Yazışma Adresi / Address for Correspondence

Yöntemler

Ocak 2015-Temmuz 2018 arasında laboratuvarımıza gön-

derilen 12 239 dışkı örneği, laboratuvara ulaşır ulaşmaz, önce 

serum fizyolojik ve 1:5 oranında sulandırılmış Lugol'ün iyod 

solüsyonuyla lam-lamel arası preparat hazırlanarak barsak 

protozoonları açısından 40 × objektifle mikroskopta incelen-

miştir. Tüm örnekler, barsak helmintlerinin yumurtaları açı-

sından da, fekal konsantrasyon tüpü kullanılarak çöktürme 

yöntemiyle hazırlandıktan sonra, mikroskopta 10× objektifle 

değerlendirilmiştir. Laboratuvarımızda incelenen örnekler 

için tüm mikroskopik sahalarda tek bir parazit elemanı gö-

rülmesi, Blastocystis spp. de dahil olmak üzere tüm barsak 

parazitleri için tanı kriteri olarak kabul edilmiştir. 

Direkt ve konsantrasyon yöntemiyle mikroskopik ince-

leme sonucunda morfolojik olarak parazite benzer yapılar 

görülen dışkı örneklerine, Cryptosporidium spp., Cyclospora 

cayatenensis  ve Isospora belli açısından modifiye aside di-

rençli boyama, diğer protozoonlar açısından ise trikrom bo-

yama uygulandıktan sonra 100× objektifle mikroskopta ince-

lenmiştir. Bu örnekler ayrıca Cryptosporidium/Giardia direkt 

floresan antikor (DFA) (Crypto/Giardia Cel, Cellabs, Brookva-

le, NSW, Avustralya) ve/veya E. histolytica adezin antijenini 

belirlemek için ELISA (E. histolytica II™, TechLab, Blacksburg, 

VA, ABD) yöntemleriyle değerlendirilmiştir. DFA yöntemiyle 

floresan mikroskopta Cryptosporidium  spp. ookistleri ve G. 

intestinalis kistlerinin görülmesi tanı kriteridir. ELISA yönte-

minde pozitif kontrol örneğinin absorbans değerinin 0.150 ve 

daha üzeri olması, negatif kontrol örneğinin absorbans de-

ğerinin ise 0.150’nin altında olması durumunda test geçerli 

kabul edilmiş; hasta örneklerinden absorbans değeri 0.150 ve 

üzeri olanlar pozitif olarak değerlendirilmiştir. 

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uygulanacak dışkı ör-

nekleri, inceleme yapılıncaya kadar herhangi bir koruyucu 

içermeyen Ependorf tüpleri içerisinde -20°C’de saklanmış-

tır. DNA ekstraksiyonu QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, 

Hilden, Almanya) kullanılarak üretici firmanın önerisi doğ-

rultusunda yapılmıştır. Elde edilen DNA örneklerine (10 µl) 

Multiplexed Diagnostics Gastrointestinal Parasites (5Plex) 

(AusDiagnostics, Mascot, NSW, Avustralya) kiti kullanılarak 

RotorGene

®

 Q (Qiagen, Hilden, Almanya) cihazında üretici 

firmanın önerileri doğrultusunda multipleks “real-time” PCR 

yöntemi uygulanmıştır. Bu kitle E. histolytica, G. intestinalis, 

Cryptosporidium spp. ve Dientamoeba fragilis DNA’sı sapta-

nabilmektedir. Amplifikasyon koşulları 95°C’de 10 dakika baş-

langıç denatürasyonunun ardından 95°C-10 saniye, 60°C-15 

saniye, 72°C-15 saniye olacak şekilde 30 döngü reaksiyon ve 

75-95°C’de erime eğrisi analizi şeklinde gerçekleştirilmiştir. 

Her testte, kit içerisinde mevcut olan pozitif kontrol örnekleri-

nin pozitif, negatif kontrol örneklerinin negatif sonuç vermesi 

halinde test geçerli kabul edilmektedir. Reaksiyon sonunda 

pozitif örneklerin uygun amplifikasyon eğrisi vermesi sonu-

cunda pozitif, negatif örneklerin amplifikasyon eğrisi verme-

mesi sonucunda ise negatif olarak değerlendirme yapılmak-

tadır.