Scientific progress volume ǀ issue ǀ

Materiallar va usullar. 
Bakteriya shtamplari: XL1-Blue Escherichia coli kompetent hujayralar, TOP10 
bir martalik kompetent hujayralar. 

---

SCIENTIFIC PROGRESS
VOLUME 2 ǀ ISSUE 5 ǀ 2021 
ISSN: 2181-1601
Uzbekistan
 
www.scientificprogress.uz
 
Page 405
Fermentlar va PCR to'plamlari: XbaI (NEB), Hind III (NEB, R3535s), 10x 
CutSmart buffer (NEB, R3535s), XhoI (NEB), EcoRI, Dream Taq Hot Start Green PCR 
Master Mix, T4 DNK ligazasi, 10xT4 DNA ligase buffer containing10 mM ATP (NEB, 
M0202s), T4 DNA ligase (NEB,M0202s), Monarch DNA Gel Extraction Kit (NEB 
T1020L). 
LB suyuq ozuqa muhiti: 5 g/L achitqi ekstrakti, 10 g/L tripton, 5 g/L NaCl, (pH 
7.0). 20 daqiqa avtoklavda sterillanadi. Ishlatishdan oldin tegishli antibiotik qo'shiladi. 
LB agar qattiq ozuqa muhiti: agar-agarni o'z ichiga olgan LB suyuq ozuqa muhiti. 20 
daqiqa avtoklavda sterillanadi. Zarur bo'lganda, petri plastinkalariga quyishdan oldin 
ozuqa muhitga tegishli antibiotik qo'shiladi. Antibiotiklar: ampetsilin va spektinomitsin. 
Boshqa zarur laboratoriya asbob-uskunalari: PZR termosikler, suv hammomi, 
inkubator, nanofotometr, sentrifuga, elektroforez uskunalari, 0,2 ml PCR probirkalari, 
1,5 ml va 2- ml probirkalar. 
Dastlab, o’simlikka transformatsiya qilish va E-1 genini tahrirlash uchun maqsad 
qilingan vektor konstruksiyaning dizayni in-slico shaklida SnapGene 5.2.5.1 dasturi 
yordamida tuzildi. 
Soyaning qurg’oqchilikka aloqador E-1 genini CRISPR/Cas9 vektor tizimi 
yordamida ko'p tomonlama tahrir qilishda Ma tomonidan taqdim qilinga usuldan 
foydalanildi [27]. Chopchop veb dasturi (
http://chopchop.cbu.uib.no/
) tanlab olingan 
genning ekzon qismi uchun ixtiyoriy sgRNA ketma-ketliklarini va mos ravishda PAMni 
ajratib ko’rsatish imkoniyatiga ega. Yuqoridagi qulayliklarni hisobga olgan holda ushbu 
veb dastur vositasida soyaning E-1 genining 3 ta ekzon qismi uchun maqsadga muvofiq 
sgRNA ketma-ketliklari tanlab olindi. Tanlangan sgRNAlardan Integrated DNA 
Technologies (
https://www.idtdna.com
) tomonidan taqdim qilingan protokol asosida 
dupleks hosil qilindi [28].
Har bir sgRNA ekspressiyalanuvchi kassetasi quyidagi 10 mL hajmdagi 
restriksiya-ligaza reaksiyasi aralashmasida alohida hosil qilindi: 1 mkl oraliq vektor (15 
ng/mkL), 1 mL 10x CutSmart bufferi (NEB), 0,5 mkl 10x T4 DNK ligaza buferi (NEB, 
tarkibida ATP saqlovchi), 5 mkl BsaI-HF (NEB), 20 mkl T4 DNK ligazasi (NEB), 0,5 
mkl dupleks (2-qadam) va reaksiya aralashmasi suv bilan 10 mklga steril yetkazildi. 
Restriksiya-ligaza reaksiyasi termosiklerda 37℃ haroratda 30 daqiqa olib borildi. 
Barcha oraliq vektorlar assembl hosil qiluvchi vektorga Golden Gate reaksiyasi 
orqali kiritildi.