Sekvenslashning senger usuli. Maksam-gilbert usuli asosida sekvinerlash

SEKVENSLASHNING SENGER USULI. MAKSAM-GILBERT USULI ASOSIDA SEKVINERLASH
DNKning ketma-ketligi (deoksiribonuklein kislota) - bu molekulyar biologiya laboratoriyalarida olib boriladigan protsedura bo'lib, u qiziqadigan genetik materialdagi nukleotidlarning tartibini bilishga imkon beradi. Bundan tashqari, RNK (ribonuklein kislota) sekvensiyasi haqida ham ma'lumot berilishi mumkin.
Ushbu uslub biologiya fanlarini rivojlanishi uchun ajralmas bo'ldi. Shuningdek, u boshqa bilim sohalarida - masalan, tibbiy diagnostika va sud-tergov tekshiruvlarida qo'llaniladi.
Ilgari DNK zanjirining sekvensiyasi sekin va qimmat faollik deb hisoblanar edi, bu esa oligonukleotidlarda atigi bir nechta tayanch juftligini aniqlashga imkon beradi.
Bugungi kunda, ilm-fanning barcha yutuqlari bilan, DNKning ketma-ketligi bu sohadagi deyarli 50 yillik izlanishlar hissasi tufayli dunyodagi ko'plab laboratoriyalarda odatiy operatsiya hisoblanadi. Zanjir uzunligi bo'yicha juda qisqa vaqt ichida millionlab taglik juftlarini ketma-ketlashtirish mumkin.

Buning uchun narx va aniqlikda farq qiladigan o'nlab texnikalar ishlab chiqilgan. Ushbu maqolada biz klassik va zamonaviy texnikalarni, ularning har biri o'zining afzalliklari va kamchiliklari bilan tavsiflaymiz.

Hozirga qadar sekvensiya texnikasi kichik prokaryotlardan va xamirturushlardan odam genomigacha to'liq genomlar ketma-ketligini olishga imkon beradi.
DNK tuzilishi
DNKni sekvensiyalashda qo'llaniladigan usul va usullarni tushunish uchun molekula tuzilishi va tarkibining ba'zi asosiy jihatlarini bilish kerak.
DNK - bakteriyalardan tortib yirik suv hayvonlariga qadar barcha tirik mavjudotlarda mavjud bo'lgan biomolekula. Organellalar - mitoxondriya va xloroplastlar singari - ularning ichida aylana shaklidagi DNK molekulasi mavjud. Hatto ba'zi viruslarda ham topilgan genetik material DNKdir.
Strukturaviy ravishda DNK nukleotidlar to'plamidir. Ularning har biri uglevod, azotli asos (A, T, C yoki G) va fosfat guruhidan iborat. DNK sekvensiyasining maqsadi ketma-ketlikda to'rtta azotli asoslarni topish tartibini ochib berishdir.

Tarix
1950-yillarning o'rtalarida tadqiqotchilar Uotson va Krik DNKning tuzilishini xristolografik usullar yordamida tasvirlab berishdi. Biroq, ushbu tadqiqotchilarning hech biri ketma-ketlikni ochish yo'lini topa olmagan.

Garchi ma'lum o'tmishdoshlar bo'lgan bo'lsa-da, eng muhim voqea 1977 yilda Sanger uslubining yaratilishi edi. Ushbu usulning otasi Frederik Sanger ingliz biokimyosi, biologik fanlarga qo'shgan ulkan hissasi uchun ikki Nobel mukofoti sovrindori edi.
Ushbu uslub adabiyotda "zanjirning tugashi" yoki dideoksinukleotidlar sifatida ham tanilgan. Ushbu texnikaning printsiplari va uni takomillashtirish va yangilash asosida ishlab chiqilgan qoidalar quyida tavsiflanadi.
Sanger usuli
Sanger uslubining rivojlanishi molekulyar biologiyada hal qiluvchi voqea bo'ldi. Odatda DNKning replikatsiya jarayonining hujayradagi sodir bo'ladigan asosiy tarkibiy qismlarini o'z ichiga oladi, lekin unga maxsus komponent qo'shiladi: dideoksinukleotidlar.
Reaktsiyaning asosiy tarkibiy qismlari
- DNK polimeraza: DNK polimeraza fermenti jarayonning hal qiluvchi elementidir. Ushbu molekula DNK zanjirining replikatsiyasida qatnashadi va uning roli trifosfat deoksiribonukleotidlarni komplementar bilan juftlashtirib yangi zanjirning sintezidir.
Eslatib o'tamiz, DNKda timinlar (T) adenin (A) bilan ikkita vodorod bog'lanishlari orqali juftlashadi, sitozin (C) esa buni uchta ko'prik bilan guanin (G) bilan bog'laydi.
- Nukleotidlar: Sanger ketma-ketligi nukleotidlarning ikkita turini o'z ichiga oladi, to'rtta 2'-deoksinukleotidlar (qisqartirilgan dATP, dGTP, dCTP va dTTP) va to'rtta maxsus dideoksinukleotidlar (ddATP, ddGTP, ddCTP va ddTTP).
Dideoksinukleotidlar odatda DNK tarkibiga kiradigan monomerlarga o'xshash bo'lsa ham, ularning tarkibida -OH guruhi yo'q. Bu zanjirga yangi nukleotid qo'shib bo'lmaydi.
Shuning uchun hosil bo'lgan zanjirga maxsus nukleotid - umuman tasodifiy usulda qo'shilsa, sintez falajlanadi. Shunday qilib, reaktsiya oxirida har xil o'lchamdagi zanjirlar mavjud, ularning har biri reaktsiya boshqa nuqtada to'xtatilgan.
Eksperimental ravishda to'rtta test tayyorlanadi. Ularning har birida qiziqishning biologik namunasidan ajratilgan DNK, oddiy nukleotidlar va to'rtta maxsus nukleotid turlaridan biri mavjud. Yoki maxsus nukleotidlar qandaydir lyuminestsent marker bilan belgilanadi (quyida avtomatlashtirilgan ketma-ketlikni ko'ring).
Natijalarni o'qish
Birinchi qadam - sintez qilingan zanjirlarning har birini o'lchamiga qarab ajratish. Maxsus bazalar kiritilgan joyga qarab, ba'zilari boshqalarnikiga qaraganda uzoqroq bo'ladi.
Diskriminatsion xususiyat sifatida o'lchamdan foydalangan holda aralashmaning tarkibiy qismlarini ajratishga imkon beradigan turli xil biokimyoviy texnikalar mavjud. Sanger uslubida har xil zanjirlar elektroforez bilan ajralib turadi. Texnikaning yanada murakkab variantlarida kapillyar elektroforez qo'llaniladi.
Shunday qilib, uzunroq iplar qisqa variantlardan kamroq harakat qiladi. Keyinchalik ushbu tizim har bir dideoksinukleotidga kiritilgan markerni taniydigan o'quvchi orqali o'tadi. Shu tarzda ketma-ketlik tartibi ma'lum bo'lishi mumkin.
Ushbu "birinchi avlod" texnikasi 1 kilobazadan katta bo'lmagan DNK fragmentlarini o'qishga qodir. Hozirgi kunda Sanger usuli turli xil laboratoriyalarda, umuman zamonaviy variantlarida qo'llanilmoqda. Bundan tashqari, u olingan natijalarni eng murakkab texnikalar bilan tasdiqlash uchun ishlatiladi - ammo unchalik aniq emas.
Avtomatik ketma-ketlik
Keng miqyosda ketma-ketlikni talab qilishda jarayon avtomatlashtirish orqali tezlashadi. Bu Sanger zanjirini tugatish usulining o'zgarishi, bu erda primerlarni ajratish uchun lyuminestsent mahsulotlar bilan etiketlanadi.
Keyinchalik, reaktsiya mahsuloti elektroforezda ishlaydi - barchasi bir qatorda. Har bir bo'lak jelning oxirgi qismidan chiqqanda, uning floresan yorlig'i bilan tezda aniqlanadi, bu xato taxminan 1% ni tashkil qiladi.
Eng murakkab tizimlarda robot bilan biriktirilgan kompyuter tomonidan boshqariladigan 96 tagacha kapillyar naycha tizimi mavjud. Ya'ni 96 DNK namunalarini bir vaqtning o'zida sinab ko'rish mumkin. Shunday qilib, elektroforez va natijalarni tahlil qilishni o'z ichiga olgan jarayon to'liq avtomatlashtirilgan.
Bir kun ichida ushbu tizimlar 550000 tagacha bazalarni ketma-ketligini ta'minlashi mumkin. Jarayon davomida inson mehnati keraksiz, usulni boshlash uchun atigi 15 daqiqa vaqt ketadi.
Maksam-Gilbert ketma-ketligi
Sanger o'z asarini nashr etgan bir vaqtning o'zida Allan Maksan va Valter Gilbert ismli ikkita tadqiqotchi DNK ketma-ketligini olishning yana bir usulini ishlab chiqishga muvaffaq bo'lishdi. Ushbu usul o'sha paytda mashhurlikka erishdi, ammo keyinchalik Sanger uslubining takomillashtirilishi tufayli joyidan chiqarildi.
Sanger usulidan farqli o'laroq, Maksan va Gilbert sekvensiyasi (yoki ma'lumki, kimyoviy sekvensiya) gibridlanish reaktsiyalarini o'z ichiga olmaydi. Metodika bir uchida reaktiv moddalar bilan etiketlashdan, so'ngra tozalash jarayonidan iborat.
Ushbu texnikaning salbiy jihatlaridan biri uning juda murakkabligi va foydalanuvchi uchun xavfli bo'lgan kimyoviy moddalardan foydalanishida. Kimyoviy tanaffuslar DMS, formik kislota, gidrazin va gidrazinni tuzlar bilan qo'llash orqali kelib chiqadi.
Jarayon
Protokol ipning 5 'uchidagi fosfor markeri 32 bilan belgilanishi bilan boshlanadi, so'ngra azot asosining kimyoviy modifikatsiyasi sodir bo'ladi va u ajralib chiqadi. Nihoyat, abasik mintaqaning parchalanishi sodir bo'ladi.
Avval siz ketma-ketlikni xohlagan zanjirni kichikroq segmentlarga qisqartirasiz. Ushbu qadam cheklash fermentlari bilan amalga oshiriladi, natijada uchlari chiqib turadi.
Keyinchalik, reaksiya gidroksidi fosfataza bilan amalga oshiriladi, uning maqsadi fosfat guruhini yo'q qilishdir. Shunday qilib, markalashni amalga oshirish uchun polinukleotid kinazdan foydalanish mumkin.
Zanjir denatüre qilingan (ikkita ip ochiq). Keyin kimyoviy moddalar qo'llaniladi. Ushbu bo'linish reaktsiyalari boshqariladigan usulda amalga oshiriladi va har bir qo'llaniladigan kimyoviy tanaffuslar qanday turdagi bog'lanish turlari ma'lum.