Thermodynamic, kinetic and structural basis for recognition and repair of abasic sites in

---

Thermodynamic, kinetic and structural basis for
recognition and repair of abasic sites in
DNA by apurinic/apyrimidinic endonuclease
from human placenta
Natalia G. Beloglazova
1
, Oleg O. Kirpota
1
, Konstantin V. Starostin
1,2
, Alexander A.
Ishchenko
1
, Vitaly I. Yamkovoy
2
, Dmitry O. Zharkov
1,2
, Kenneth T. Douglas
3
and
Georgy A. Nevinsky
1,
*
1
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, 8 Lavrentieva Avenue, Novosibirsk 630090, Russia,
2
Novosibirsk State University, 2 Pirogova Street, Novosibirsk 630090, Russia and
3
School of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, University of Manchester, Manchester M13 9PL, UK
Received June 26, 2004; Revised August 25, 2004; Accepted September 7, 2004
ABSTRACT
X-ray analysis of enzyme–DNA interactions is very
informative in revealing molecular contacts, but
provides neither
quantitative estimates
of the
relative importance of these contacts nor informa-
tion on the relative contributions of specific and
nonspecific interactions to the total affinity of
enzymes for specific DNA. A stepwise increase in
the ligand complexity approach is used to estimate
the relative contributions of virtually every nucleo-
tide unit of synthetic DNA containing abasic sites
to its affinity for apurinic/apyrimidinic endonu-
clease (APE1) from human placenta. It was found
that APE1 interacts with 9–10 nt units or base pairs
of single-stranded and double-stranded ribooligo-
nucleotides
and
deoxyribooligonucleotides
of
different lengths and sequences, mainly through
weak additive contacts with internucleotide phos-
phate groups. Such nonspecific interactions of
APE1 with nearly every nucleotide within
its
DNA-binding cleft provides up to seven orders of
magnitude (DG


 8.7 to 9.0 kcal/mol) of the
enzyme affinity for any DNA substrate. In contrast,
interactions with the abasic site together with other
specific APE1–DNA interactions provide only one
order of magnitude (DG


 1.1 to 1.5 kcal/mol)
of the total affinity of APE1 for specific DNA. We
conclude that the enzyme’s specificity for abasic
sites in DNA is mostly due to a great increase
(six to seven orders of magnitude) in the reaction
rate with specific DNA, with formation of the
Michaelis complex contributing to the substrate
preference only marginally.
INTRODUCTION
Apurinic/apyrimidinic (AP) or abasic sites are formed in DNA
by spontaneous base loss and as a result of treatment with
certain chemical (acids, alkylating agents, etc.) or physical
mutagens (UV or ionizing radiation) (1). Excision of damaged
DNA bases by DNA glycosylases also creates AP site repair
intermediates (1). The steady-state level of AP sites in living
cells is estimated at 5–20 lesions per 10
6
bases and the rate
of their formation at 10–30 lesions per 10
6
bases per hour
(2). Thus, most AP sites are removed from DNA soon after
formation.
Normally, AP sites are processed by AP endonucleases (1),
which recognize AP sites and cleave the DNA phosphodiester
backbone 5
0
to the lesion to create a free 3
0
-OH terminus
suitable for priming DNA polymerases (1). The major
human AP endonuclease, APE1, is homologous to the
major
Escherichia coli AP endonuclease Xth, both sharing
a common structural fold with DNase I (3–5). Both APE1
and Xth are constitutively expressed (1). In other eukaryotes
the primary constitutive AP endonuclease (e.g. budding
yeast’s Apn1p) belongs to a family of which the second,
inducible
E.coli AP endonuclease Nfo is a prototypic member
(1,3–5). AP endonucleases of the APE1/Xth family are small
(30–40 kDa), monomeric, divalent metal cation-dependent
enzymes (1,3).
In the past decade, significant progress has been made in the
detailed analysis of specific protein–DNA interactions by X-
ray crystallography, one of the most informative methods for
analysis of biomolecules [for recent reviews, see (6–13) and
references therein]. Crystal structures of uncomplexed APE1
and wild-type and mutant APE1 bound to AP site-containing
DNA in the presence of different divalent cations offer many
details of possible mechanisms of AP site recognition and
DNA hydrolysis by this enzyme (14–16). Other AP endo-
nucleases have also been subject to crystallographic study
(17,18).
However,
a
static
structure
provides
neither
*To whom correspondence should be addressed. Tel:
[phone]; Fax: [phone]; Email: [e-mail]
Correspondence may also be addressed to Kenneth T. Douglas. Tel:
[phone]; Fax: [phone]; Email: [e-mail]
Nucleic Acids Research, Vol. 32 No. 17
ª Oxford University Press 2004; all rights reserved
5134–5146
Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 17
doi:10.1093/nar/gkh846