildi. Boshqa tomondan, Kluyveromyces lactis - bu DSM tomonidan o'zlarining rekombinant ximozin mahsuloti Maxirenni ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan mikrobial xost.

Rao va boshq.12 mikrobial manbalardan, jumladan, bakteriyalardan (jumladan, Bacillus, Lactococcus, Streptomyces, Serratia, Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio turlari va E. coli), zamburug'lardan proteaz genlarini klonlash, sekvensiyalash va ifodalash bo'yicha keng jadvallarni taqdim etgan. (jumladan, Aspergillus, Fusarium, Rhizopus va Mucor turlari), xamirturushlar (jumladan, Saccharomyces, Candida va Kluyveromyces turlari), hayvonlar viruslari (jumladan, gerpesviruslar, adenoviruslar, retroviruslar va pikornaviruslar) va o'simlik mozaik viruslari.
Proteazlarning asosiy qo'llanilishi
3.49.4.1. Yuvish vositalari
Eng xarakterli subtilisinlar subtilisin Carlsberg (B. licheniformis, B otulinum pumilus va B. subtilis tomonidan ishlab chiqarilgan) va subtilisin BPN (B otulinum amyloliquefaciens, B. stearothermophilus va B. subtilis tomonidan ishlab chiqarilgan). Neytralofil Bacillus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan pH optimal qiymatlari pH 9–10 bo'lgan Subtilisin Carlsberg, yuvish vositalarida (masalan, Alcalase (Novozymes) va Nagarase (Nagase, www.nagase.com/technology)) foydalanish uchun tijoratlashtirilgan ishqoriy proteazlarning birinchi avlodini ifodalaydi. /enzymes.asp)).

Detarjan proteazlarining ikkinchi avlodi, B acillus clausii va B. halodurans kabi ishqoriy Bacillus turlarida ishlab chiqarilgan yuqori ishqorli proteazlar yuqori optimal pH qiymatlarini (pH 11–12) va yuqori termostabillikni (60 °C gacha) ko'rsatdi. kaltsiysiz) ham serin proteazlardir, garchi ba'zi noyob aminokislota qoldiqlari ishqoriy tsellyulozada ham kuzatilgan ishqoriy va termostabillikka hissa qo'shsa ham.3 Tijoriy yuqori ishqorli detarjen proteazalariga M-proteazalar misol bo'ladi (Kao Corporation: www. .kao.com/jp/en/corp_rd/development_02_01.html) va Savinaz (Novozymes). Masalan, tijoratlashtirilgan ikkinchi avlod detarjen proteazlarining Arg19, Glu271, Thr274 va Arg275 aminokislotalari M-proteaza vodorod bog'lanish tarmoqlarini barqarorlashtiruvchi naqsh hosil qiladi, ular ham C va N-terminallarni bog'laydi. Bu naqshlar ikkinchi avlod proteazlari orasida saqlanib qolgan ko'rinadi, ammo ular subtilizin Carlsberg tipidagi ishqoriy protealarda kuzatilmaydi.

Yuqoridagi birinchi va ikkinchi avlod proteazlari yovvoyi tur organizmlardan kelib chiqqan bo'lsa-da, proteazlarni turli kerakli katalitik va/yoki barqarorlik xususiyatlariga ko'ra sun'iy ravishda oshirish uchun genetik va oqsil muhandislik usullari qo'llanilgan. Subtilisin detarjan proteazlarining uchinchi avlodini ishlab chiqish uchun boshlang'ich ferment sifatida ishlatilgan, buning natijasida faol joyda serin qoldig'i yaqinidagi metionin qoldig'i, oqartiruvchi kabi detarjan qo'shimchalari bilan istalmagan oksidlangan, oksidlanmaydigan aminokislotalar qismi bilan almashtiriladi ( serin, alanin yoki leysin) oksidlovchiga chidamli proteazlarni hosil qilish uchun saytga yo'naltirilgan mutagenez orqali. Ushbu turdagi strategiya Purafect OxP (Genencor) va Durazyme (Novozymes) kabi oksidlovchiga chidamli uchinchi avlod proteazlarida qo'llanilgan. Boshqa bir misolda, past haroratlarda nisbatan yuqori faollik ko'rsatadigan bir qator detarjen proteazlari ishlab chiqilgan, ular 10-20 ° S haroratda sovuq suvda yuvishda samarali bo'ladi. Novozimning detarjen ishqoriy proteazasi Kannaza bunday fermentga misol bo'la oladi.

3.49.4.2. Oziq-ovqat fermentlari

3.49.4.2.1. Pivo tayyorlash va donni qayta ishlash proteazlari pivo tayyorlash va umumiy donni qayta ishlashning pyure bosqichida qo'llaniladi, bu erda filtrlanadigan ekstrakt hajmini oshirish va wortdagi alfa-amino azot miqdorini oshirish vazifasini bajaradi. Oddiy fermentatsiyada xamirturush o'sishi uchun alfa-amino azotning umumiy qabul qilingan miqdori 140-180 mg L-1 ni tashkil qiladi. To'liq solodli pyureda solod proteazlari odatda arpa, hordein va glutelinning asosiy oqsillaridan kerakli miqdorda aminokislotalar ishlab chiqaradi, ham malt jarayonida, ham pyure jarayonida. Maltning ulushi kamaytirilishi yoki yo'q qilinishi sababli, solod proteazasini sanoat proteazlari, ayniqsa Bacillus va Aspergillus turlaridan neytral proteazlar bilan almashtirish talab etiladi. Bacillus gidroksidi proteaz bu dastur uchun samarali emas. Bu fermentlar, shuningdek, don ekstrakti konsentratlarini ishlab chiqarish uchun ham ishlatilishi mumkin, bu erda aminokislotalar emas, balki filtrlash mumkin bo'lgan ekstrakt rentabelligi ustuvor hisoblanadi va bu holda, papain ham proteolizni rag'batlantirish uchun ishlatilishi mumkin. Shuni ham ta'kidlash kerakki, pyuresi paytida ushlab turiladigan harorat vaqti proteaza, amilazalar va glyukanazalarni o'z ichiga olgan pyure fermentlarining faollik talablarini qondirish uchun mo'ljallangan. Solod fermentlari bilan maydalashda eng past haroratni ushlab turish 50 °C atrofida bo'ladi, bu "proteolitik" stend deb ataladi, chunki solod proteazlari bu parametr atrofida optimal haroratga ega va harorat oshishi bilan tezda denatüratsiyalanadi. Ba'zi mikrobial proteazlar va papainlar 55-65 ° C haroratda yuqori harorat optimasiga ega bo'lib, kraxmal jelatinizatsiyasi va kraxmal va betaglyukanlarning gidrolizlanishi uchun eng maqbul bo'lgan yuqori haroratlarda pyure jarayonini amalga oshirishga imkon beradi.
Proteazlar sovuq tumanni olib tashlash uchun pivo tayyorlashda ikkinchi qo'llanilishiga ega. Pivoni oxirgi filtrlashdan so'ng, pivo past haroratlarda saqlanganida, tayyor pivoda qoldiq proteoglikanlarning past eruvchanligi tufayli tuman paydo bo'lish tendentsiyasi mavjud. Papain, ayniqsa, bu polimerlarni gidrolizlashda samarali bo'lib, shu bilan tumanni olib tashlaydi. Ushbu ilovalar Wardda ko'proq muhokama qilinadi
Pishloq tayyorlash Kislotali aspartik proteazlar sut oqsillarini koagulyatsiya qilish xususiyatiga ega bo'lganligi sababli pishloq ishlab chiqarishda sut ivish fermenti sifatida ishlatiladi. Hozirgi vaqtda sutni koagulyatsion fermentlarning uchta turi mavjud: hayvonlar shirdonlari, mikrobial shirdonlar va genetik jihatdan yaratilgan buzoq shirdonlari (ximozin), ikkinchisi yillar davomida sezilarli darajada ko'payishi natijasida dunyoda buzoq shirdonining etishmasligi tufayli ishlab chiqilmoqda. pishloq ishlab chiqarishda. Proteaza sifatida shirdonning o'ziga xosligi uning substratning o'ta yuqori o'ziga xosligidir, chunki u sutning k-kazein fraktsiyasidagi bir o'ziga xos peptid bog'ini (Phe105-Met106) gidrolizlaydi va para-k-kazein va makropeptid hosil qiladi. boshqa kazeinlarga hujum qilish. K-kazein sut mitsellalarini suspenziyada ushlab turish uchun xizmat qilganligi sababli, na para-k-kazein, na makropeptid bu funktsiyani bajarmaydi, bu bog'lanishning shirdon bilan ajralishi sut mitsellalarining beqarorligiga va pishloq koagulyatsiyasiga olib keladi. Pishloq tayyorlash jarayonining dastlabki bosqichlari odatda sutning (yoki qaymoqning) pH qiymatini taxminan pH 4,6 ga kamaytirish uchun sut kislotasi ishlab chiqaruvchi boshlang'ich madaniyatlardan foydalanishni o'z ichiga oladi, bu erda ustun kazein oqsillari izoelektrik pH ga yaqinlashadi va bu ularni ko'proq moslashtiradi. koagulyatsiya. Bu vaqtda koagulyatsiyaga ta'sir qilish uchun shirdon qo'shiladi. Shunday qilib, shirdonning o'ziga xos xususiyati uning sut ivishining umumiy proteolitik faollikka nisbati juda yuqori va mikrob shirdonlarini qidirishdagi qiyinchilik bu xarakterli faollik nisbatiga yaqinlashadigan fermentlarni topish edi. Nomzodlarning ko'pchiligi zaifroq tvorog ishlab chiqarishda yoki saqlashda vaqt o'tishi bilan pishloqni yumshatishda namoyon bo'lgan yuqori proteolitik faollikka ega edi. Ushbu izlanishlar natijasida tijoratlashtirilgan eng muhim mahalliy mikrobial pishloq ishlab chiqaruvchi ferment Rhizomucor miehei tomonidan ishlab chiqarilgan ferment edi. Rekombinant ximozin 1980-yillarning oxirida kiritilgan. Pishloq tayyorlashning qo'shimcha mahsuloti bo'lgan zardob oqsillarga boy bo'lib, ularning ba'zilari issiqlik denatüratsiyasi natijasida erimaydigan holga kelishi mumkin. Zardobning erimaydigan va eriydigan oqsillari tripsin va mikrobial proteazlar vositachiligida peptidlar va aminokislotalarga gidrolizlanishi mumkin, ular zardobning pH xususiyatlarini aks ettiruvchi pH optimalariga ega.
Pishirish proteazlari bug'doy tarkibidagi viskoelastik xususiyatlarga ega bo'lgan oqsil bo'lgan kleykovinani o'zgartirish uchun pishirishda ishlatiladi, pishirish jarayonida non xamiri ko'tarilganda kengayish qobiliyatiga ega. Xamirni tayyorlash jarayonini kleykovinani qisman gidrolizlash uchun proteazlarni qo'shish orqali tezlashtirish mumkin. Misol uchun, pechene tayyorlash uchun zaif kleykovina uni kerak, ammo uni olish qiyin. Bu muammoni osonlik bilan olinadigan yuqori kleykovina o'z ichiga olgan undagi kleykovinaning proteaza-katalizli degradatsiyasi orqali hal qilish mumkin. Odatda pishirishda kleykovina gidrolizi uchun issiqlikka chidamli qo'ziqorin proteazlari qo'llaniladi, shuning uchun ferment pishirishning dastlabki bosqichlarida harorat ko'tarilishi bilan denatüratsiyalanadi. Pishirishda proteazlarning ikkinchi qo'llanilishi lazzat va ozuqaviy rivojlanish bilan bog'liq bo'lgan o'zgarishlar bilan bog'liq. Bakterial neytral proteazlar bu maqsadda, masalan, pechene, pechene va kraker ishlab chiqarishda ishlatilishi mumkin.
3.49.4.2.4. Protein gidrolizatlarini ishlab chiqarish Protein gidrolizatlari oziq-ovqat va ozuqa qo'shimchalari sifatida keng qo'llaniladi, bu erda ular turli xil protein xususiyatlarini o'zgartiruvchi xususiyatlarga ega. Ko'p turdagi oqsillar, shu jumladan soya oqsili, jelatin, kazeinlar va zardob oqsillari proteazlar yordamida o'zgartirilishi mumkin. Baliq va go'sht gidrolizatlari proteazlar yordamida tayyorlanadi va proteazlar go'shtni yumshatish uchun ham ishlatilishi mumkin. Darhaqiqat, hayvonlarni so'yishdan keyin mushakdagi endogen proteazlar vositasida tabiiy go'shtning yumshoqligi sodir bo'lishi ma'lum. Proteazlar hayvonlarni qayta ishlash jarayonida suyaklardan oqsillarni olish uchun ishlatilishi mumkin, ular o'z navbatida konservalangan sho'rvalar, soslar va go'shtlarga, ayniqsa tuzlangan go'sht va kolbasalarga qo'shilishi mumkin. Mikrobial proteazalar, ayniqsa Bacillus ishqoriy serin proteazalari uzoq vaqtdan beri oqsil gidrolizatlarini tayyorlash uchun ishlatilgan. Biroq, bu dastur uchun neytral proteazlar, masalan, B. licheniformis ham ishlatiladi. Protein gidrolizi ko'proq kislotali sharoitda amalga oshirilganda, A. oryzae va Rhizopus niveus kabi zamburug'lardan proteazlar va tegishli shtammlar ko'proq qo'llaniladi. Protein gidrolizatlari ferment gidrolizidan so'ng, inson oziq-ovqat formulalarida, shu jumladan chaqaloqlar formulasida va hayvonlarning ozuqalarida ishlatilishi mumkin yoki proteaz protein o'z ichiga olgan oziq-ovqat yoki ozuqaga qo'shilishi mumkin, bu esa oziq-ovqatni keyingi qayta ishlash jarayonida proteolizni amalga oshirishga imkon beradi. yoki ovqat. Protein gidrolizatlari meva sharbatlari va boshqa ichimliklarni mustahkamlash uchun foydali funktsional xususiyatlarga ega. Protein gidrolizatlari qon bosimini tartibga soluvchi muhim xususiyatlarga ega ekanligi ma'lum va ular terapevtik parhez agentlari sifatida ishlatilishi mumkin.
Oziq-ovqat mahsulotlarini qayta ishlash va oqsil gidrolizatlarida proteazlarning ko'p qo'llanilishi lazzat ishlab chiqarish bilan bog'liq. Bacillus gidroksidi proteaz tomonidan soya oqsilining gidrolizi uchun gidrolitik sharoitlarni manipulyatsiya qilish kontrastli funktsional va lazzat xususiyatlarining rivojlanishiga olib kelishi mumkin. Proteaza vositasida oqsil gidrolizatlarini ishlab chiqarishda yaxshi tan olingan muammo - bu proteoliz natijasida hosil bo'lgan peptidlar tarkibida hidrofobik aminokislotalar va prolin mavjudligi bilan bog'liq bo'lgan xarakterli achchiq ta'mning rivojlanishi. Achchiqlanish ko'pincha ishlab chiqarilgan peptidlarning terminal hidrofobik aminokislotalariga bog'liq, ammo kichik va o'rta o'lchamdagi oligopeptidlardagi terminal bo'lmagan hidrofobik aminokislotalar ham achchiq ta'mga ega bo'lishi mumkin, kattaroq peptidlar esa achchiq bo'lmagan ko'rinadi. Ba'zi pishloq ishlab chiqarish jarayonlarida achchiq ta'mlar kuzatilgan va ular Pseudomonas R098 dan olingan proteaz bilan bog'liq. Demak, bu achchiq ta'mlarni kamaytirish uchun gidroliz jarayonini nazorat qilish muhim ahamiyatga ega.

3.49.4.3. Teri va matolarni qayta ishlashda proteazlar

Terini qayta ishlashning to'rtta asosiy bosqichi mavjud: ho'llash, sochlarini tozalash, cho'zish va ko'nchilik. Namlash, odatda, terini shishishi uchun qo'llaniladigan gidroksidi eritmalarni qo'shishni o'z ichiga oladi. Proteinli soch ildizlarini eritish uchun vodorod sulfidi bilan ishlov berish bosqichi bilan birgalikda yuqori gidroksidi konsentratsiyalarni qo'llash teridan soch va/yoki junni an'anaviy kimyoviy tozalashga yordam beradi. Boshqa sohalarda bo'lgani kabi, ushbu materiallar bilan ishlaydigan ishchilar uchun xavfsizlik xavfi tufayli qayta ishlashda qattiq kimyoviy moddalardan foydalanishdan keskin voz kechish kuzatilmoqda. Bundan tashqari, ushbu usullar oqava suvlarni tozalash va chiqindilarni yo'q qilish uchun katta xarajatlarni qo'shadi va to'kilish va ifloslanish xavfini oshiradi. Shuning uchun ekologik jihatdan qulayroq yondashuvlar maqsadga muvofiqdir va proteazlar bu joyni to'ldirishi mumkin. Terini qayta ishlashda proteazni qo'llash kimyoviy ishlov berish bilan bog'liq xavfsizlik, yuqori ishlov berish va yo'q qilish xarajatlarini kamaytiradi. Bundan tashqari, kollagen bo'lmagan oqsil tarkibiy qismlariga tanlab hujum qilish uchun proteazlarni qo'llash potentsiali terining sifatini kimyoviy tozalash orqali erishish mumkin bo'lganidan yuqoriroq qilish imkoniyatini beradi.
Proteazlar ipak ishlab chiqarish jarayonlariga qo'llanilishi mumkin. Ipak oqsili seritsin xom ipak tolalariga qo'pol to'qimalarni beradi va ipak tolasi oqsillaridan seritsinni olib tashlash uchun kraxmal qo'llash bilan bog'liq qimmat jarayonlar kichraytirish va burama sozlashda ishlatilgan. Asosiy bo'yash jarayonlarini amalga oshirishdan oldin ipakni degumming uchun proteazlardan foydalanadigan bir qator jarayonlar patent adabiyotida tasvirlangan.

3.49.4.4. Boshqa ilovalar

Proteazlar, shuningdek, oqsil bo'lmagan mahsulotlarni hayvon yoki o'simlik ekstraktlaridan tozalash jarayonlarida, shu jumladan uglevod saqichlari va mukopolisaxaridlarni olishda ko'proq maxsus ilovalarni topdi. Proteazlar keratinli materiallarni eritish uchun ishlatilishi mumkin, masalan, tuklar kabi chiqindilarni hayvonlar uchun ozuqa sifatida ishlatish uchun oqsil kontsentratlariga aylantirish. Streptomyces turlaridan ishqoriy proteaz ham kuchli keratinolitik faollikka ega. O'simlik proteazlari, papain va bromelain, B. subtilis neytral proteaz kabi go'shtni yumshatish fermenti sifatida samarali. Proteazlarning boshqa sanoat qo'llanilishi ulardan an'anaviy jelatin o'z ichiga olgan fotografik plyonkadan kumush olishda, shu jumladan rentgen plyonkasida, sanoat va maishiy organik chiqindilarni suyultirishda foydalanishni o'z ichiga oladi. Proteazlarni odamlar va hayvonlar ovqat hazm qilish uchun yordam sifatida ham iste'mol qilishlari mumkin.
Organik sintezdagi proteazlar
An'anaviy ravishda proteazalar peptid bog'larini gidrolizlash uchun qo'llanilgan bo'lsa-da, uzoq vaqt davomida proteazlar teskari reaktsiyani katalizlashi, ya'ni peptid bog'larining sintezini ta'minlashi mumkinligi uzoq vaqtdan beri ma'lum bo'lgan, bunda reaksiya aralashmasi yuqori konsentratsiyali aminokislotalar yoki peptidlarni o'z ichiga oladi. sintezga bo'lgan reaktsiyaning muvozanati. Yaqinda gidrolitik fermentlar reaktiv yoki mahsulot sifatida suv ishtirokidagi reaktsiyalarni katalizlash uchun qo'llanila boshlandi, buning natijasida reaksiya muhitidagi suv konsentratsiyasi qisman yoki to'liq boshqa erituvchi bilan almashtiriladi va shu bilan reaksiya muvozanatini sintez foydasiga o'zgartiradi. Suv molekulalari, shuningdek, biokataliz uchun oqsillarning kerakli konformatsion tuzilishini saqlashda ishtirok etishi mumkinligi sababli, ko'plab tadqiqotlar suvning ta'sirini va haqiqatan ham suv kontsentratsiyasining ferment faolligi va barqarorligiga ta'sirini va noan'anaviy organik muhitda ferment reaktsiyalarini amalga oshirish bilan bog'liq ta'sirini tushunishga qaratilgan. yoki ikki fazali suvli-organik tizimlar. Bundan tashqari, fermentlar organik erituvchilarda barqarorroq bo'lishi uchun aniqlangan yoki ishlab chiqilgan. Masalan, Rt4A2 Termus shtammidan olingan mikrobial proteaz organik erituvchilarda juda barqaror. Tanlangan polimerlar yordamida fermentni kovalent modifikatsiya qilish yoki fermentni tayanchlarga bog'lash uchun kovalent yoki nokovalent usullarni qo'llash orqali subtilisin organik erituvchilarda barqarorroq bo'ldi. Chen va Arnoldning tadqiqotlari (Kuchner va Arnold 5 tomonidan ko'rib chiqilgan) yo'naltirilgan evolyutsiya vositalari va tushunchalarini organik erituvchilar ishtirokida faol bo'lgan subtilizin proteazalarini ishlab chiqishda qo'lladi va shuning uchun proteazlardan foydalanish uchun peptidlar va tegishli bog'lanishlar sintezini katalizlaydi. Pseudomonas aeruginosa proteazasi PST-01 termolizinga yuqori darajadagi o'xshashlikni namoyon qiladi, shuningdek, uning erituvchi barqarorligiga sezilarli hissa qo'shadigan disulfid bog'ini (ikkitasidan biri) o'z ichiga oladi. Reaksiya muhitida suvni almashtirishning yana bir yondashuvi reaksiya erituvchisi sifatida superkritik suyuqliklardan foydalanishdir. Ushbu mavzular Patel tomonidan tahrirlangan ikkita ajoyib matnda batafsil muhokama qilinadi.10, 11 Quyida proteazlarning bioorganik sintezda qo'llanilishiga misollar keltirilgan:
1.
Proteazlarning peptid efirlarini N-himoyalangan aminokislotalarga ulash orqali di- va oligopeptidlarni sintez qilish qobiliyati Yaponiyaning Toya Soda kompaniyasi tomonidan B dan termolizin vositachiligida aspartam (l-phe-l-asp-metil ester) sintezi uchun ishlatilgan. termoproteolitiklar. Immobilizatsiyalangan termolizin l-aspartil-metil esterning aminokislotalarni blokirovka qiluvchi moddasi bo'lgan l-fenilalanin bilan reaksiyasi natijasida aspartam hosil bo'lishini katalizlaydi, shundan so'ng blokirovka qiluvchi vositani kimyoviy yo'l bilan olib tashlash mumkin.
2.
Turli peptidlarni sintez qilish uchun Flavobacterium meningoseptum dan prolil-endopeptidaza, C. thermohydrosulfuricum dan termostabil proteaza va Streptomyces griseus pronazasidan foydalanilgan.
3.
Subtilisin va klostripain kabi proteazlar glikokonjugat sintezida qo'llanilgan. Strategiyalar fermentning to'g'ridan-to'g'ri uglevodni asillanishida yoki glikopeptid va peptid o'rtasida peptid bog'lanishining shakllanishida ishtirok etishini o'z ichiga oladi.
4.
Proteazalarning peptid bog'lanishining parchalanishiga qo'shimcha ravishda boshqa turli reaktsiyalarda vositachilik qilish qobiliyati, ya'ni karboksilik kislotalarning esterlari va amidlari ishtirokidagi reaktsiyalar, ularni enantioselektiv bog'lanishning parchalanishi yoki shakllanishi orqali rasemik aralashmalardagi enantiomerlar juftligini ajratish uchun qiziqarli va samarali vosita qiladi. Bu maqsadda qo'llaniladigan fermentlarga misol sifatida subtilisin, A. oryzae proteaza va Thermoactinomyces vulgarisdan olingan serin ishqoriy proteaza kiradi. P. putida ATCC 12633 ning leysin aminopeptidazasi E. coli K-12 ga klonlangan va rezolyutsiya strategiyalaridan foydalangan holda bir nechta optik toza l- va d-aminokislotalarni ishlab chiqarish uchun tijoratlashtirilgan. Ley- va Met-enkefalinning preparativ sintezida subtilisin, termolizin, ximotripsin va papain qo'llanilgan.
5.
Subtilisin peratsillangan nukleozidlarning regioselektiv deatsilatsiyasida samarali bo'lgan. Subtilisin, shuningdek, rasemik aminlarning rezolyutsiyasida dialkil va diallil karbonatlarning asillanish reaktsiyalariga vositachilik qildi. Subtilisin rasemik amin aralashmalarini, masalan, depressiya va demansni davolashda, shuningdek, kalsimimetik og'iz preparatlarini sintez qilishda foydali bo'lgan rasagilin sintezining prekursorini tayyorlashda samarali hal qildi. Subtilisin-rutenium birikmalari ikkilamchi spirtlarning dinamik kinetik rezolyutsiyasida samarali bo'ldi.
6.
Inson insulini cho'chqa insulinidan B insulin zanjirining 30-sonli aminokislotasini alanindan treoninga proteaza almashinuvi orqali sintez qilish mumkin. B insulin zanjirining № 29 aminokislotasi lizindir va shuning uchun lizinga xos proteaza terminal alaninni kesib tashlaydi. So'ngra des-B30-insulin mahsuloti Achromobacter sp dan lizinga xos proteaz vositachiligida organik erituvchi muhitda treoninil-tert-butil ester bilan reaksiyaga kirishadi, shundan so'ng inson insulinini ishlab chiqarish uchun tert-butil esterni blokirovka qiluvchi vosita chiqariladi. .
Proteazlarning ozuqaviy va terapevtik qo'llanilishiga misollar
Proteazlarning kamida uchta qo'llanilishi sog'liqni saqlash sohasida, trombozda, saraton kasalligini davolashda va ovqat hazm qilish uchun yordam sifatida aniqlanishi mumkin:

1.
Gemolitik Streptococcus turlari tomonidan ishlab chiqarilgan hujayradan tashqari proteaza, streptokinaza qon quyqalarini tezda eritib yuborish qobiliyatiga ega bo'lib, arteriyalarning o'tkir blokirovkasini, chuqur tomir trombozini va o'pka emboliyasini davolash uchun ishlatiladi va koronar trombozni davolashda keng qo'llaniladigan terapiya hisoblanadi. miyokard infarkti bilan. Qo'llash mumkin bo'lmagan holatlar shundaki, u qonning boshqa oqsil omillarini (jumladan, V va VIII omillar va plazminni) parchalaydi, bu esa qon ketishiga olib kelishi mumkin. Muqobil yondashuv ishlab chiqilayotgan inson trombolitik fermenti, to'qima plazminogen faollashtiruvchisi (t-PA) ni Xitoy hamster tuxumdon hujayralari yordamida sintez qilish bilan bog'liq. Genentech korporatsiyasi (www.gene.com/gene/products/information/activase/) tomonidan ishlab chiqarilgan ushbu rekombinant mahsulot FDA tomonidan tasdiqlangan.

2.
Ba'zi proteazlar ma'lum o'simtaga salbiy ta'sir ko'rsatishi va shuning uchun terapevtik ahamiyatga ega bo'lishi mumkinligi kuzatildi. Serratia marcescens proteazlari bilan qattiq o'smalarni mikroin'ektsiya qilish natijasida o'sma nekrozi va eruvchanligi kuzatilgan. Pseudomonas sp dan karboksipeptidaza G1 dan foydalanish. foliy kislotasidan terminal glutamik kislotani ajratib olish foliy kislotasi etishmovchiligi holatini keltirib chiqarishi mumkin, bu esa ba'zi o'simta hujayralarining "ochligi" ga olib kelishi mumkin. Oxirgi ferment foliy kislotasi analogidan to'qimalarga xos antiproliferativ miya shishi agenti, metotreksat ishlab chiqarish uchun ham ishlatilishi mumkin.
3.
Botulinum toksini. Botulinum toksini (BOTOX, BoNT) C. botulinum tomonidan ishlab chiqarilgan neyrotoksin bo'lib, oziq-ovqat zaharlanishining qo'zg'atuvchisi hisoblanadi (www.allergan.com). Yillar davomida (1989-yilgacha) BoNT FDA tomonidan mushaklarning majburiy buzilishlarini turli xil terapevtik muolajalar va kosmetik maqsadlarda foydalanish uchun tasdiqlangan. BoNT og'ir va engil zanjirni o'z ichiga oladi va xolinergik nerv uchlarini nishonga olish va presinaptik motor nerv uchlariga yuqori yaqinlik bilan bog'lash qobiliyatiga ega. Yengil zanjir sinkga bog'liq bo'lgan metalloproteazdan iborat bo'lib, u motor nerv sonlaridan neyrotransmitterlarni chiqarishga vositachilik qiluvchi oqsillar guruhiga (SNARE) hujum qiladi. Shunday qilib, BoNT ning proteolitik ta'siri atsetilxolinning tarqalishini blokirovka qilishga olib keladi va xolinergik asab tugunlarida (spazmlar, haddan tashqari miltillash va migren) giperaktivlik natijasida yuzaga keladigan sharoitlarni davolashda va og'riqni sezish jarayonlarini blokirovka qilishda qo'llaniladi. Ajinlar paydo bo'lishining oldini olish uchun yaralarni davolashda va kosmetik in'ektsiya protseduralarida boshqa qo'llash misollari. Turli botulinum toksinlarining tuzilishi va ta'sir qilish usullari Dolli va Aoki tomonidan ko'rib chiqilgan.
4.
Proteazlar hayvonlarning ovqat hazm qilish suyuqliklarida mavjud bo'lib, zaharli ilonlarning murakkab hazm qilish suyuqliklarida gemorragik va sito-, miyo- va gemotoksik ta'sirlarni o'z ichiga olgan turli xil zaharli fiziologik ta'sirga ega bo'lgan proteazlar borligi ma'lum.
O'tish:
3.49.5. Proteaz inhibitörleri
Proteazlar fiziologik faoliyatda juda keng ishtirok etganligi sababli, giperproteolitik endogen faollik ba'zi hollarda anormal fiziologik faoliyat va kasallik holatlariga hissa qo'shishi mumkin. Bundan tashqari, odamlar va hayvonlarda proteazlar turli xil mikrobial va virusli patofiziologik sharoitlarda, jumladan orttirilgan immunitet tanqisligi sindromi (OITS), stafilokokk infektsiyalari, kandidoz va bezgak, shuningdek, ayrim saraton kasalliklarida muhim rol o'ynaydi. proteaz inhibitörlerini kasallik qo'zg'atuvchi proteazlarga qarshi terapevtik vositalar sifatida aniqlash va rivojlantirish. Ko'rinib turibdiki, aspartik-, sistein- va metalloproteazlar inson kasalliklarida ishtirok etadigan asosiy fermentlar bo'lib, bu fermentlarning mexanizmlarini modulyatsiya qiluvchi inhibitorlar maqsadli terapevtik nomzodlardir. Proteaz inhibitorlarining keng ro'yxati Science Gateway Link (http://www.sciencegateway.org/resources/protease.htm) da keltirilgan.
Ko'pgina mikrobial patologik kasalliklar teri, og'iz, o'pka, ko'z, quloq, burun, boshqa bo'shliqlar, ichak va yumshoq to'qimalarga ta'sir qiladigan organlarning u yoki bu tarzda infektsiyasi bilan bog'liq. Kollagen sut emizuvchilarning umumiy oqsilining taxminan 30% ni tashkil etishini hisobga olsak, kollagenga (kollagenazlarga) hujum qiluvchi proteazlar ko'plab patologik kasalliklar bilan bog'liq bo'lishi ajablanarli emas. Ko'pgina klinik organizmlarni o'z ichiga olgan mikrobial kollagenazalar ma'lum mitsetomalar, xo'ppozlar, oshqozon yarasi, septitsemiya, amfizem, gangrenoz ektima, homiladorlik asoratlari, periodontal kasalliklar, tish karieslari va nekrotik kasalliklarda ishtirok etgan. Shu sababli, kollagenazlarning ingibitorlari kasalliklarni davolashda katta imkoniyatlarga ega ekanligi aniq. Bu haqda Xarringtonda ko'proq muhokama qilinadi.4

Qon bilan oziqlanadigan umurtqasiz hayvonlarning proteazlari, masalan, tibbiy zuluk, Hirudo medicinalis, serin proteaz peptid inhibitörlerini ishlab chiqaradi, ular tripsinga o'xshash proteazalar bilan o'zaro ta'sir qiladi, ularning xostlarida qon ivishini bloklaydi.21

Proteazoma ingibitorlari apoptozning induksiyasiga qaramasdan o'smaga qarshi faollikka ega bo'lgan kimyoterapevtik vositalar sifatida ishlab chiqilgan.1 Bortezomib ko'p miyelomani davolashda samarali bo'lib, qon zardobida proteosomalarning ko'payishi kuzatiladi. Bortezomidning boshqa potentsial qo'llanilishi B hujayrali va oshqozon osti bezi saratonini davolashda. OIV proteaz inhibitori terapevtik ritonavir, shuningdek, proteosomalarning tripsinga o'xshash faolligini inhibe qiladi va glioma hujayralariga qarshi inhibitiv faollikka ega bo'lishi mumkin. Proteazoma inhibitörleri, shuningdek, otoimmün kasalliklar uchun potentsial terapevtik hisoblanadi.
Serin proteazaning trombolitik faolligi t-PA o'tkir insultni davolash uchun foydali bo'lsa-da, t-PA markaziy asab tizimining shikastlanishidan keyin neyronlarning shikastlanish darajasini ham aniqlashi mumkin. Serin proteazlar neyronlar va glial hujayralarda neyroprotektiv rol o'ynaydigan endogen serin oqsil inhibitörleri bilan birga mavjud.16 Shubhasiz, proteazlar va ularning inhibitorlari o'zaro ta'sirining to'g'ri muvozanatini modulyatsiya qilish miya shikastlanishini strategik davolashda va t. -PA terapevtik vosita sifatida.

Proteaz inhibitörleri viruslar yangi virionlarni yig'ish uchun, masalan, OIV yoki gepatit C viruslari bilan virusli infektsiyani davolash yoki oldini olish uchun yangi virionlarni yig'ish uchun ishlatadigan proteazlarga qarshi ishlab chiqilgan. OIV, saquinavir, ritonavir va lopinavirga qarshi ishlab chiqilgan proteaz inhibitörleri, masalan, bezgak va giardia infektsiyasiga qarshi ham antiprotozoal faollikni ko'rsatdi (http://en.wikipedia.org/wiki/Proteasome).

Neytral endopeptidaza (NEP) inhibitori, omapatrilat, gipertenziyani davolashda va konjestif yurak etishmovchiligini klinik davolashda angiotensinga aylantiruvchi fermentni o'z ichiga olgan metalloproteazlarni inhibe qiladi. Omapatrilat, shuningdek, yurak tomonidan chiqariladigan atriyal natriuretik peptidni buzadigan NEPni foydali tarzda inhibe qiladi.

Virusli kasalliklarni proteaz inhibitörleri bilan davolashga qarshilik rivojlanishi mumkin, ayniqsa inhibitor preparat suboptimal konsentratsiyalarda/doza stavkalarida qo'llanilganda. Bu jiddiy muammo sifatida qabul qilinadi, masalan, OIV proteazasining kamida 10% aminokislotalari mutatsiyalar natijasida o'rnini bosishi mumkin bo'lgan OIV infektsiyasini davolashda hali ham tirik virusni saqlab qolish mumkin8 (http://www.aids.org) .

Proteaz inhibitorlarini tasniflash bo'yicha eng ko'p keltirilgan maqolalarga havolalar BioinfoBank kutubxonasida (http://lib.bioinfo.pI/meid:190879) umumlashtirilgan.
Biografiya
•
Ouen Uord Irlandiya Milliy Universitetida biokimyo boʻyicha bakalavr darajasiga va sanoat mikrobiologiyasi boʻyicha PhD darajasiga ega. Biocon-da fermentatsiya-rivojlanish menejeri sifatida u kompaniyaning birinchi mikrobial ferment ishlab chiqarish jarayonlarini ishlab chiqdi. U asoschi professori va Dublin Siti universiteti biotexnologiya maktabi rahbari (1980–87). 1987 yildan beri u Kanadadagi Vaterlo universitetining Biologiya kafedrasi professori boʻlib, u yerda mikrobial biotexnologiya boʻyicha NSERC sanoat tadqiqotlari kafedrasini boshqargan (1987–97), Vaterloo fan va biznes dasturlari direktori (2004–08). ) va “E’tiborli o‘qituvchi” mukofoti sovrindori. U Kanada Mikrobiologlar Jamiyatining sobiq prezidenti va Sanoat Mikrobiologiyasi Jamiyatining direktori. U Waterloo universitetining uchta spin-off kompaniyasi, Biorem Technologies, Petrozyme Technologies va Lystek International asoschisi.