7-Amaliy mashg’ulot. Biomateriallar tarkibidagi oqsillarni sifatiy va miqdoriy aniqlash

7-Amaliy mashg’ulot. Biomateriallar tarkibidagi oqsillarni sifatiy va miqdoriy aniqlash.

Oqsil molekulalarining shakli ultratsentrifugalash, rentgenstruktur analiz asosida yoki elektron mikrosko‘pda aniqlanadi. Tahlillar shuni ko‘rsatdiki, oqsil molekulalari har uch o‘lchami bo‘yicha assimetrik moddalardir. Tabiiy oqsillar molekulasining shakliga qarab 2 guruhga bo‘linadi: globulyar va fibrillyar. Fibrillyar oqsillarning molekulasi ipsimon bo‘lib, uzunligi diametriga nisbatan 100 marta ko‘proqdir. Globulyar oqsil molekulasi sferik shaklga ega bo‘lib, uning uzunligi diametriga qaraganda 3-10 marta ortiqdir. Masalan: elastin oqsil molekulasining diametri 70 nm bo‘lib oval shaklda, gemoglobin oqsilini diametri 220 nm bo‘lib ozgina cho‘zinchoq shaklda, miozin molekulasining diametri 100 nm bo‘lib, uzunligi ming angstremga teng. Shunday qilib, miozin oqsili tolasimon bo‘ladi. Fibrillyar va globulyar oqsillarining xossasi xar xil bo‘ladi. Ayrimlari suvda va tuz eritmalarida eriydi. Ko‘pchilik fibrillyar oqsillar suvda erimaydi. Fibrillyar oqsillarga – miozin, ipak, fibrinogen, kollagen va elastinlar kiradi. Oqsillarning fizik va kimyoviy xossalari Oqsillar optik faol moddalar bo‘lgani uchun, ular qutblangan nur sathini ma’lum burchak hosil qilib buradi. Oqsil eritmalari yorug‘lik nurini sindirish, tarqatish, ultrabinafsha nurlarini yutish qobiliyatiga ega. Oqsillarning bu fizik xossasidan foydalanib ularning miqdorini, molekulyar massasini va boshqa ko‘rsatkichlarini aniqlash mumkin. Oqsillarning molekulyar massasi yuqori bo‘lganligi uchun eritilganda kolloid eritmalar hosil qiladi. Oqsillar suvda eriganda suvning qutbli molekulalarining oqsil zaryadiga qarama-qarshi joylashib suv qobiq‘i hosil qiladi. Oqsilning suvdagi zarrachalari diametri 0,001 mkm dan yuqori bo‘lgani uchun kolloid eritma hosil bo‘ladi va yorug‘lik sochish (Tindal effekti) xususiyatiga ega bo‘ladi. Oqsillar molekulasi hayvon va inson membranasining mayda teshiklari orqali o‘ta olmaydi. Oqsillarning bu xossasidan foydalanib yarim o‘tkazgich membranalar yordamida ularni kichik molekulali moddalardan tozalash mumkin. Bu usul dializ deyiladi. 17 Gidrofil kolloidlarning eng muhim xususiyatlaridan biri gel hosil qilishdir. Kolloid zarrachalari o‘zaro yopishib to‘rsimon g‘ovak struktura hosil qiladi. Hosil bo‘lgan struktura bo‘shliqlariga suv molekulalari yig‘ilib oqsilni turli darajada bo‘ktirishi mumkin. Oqsillarning molekulasida -NH2 va COOH- guruhlari borligi uchun amfoterlik xossasini namoyon qiladi. Oqsil molekulasida erkin karboksil guruhi kislotali, aminogruppa esa asosli xossasini namoyon qiladi. Uni quyidagicha ifodalash mumkin: COO - R NH3 + Oqsil molekulasining zaryadi tarkibidagi zaryadlangan aminokislotalarga bog‘liq. Monoaminomonokarbon aminokislotalar oqsil molekulasiga neytral zaryad belgilaydi. Aksincha, monoaminodikarbon aminokislotalar oqsil molekulasini manfiy zaryadlaydi. Diaminomonokarbon aminokislotalar oqsil molekulasini musbat zaryadlaydi. Oqsil molekulasining zaryadi zaryadlangan guruhlarining yig‘indisi bilan belgilanadi. Bir vaqtda erkin manfiy va musbat zaryad saqlagan oqsillar amfoter xususiyatga ega. Erkin karboksil guruhning dissotsiatsiyalanish darajasi aminogruppaga nisbatan ozgina yuqori bo‘lganligi uchun bu funksional guruhlarning miqdori teng bo‘lganda oqsil molekulasining zaryadi manfiy bo‘lishi mumkin. Eritmadagi vodorod ionlari konsentratsiyasini, ya’ni muhitning pH ko‘rsatkichini o‘zgartirish orqali oqsil molekulasidagi amino- va karboksil guruhlarning dissotsiatsiyalanishini kuchaytirish yoki pasaytirish mumkin. Eritma pH ko‘rsatkichini o‘zgartirish yo‘li bilan oqsil molekulasining zaryadini nolga keltirish mumkin, bunda oqsillar elektr maydonida anod yoki katod tomon harakatlana olmaydi. Bu holat oqsilning izoelektrik nuqtasi deyiladi. Oqsil izoelektrik holatda bo‘lgan eritmaning pH ko‘rsatkichini shu oqsilning izoelektrik nuqtasi (IEN) deb ataladi. Oqsillar izoelektrik nuqtada eng beqaror holatda bo‘ladi. Turli ta’sirlar yordamida oqsillar eritmadan juda oson cho‘kmaga tushadi. Shu usul bilan turli biologik aralashmalardan oqsillarni toza holda ajratib olinadi. Ya’ni izoelektrik nuqtada oqsilni cho‘ktirish qulay hisoblanadi (4-jadval). 18 4-jadval Ba’zi oqsillarning izoelektrik nuqtasi Pepsin 1,0 Tuxum albumini 4,6 Ureaza 5,0 Gemoglobin 6,8 Mioglobin 7,0 Ximotripsinogen 9,5 Sitoxromoksidaza 10,65 Lizotsim 11,0 Oqsillar kimyosida «oqsillar izoion nuqtasi» degan tushuncha bor. Oqsil eritmasi molekulasidagi ionlangan aminokislota qoldiqlari va suv dissotsiatsiyalanishidan hosil bo‘lgan ionlardan boshqa ionlarni saqlamasa oqsil eritmasi izoion deb ataladi. Oqsilni boshqa ionlardan tozalash uchun uni anion va kation almashinuvchi kolonkalardan o‘tkaziladi. Ushbu oqsilning izoion nuqtasi deb shu oqsil izoion eritmasining pHiga aytiladi: [H]+ + [P]Z=[OH]- , bunda [P]- oqsil molyar konsentratsiyasi, Z – molekulaning o‘rtacha zaryadi. Bu tenglamaga ko‘ra, oqsilning izoion nuqtasi uning konsentratsiyasiga bog‘liq. Oqsillar zaryadiga qarab elektr maydonida turli qutblarga harakatlanishiga elektrofez deyiladi. Elektrofez yordamida oqsillar aralashmasidagi oqsillarni (aminokislotlarni) bir-biridan ajratish mumkin. Eritmadagi oqsil molekulalari neytral bo‘lsa tuzlarning yuqori konsentratsiyali eritmalari ta’sirida o‘zining suv qobig‘ini yo‘qotib cho‘kmaga tushiriladi. Hosil bo‘lgan cho‘kmani toza erituvchida yarim o‘tkazgich membrana orqali ajratib olish mumkin va shundan so‘ng tuzdan ajralgan oqsil qaytadan eriydi. Tuzlar eritmasi ta’sirida oqsillarning cho‘kishini ularni tuzlanishi deyiladi. Tuzlar yordamida oqsillar cho‘ktirilganda oqsillarni fizik va biologik xossalari saqlanib qoladi. Shu xossasidan foydalanib aralashmalardan toza holda oqsillarni ajratib olinadi. Albuminlar ammoniy sulfat tuzining to‘la to‘yingan eritmasida cho‘kmaga tushadi. Globulinlar esa yarim to‘yingan ammoniy sulfat eritmasida cho‘kadi. Tuzlash usuli bilan oqsillar fraksiyalarini ajratib olish farmatsiya sanoatida keng qo‘llanadi. 19 Oqsillarning tuzilishi Rus olimi A.Ya.Danilevskiy va nemis bioximigi E.Fisher va boshqalar tomonidan oqsil molekulasidagi aminokislotalar o‘zaro peptid (-CO-NH-) bog‘i yordamida birikib polipeptid hosil qilishi aniqlangan. Shunga asosan ikki molekula aminokislotadan dipeptid hosil bo‘ladi. Dipeptid molekulasidagi erkin amino- yoki karboksil guruhlari yana uchinchi aminokislota molekulasini biriktirib tripetid hosil bo‘ladi: Tripeptidga yana bir molekula aminokislota birikib tetrapeptid, beshinchi aminokislota birikib pentapeptid hosil bo‘ladi. Shu yo‘l bilan geksapeptid va polipeptidlar hosil bo‘lishi mumkin. Oqsil molekulasining tuzilishi to‘g‘risida juda ko‘p gipotezalar taklif qilingan. Bulardan ko‘pchilik biokimyog‘arlar polipeptid nazariyasini qabul qilganlar. Polipeptid nazariyasi birinchi bo‘lib, 1902-yilda rus olimi A.YA. Danilevskiy va nemis olimi E. Fisher tomonidan yaratilgan. Bu nazariyaga binoan oqsil molekulasida aminokislotalarni o‘zaro peptid bog‘i yordamida birikib polipeptid zanjirni tashkil qiladi. Bu nazariyani isbotlash uchun E.Fisher va E.Abdergalden sintetik polipeptidlar tayyorlab ularni fizik-kimyoviy xossalarini o‘rgangan va sintetik polipeptidlar va oqsillar o‘rtasida o‘xshashlik borligini aniqlashgan. Aminokislota qoldiqlarida erkin holda amin, karboksil, gidrooksil, fenol, amid va boshqa guruhlari mavjuddir. Shu sababli bu guruhlar polipeptid zanjirlarining fazoviy konfiguratsiyasiga (shakllanishiga) juda katta ta’sir ko‘rsatadi. 20 Hozirgi vaqtda oqsillarning to‘rt xil struktura darajasi borligi aniqlangan: Birlamchi strukturasi. Ikkilamchi strukturasi. Uchlamchi strukturasi. To‘rtlamchi strukturasi. Oqsillarning birlamchi strukturasi Oqsillarning birlamchi strukturasi deb, aminokislotalarni polipeptid zanjirida ketma-ket joylanish tartibiga aytiladi. Oqsilning birlamchi strukturasi aminokislotalarning sifat va miqdoriga bog‘liq bo‘ladi. Birlamchi struktura asosini peptid bog‘lari tashkil etadi. Peptid bog‘larining o‘ziga xos xususiyatlari bo‘lib, ya’ni ulardagi hamma atomlar bog‘larining bir tekislikdaligi bo‘ladi (3-rasm, a, b). Ular ikki xil shaklda, ya’ni keto- hamda yenol- shakllarida bo‘ladi. 3-rasm. A. Peptid sintezi B.Peptid bog‘i mezomeriyasi Undan tashqari aminokislotalar sis- va trans- izomer shaklda ham uchraydi. Fazoda aminokislotalar o‘zaro vodorod bog‘i hosil qilish xossasiga ega. Oqsil molekulasida polipeptid zanjirining -NH2 tutgan oxiriga N- oxiri va -COOH tutgan oxiriga esa C-oxiri deb ataladi. N - oxirgi aminokislota qoldig‘ini Sanger va Edman usullari bo‘yicha oqsil dinitroftorbenzol (DNFB) bilan reaksiyaga kiritiladi. Bu reaktiv erkin holdagi aminoguruh bilan reaksiyaga kirishadi va DNF-oqsil birikmasini hosil qiladi. 21 Hosil bo‘lgan DNF-oqsil gidrolizlanganda N-oxirgi aminokislota qoldig‘i ajralib chiqadi. Shunday qilib, oqsilning birlamchi strukturasini o‘rganish mumkin. Edman usuli bo‘yicha oqsil fenilizotiotsionat reaktivi bilan reaksiyaga kiritiladi. Fenilizotiotsianat oqsilning N - oxirgi aminokislotasi bilan birikadi. 22 Hosil bo‘lgan birikmaga suvsiz HCl ta’sir ettirilsa oxirgi aminokislota feniltiogidantoinga aylanadi. Oqsil molekulasining qolgan qismi erkin holda ajralib chiqadi. C-oxiri aminokislota qoldig‘ini aniqlashda yapon olimi Akabori tomonidan gidrazinoliz usuli taklif etilgan. Bu usul bo‘yicha oqsilga gidrazin ta’sir etib, hosil bo‘lgan birikmani dinitrobenzol bilan reaksiyaga kiritiladi. Hosil bo‘lgan aminokislota gidrozidi ikki molekula DNFB bilan va C-oxiri aminokislota esa bir molekula DNFB bilan birikadi. DNF aminokislota gidrazidi DNF aminokislotadan sirka - etil-efir yordamida ekstraksiya qilib ajratib bo‘linadi. DNF-aminokislota xromatografik usul bilan aniqlanadi. Oqsillardagi C-oxirgi aminokislotani karboksipeptidaza fermenti yordamida aniqlanadi. N- va C-oxirgi aminokislotalar aniqlangandan keyin ularning miqdoriga qarab oqsil molekulasi polipeptid zanjiridagi aminokislotalar soni aniqlanadi. Oqsil molekulasidagi polipeptid zanjiri yoyilgan hamda o‘ralgan holda bo‘ladi. O‘ralgan polipeptid zanjirini ayrim qismlari o‘zaro disulfid (S-S) bog‘i yordamida bog‘lanadi (4-rasm). Masalan: ribonukleaza bitta polipeptid zanjirdan tashkil topgan oqsil bo‘lib, 4 joyidan disulfid bog‘lar orqali bog‘lanadi. Disulfid bog‘lar oksidlanish va qaytarish reaksiyasi yordamida isbotlanadi. 23 4-rasm. RNKazaning birlamchi strukturasi. Qora bilan disulfid bog‘lar ko‘rsatilgan Disulfid bog‘lari uzilgandan keyin polipeptidlar qisman gidrolizlanadi. Bunda fermentlardan foydalaniladi. Proteolitik fermentlardan tripsin arginin yoki lizinning karboksil guruhi ishtirokida hosil qilgan peptid bog‘larini uzsa, pepsin aromatik (fenilalanin yoki tirozin) yoki monoaminodikarbon (aspartat va glutamat) kislotalar hosil qilgan peptid bog‘larni uzadi. Hosil bo‘lgan peptidlar aralashmasi ajratib alohida analiz qilinadi. Bunda xromatografiya yoki elektroforez usullaridan foydalaniladi. Oqsillarning ikkilamchi strukturasi Polipeptid zanjirining fazoviy konfiguratsiyasiga, α-spiral yoki βstrukturasini hosil qilishi, oqsillarni ikkilamchi strukturasi deyiladi. Polipetid zanjirining hamma qismi bir xilda spirallangan bo‘lmay oz qismi to‘g‘ri amorf holda bo‘lishi mumkin. Oqsillarning ikkilamchi strukturasi polipeptid molekulasining fazodagi konfiguratsiyasini (joylashuvini) belgilaydi. 24 Oqsil molekulasining ikkilamchi strukturasi hosil bo‘lishida karbonil va imid guruhlari o‘rtasida vodorod bog‘lari hosil bo‘lishi ahamiyatlidir. Vodorod bog‘lari kovalent bog‘lanishga nisbatan kuchsiz bo‘lib, ular sonining ko‘p bo‘lishi natijasida hosil bo‘lgan spiral prujinadek mustahkam saqlashga imkon beradi. Oqsilning ikkilamchi strukturasi ikki tipga bo‘linadi α−spiral, β−burmalik (qavat-qavat ko‘rinishida) struktura (5-6-rasm). 5-rasm. a-spiral stukturasi va o‘lchamlari 25 6-rasm. Polipeptid zanjir b-strukturasi Polipeptid zanjir α-spiral va β-struktura ko‘rinishida bo‘lishini Poling va mualliflar rentgen struktura analizi yordamida aniqladilar. αspiral o‘ng va chap tomonga buralgan holda bo‘lishi mumkin. Polipeptid zanjirning α-spirallanishida har bir aylanishiga 3,6ta aminokislota qoldig‘i to‘g‘ri keladi. Spiral qismining to‘liq takrorlanishi 18 ta aminokislota qoldig‘idan keyin ro‘y beradi. Ularning uzunligi 0,5 nm va 2,7 nmga teng va har bir aminokislota qoldig‘i to‘g‘ri keladigan masofa 0,15 nm ga teng. Oqsil molekulasining β-strukturasi polipeptid zanjiri yonma-yon joylanishi natijasida hosil bo‘ladi. Vodorod bog‘lari parallel yoki antiparallel holda joylashgan polipeptid zanjirining peptid bog‘lari o‘rtasida hosil bo‘ladi. Natijada polipeptid zanjirlari takrorlanib qavatma-qavat bo‘lib joylashadi. Oqsillarda alfa-strukturadan β-strukturaga o‘tishi mumkin va u holda vodorod bog‘lari qayta tuzilishi mumkin. Bu holat sochdagi keratin oqsilida kuzatilgan. Agar sochlarni ishqoriy eritmalar bilan yuvilganda oqsilning strukturasi buziladi. β-keratin alfa-keratinga aylanadi. Oqsilning ikkilamchi strukturasi (α-spiral va β-struktura) qizdirish natijasida buziladi. Bunda polipeptidlar o‘rtasidagi vodorod bog‘lari uzilib, polipeptid zanjiri esa tartibsiz holatga keladi. Shunday qilib, oqsilning ikkilamchi strukturasining turg‘unligi vodorod bog‘lari yordamida ta’minlanadi. Bundan boshqa bog‘lar (disulfid bog‘idan tashqari) ishtirok etmaydi. Ko‘pchilik oqsillarda bir vaqtda α-spiral va β-strukturali qismlari bo‘ladi. 26 Oqsillarning biologik xususiyatlari (ferment, gormon, antitela, antigen va boshqalar) ularning ikkilamchi va uchlamchi strukturalariga bog‘liq bo‘lib, ular nativ konformatsiyasi deb ataladi. Oqsil molekulasining uchlamchi strukturasi funksional konformatsiyani saqlaydi, uni akad. V.A. Engelgard intramolekulyar axborot deb nomlagan. Oqsillarning uchlamchi strukturasi Oqsilning uchlamchi strukturasi deb spiral ko‘rinishidagi polipeptid zanjirning ma’lum hamda globulyar (sharsimon) yoki fibrillyar (ipsimon) struktura hosil qilishiga aytiladi. 7-rasm. Mioglobin molekulasining uchlamchi strukturasi (Kendryu bo‘ycha) Polipeptid zanjirining uzunligi spiral hosil qilgandan so‘ng 4 marotaba qisqaradi (7-rasm). Oqsillarning uchlamchi strukturasi kuchli (kovalent) va kuchsiz (qutbli, ion, van-der-vaals) bog‘lar yordamida mustahkam ushlab turiladi. Kovalent bog‘lariga disulfid (-S-S-), izopeptid yoki psevdopeptid bog‘lari kiradi. Ularga liz, arg aminogruppasi bilan yon radikallari orasidagi bog‘lar kiradi. Kovalent 27 bo‘lmagan bog‘larga vodorod va ion bog‘lari kiradi. Vodorod bog‘lari aminogruppalar bilan aminokislotalar radikali orasida va karboksil gruppa bilan boshqa aminokislota orasida vujudga keladi. Ionli yoki elektrostatik bog‘lanish esa liz, arg, gis zaryadlangan guruhi bilan yon radiakallari, val, asp, glutaminning – COO- orasida hosil bo‘ladi. Polipeptid zanjirini uchlamchi struktura konformatsiyasini oqsilning xossasiga, aminokislota radikallarining xossasiga va atrofmuhit sharoitiga qarab aniqlanadi. Oqsillarning polipeptid bog‘larini joylanishida energetik qulay shakliga o‘tishi qabul qilingan bo‘lib, oz miqdorda erkin energiya hosil bo‘lishiga asoslangan. Shuning uchun qutbsiz radikallar suvdan uzoqlashib oqsilning ichki uchlamchi struktura shaklini hosil qiladi. Ular asosan oqsil strukturasini ichiga joylashgan bo‘ladi. Qutbli (gidrofil) aminokislota qoldiqlari oqsil strukturasining tashqi qavatida joylashadi va suv molekulalari bilan birikkan holda bo‘ladi. Oqsil tarkibida prolin va gidroksiprolin aminokislotalar bor joyi zanjirning kuchsiz nuqtasi bo‘lgani sababli bukiladi yoki sinadi. Zanjirdagi bu aminokislotalar ko‘proq harakatchan bo‘lib, boshqa polipeptid guruhlar bilan yakka vodorod bog‘i hosil qiladi. Boshqa egilgan joyda glitsin bo‘lib R-guruhda vodorod kam bo‘ladi. Shuning uchun boshqa aminokislotalarning R-gruppasi fazoviy bukilishiga, ya’ni glitsin turgan joyga boshqa radikal guruhi joylanishiga harakat qiladi. Ala, ley, gis kabi bir qancha aminokislotalar oqsilning spiral strukturasini mustahkam saqlashda ishtirok etadi. Met, ile, asp aminokislotalari esa β−struktura hosil qilishda qulaylik keltiradi. Oqsilning molekulasining uchlamchi strukturasida α−spiral (spirallashgan), β−struktura (qavatma-qavat) va tartibsiz joylashgan qismlari bo‘ladi. Faqat oqsilning to‘g‘ri fazoviy joylanishi oqsilning faolligini oshiradi, uni buzilishi esa oqsil xossasini o‘zgarishiga olib keladi va biologik faolligini yo‘qolishiga sabab bo‘ladi. Sitoxrom C,lizotsim, ribonukleazalar uchlamchi strukturasi bilan farq qiladi. Ularning polipeptid zanjiri har xil α−spiral segmentlari va β− struktura qismlari bo‘ladi. Oqsillarning to‘rtlamchi strukturasi Ba’zi oqsil molekulalari bir necha polipeptid zanjirdan iborat bo‘lib, ular subbirliklar yoki protomerlar deb nomlanadi. Har bir protomer o‘ziga xos birlamchi, ikkilamchi va uchlamchi strukturalariga ega. Protomerlar va ular qismlarining bir-biriga nisbatan fazoda joylashuvi oqsil molekulasining to‘rtlamchi strukturasi deb nomlanadi. 28 Ayrim oqsillar to‘rtlamchi strukturasida protomerlar globulyar ko‘rinishda bo‘ladi. 8-rasm. Gemoglobin modeli (Perutts bo‘ycha) α-zanjinlar; β-zanjinlar qora Masalan: gemoglobin oqsili molekulasida polipeptid spirallari vintsimon simmetrik holda birlashgan bo‘ladi (8-rasm). To‘rtlamchi strukturaga gemoglobin, tamaki virusi oqsili, RNKpolimeraza, laktatdegidrogenaza, katalaza va boshqalar ega bo‘ladi. Demak, birgina polipeptid zanjiridan iborat bo‘lgan oqsil molekulasi to‘rtlamchi strukturaga ega bo‘la olmaydi. To‘rtlamchi strukturaga ega bo‘lgan oqsil molekulasiga oligomer oqsil deyiladi. Masalan: gemoglobin molekulasi (M=64500) 4ta subbirlikdan yoki polipeptid zanjirlaridan tashkil topgan. Bu polipeptidlarning har biri birlamchi, ikkilamchi va uchlamchi strukturaga egadir. To’rtta polipeptid zanjirining har ikkitasi bir xil birlamchi strukturaga ega, shuning uchun ikkita α va ikkita β -polipeptidlar gemoglobin molekulasini to’rtlamchi strukturasini hosil qiladi. α -polipeptid zanjirida 141, β−polipeptid zanjirida esa 146 ta aminokislotalar qoldig’i joylashgan. Gemoglobin oqsili globulyar konfiguratsiyada bo’ladi. Oqsillarning to‘rtlamchi strukturasining hosil bo‘lishi Turli subbirliklarni o‘zaro tutashib turishini aminokislotalar qoldiqlarini qutbli guruhlari ta’minlaydi. Qutbli guruhlar orasida ionli, vodorodli, ayrim vaqtlarda disulfidli bog‘lar hosil bo‘lib, subbirliklar 29 o‘zaro mustahkam bog‘lanadi. Vodorod bog‘ini uzuvchi moddalar ta’sirida, disulfid bog‘larini qaytaruvchi moddalar ta’sirida protomerlar dezagregatsiyaga uchraydi va oqsilning to‘rtlamchi strukturasi buziladi. Oqsil multimerlari (oligomerlari) ko‘pincha juft sonli protomerlardan tuziladi. (2 dan 4 gacha oz miqdorda, 6 dan 8 gacha, 10, 12 gacha va hk.). Natijada massasi har xil bo‘lgan molekulalar hosil bo‘lib bir necha ming, hattoki 100000 Dga teng bo‘ladi. To‘rtlamchi strukturaga ega bo‘lgan gemoglobin 4 subbirlikdan, piruvatdegidrogenaza kompleksi 72 subbirlikdan, RNK-polimeraza 5 subbirlikdan, LDG – 4 subbirlikdan iborat bo‘ladi. Ikkilamchi, uchlamchi va to‘rtlamchi strukturalar birlashib makrostruktura yoki oqsillarning konformatsiyasi, oqsillarning fazoviy strukturasini tashkil etadi. Oqsillarning denaturatsiyasi. Qaytar va qaytmas denaturatsiya Oqsillarni tabiiy xossalarini (eruvchanlik, elektroforez harakati, fermentativ, gormonal, immunofaollik) turli fizik va kimyoviy ta’sirlar natijasida buzilishiga (yo‘qolishiga) denaturatsiya deyiladi. Denaturatsiya natijasida oqsil molekulasining fazoviy konformatsiyasi, ya’ni ikkilamchi, uchlamchi va to‘rtlamchi strukturasi buziladi, ammo birlamchi strukturasi saqlanib qoladi. Denaturatsiya natijasida oqsilning peptid zanjiri uzilmaydi, asosan disulfid va vodorod bog‘lari uziladi. Denaturatsiya o‘z yo‘nalishiga binoan ikki xilga bo‘linadi: qaytar va qaytmas. Qaytmas denaturatsiya ta’sir etuvchi omil ta’siridan so‘ng oqsil o‘z nativ strukturasini tiklay olmaydi. Masalan: tuxum oqsili qaynatilgandan so‘ng, kuchli kislota yoki ishqor ta’sir etilganda sodir bo‘ladi. Qaytar denaturatsiya deb ta’sir etuvchi omil ta’sirini to‘xtatgan holatimizda oqsil o‘z tabiiy xususiyatlarini tiklaydi. Masalan: neytral tuzlar ta’sirida oqsil eruvchanligi yo‘qolib cho‘kmaga tushadi. So‘ng dializ usulidan foydalanib tuzni yo‘qotsak, oqsil qayta xossalarini tiklab, eruchanligi tiklanadi. Oqsillarni denaturatsiyalovchi omillar ikkiga bo‘linadi: 1. Fizik omillar: qizdirish (t0 -50-600 C dan yuqori) bosim, muzlatish, ultratovush va boshqalar. 30 2. Kimeviy omillar: a) H+ ,OH- ionlari ta’siri odatda moddalarning pH 4 dan past, 10 dan yuqori bo‘lganda oqsil denaturatsiyasi kuzatiladi: a) organik erituvchilar (spirt, atseton, xloroform); b) siydikchil va og‘ir metallar tuzlari ta’sirida; c) xona haroratida oqsillar quritilganda ular denaturatsiyaga uchraydi. Denaturatsiya natijasida oqsil molekulasi dumaloq, koptoksimon shakldan cho‘zilib ipsimon shaklga aylanadi va agregatsiyaga uchraydi. Agregatlar o‘zaro birikib, katta agregatga aylanib cho‘kmaga tushadi. Denaturatsiyalovchi omilning ta’siri to‘xtatilsa ba’zi oqsillar qisman yoki umuman o‘z tabiiy holatiga (nativ holatiga) qaytadi. Bunday holat oqsilning renaturatsiyasi deyiladi. Buni ribonukleaza oqsili misolida kuzatish mumkin. Denaturatsiyadan keyin ma’lum vaqt o‘tishi bilan ribonukleaza fermenti kislorod ta’sirida o‘zining boshlang‘ich faolligiga ega bo‘ladi va bunda disulfid bog‘lari o‘z holiga qaytadi. Oqsil denaturatsiyasining oldini olish uchun fermentlarni ajratib olish va saqlash past temperaturada olib boriladi (00 -40 C). Oqsillarni denaturatsiyaga uchrashdan saqlash uchun turli kimyoviy moddalar qo‘llaniladi (oddiy shakar, glitserin, organik moddalar). Oqsillarni ajratib olish va tozalash Oqsillarni hayvonlar to‘qimasidan, makroorganizmlardan maxsus usullar yordamida ajratib olinadi. 1. Oqsillarni ajratib olishda gomogenizatsiya usuli. Oqsillarni hayvonlar to‘qimasidan, makroorganizmlardan ajratib olish uchun avvalo to‘qimalar yaxshilab maydalaniladi, ya’ni gomogenizatsiyalanadi. Bunda hujayra strukturasi buziladi oqsillar eritmaga o‘tadi. Gomogenizatsiya qilish uchun quyidagi usullardan foydalaniladi: 1. Chinni hovonchada to‘qimani qum bilan ezish (maydalash). 2. Potter-Elvegay gomogenizatorida maydalash. 3. Sharsimon tegirmonchalarda maydalash. 4. Kuchli ravishda muzlatib, keyin eritish yo‘li. 5. Ultratovush ta’sirida maydalash. 6. Bosim ta’sirida (muzlatilgan to‘qimani mayda teshikli po‘lat to‘rdan o‘tkazish). 31 7. Azot gazi yordamida (azot gazini bosim ostida to‘yintiriladi keyin keskin bosim pasaytiriladi. Natijada azot hujayrani oson parchalab oqsilni eritmaga o‘tkazadi). Yuqoridagi usullar bilan hosil qilingan gomogenatdan oqsillarni ajratib olish uchun ekstraksiya usulidan foydalaniladi. Olingan gomogenatni 8-10% li tuz eritmasida eritiladi. Oqsillarni ekstratsiyalash uchun ko‘pincha ma’lum pHga ega bo‘lgan bufer eritmalardan, organik erituvchilardan va ionsiz detergentlardan foydalaniladi. Bu maqsadda organik moddalardan ko‘pdan beri ishlatib kelinadigan eritmalar – glitserinning suvdagi eritmasi, saxaroza eritmasi, limon kislota va borat bufer aralashmalar, tris-bufer eritmalardan foydalaniladi. Qon zardobi oqsilini ajratish uchun etil spirti, atseton, butil spirti ta’sirida cho‘ktiriladi. Gomogenatdan toza holda oqsillarni olish uchun har xil detergentlar ishlatiladi. Ular oqsil-yog‘ kompleksini va oqsiloqsil bog‘larini yaxshi parchalaydi. Oqsillarni (fermentlarni) tozalashda mitoxondriya biomembranasi bilan yoki hujayra organoidlari bilan mustahkam birikadigan modda triton X-100, natriy dodetsilsulfat va natriy dezoksixolat ishlatiladi. Bu detergentlar oqsiloqsil komplekslarini parchalaydi va oqsillarning to‘rtlamchi strukturasini buzadi. Oqsillarni fraksiyalash yo‘li bilan ajratish Oqsillar ekstratsiya qilingandan so‘ng ekstraktni sentrifugalash yordamida to‘qima elementlaridan tozalaniladi va eritmaga o‘tgan oqsillarni fraksiyalash yo‘li bilan ajratiladi. Hozirgi paytda quyidagi usullar bilan oqsillar fraksiyalarga ajratiladi: tuzlar ta’sirida cho‘ktirish, issiqlik ta’sirida denaturatsiyalash usuli, organik erituvchilar yordamida cho‘ktirish, xromatografiya, gelfiltratsiya, elektroforez, ultratsentri-fugalash usullari. Oqsillarni tuzlar ta‘sirida cho‘ktirib ajratish Oqsillarni ishqoriy va ishqoriy yer metall tuzlari ta’sirida cho‘ktirib fraksiyalanganda ular o‘z xossalarini saqlab qoladi, chunki dializ yoki gelfiltratsiya usuli bilan oqsil cho‘kmasidan tuzlar ajratib olinsa, oqsil eritmaga o‘tadi. Bu usul biologik faollikka ega bo‘lgan fermentlarni ajratib olishda katta ahamiyatga egadir. 32 Klinik laboratoriyalarda qon zardobidan globulin oqsillarini ammoniy sulfatning yarim to‘yingan eritmasi, albumin oqsillarini to‘yingan eritmasi yordamida ajratib olinadi. Tuzlar bilan oqsilni cho‘ktirishda oqsilning tabiati tuzlarning konsentratsiyasi hamda eritmani pH va temperatura ahamiyatga ega bo‘ladi. Dializ usuli Yuqori molekulali moddalarni past molekulali moddalardan yarim o‘tkazgich membranalar yordamida ajratish usuliga dializ deyiladi. Dializ usuli kolloid zarrachalarni yarim o‘tkazgich membranalardan o‘tmasligiga asoslangan. Yarim o‘tkazgich membranalarga kollodiy, sellofan, pergament qog‘ozlari misol bo‘ladi. Inson va hayvon organizmida buyrakdagi Boumen – Shumlyanskiy kapsulasining pardalari ham yarim o‘tkazuvchandir. Dializ uchun ishlatiladigan asbobni dializator deyiladi. Oddiy dializator sifatida kollodiy va sellofan qopchasi ishlatiladi. Cho‘ktirib ajratilgan oqsil cho‘kmasini kollodiy yoki sellofan xaltachasiga joylab, distillangan suv solingan idishga tushiriladi. Bunda vaqt o‘tishi bilan kichik molekulali moddalar (tuzlar) xaltacha tashqarisidagi distillangan suvga chiqadi. Oqsil esa yarim o‘tkazuvchi parda teshikchalaridan o‘tolmaydi va xaltacha ichida qoladi. Oqsillar aralashmasini ion almashuvchi, adsorbsiyalovchi xromatografiya, gelfiltratsiyalash va afin xromatografiya yordamida ham fraksiyalarga ajratiladi. a) Ion almashuv xromatografiyasi. Bu usulda ikki xil ion almashtiruvchi adsorbentlar sifatida ishlatiladi. 1. Kuchli va kuchsiz asosli anion almashtiruvchilar. Bularga polistrol va sellyuloza hosilalari kiradi. 2. Kation almashtiruvchi polistirollarga sulfat birikmalari va karboksilmetilsellyuza kiradi. Ion almashtiruvchi moddalarni kolonkaga (uzun shisha naycha) solib kuchsiz kislota yoki asos bilan yuviladi. So‘ngra oqsil eritmasi o‘tkaziladi. Bunda oqsil molekulasi anion yoki kation gruppalarga bo‘linishi natijasida oqsillarni tuzlarning turli pHli eritmasi yordamida ajratib olinadi. 33 b) Adsorbsion xromotografiya. Bu usulda adsorbent sifatida faollashtirilgan ko‘mir va alyumin oksidi ishlatiladi. Adsorbent kolonkaga solinib, erituvchi quyiladi va oqsil eritmasi qo‘shiladi, bunda oqsil adsorbent bilan birikadi. So‘ngra oqsil fraksiyalari turli pH li bufer eritmalari yordamida ajratib olinadi. Oqsillarni fraksiyalarga ajratishda taqsimlanuvchi xromatografiya usulidan foydalaniladi. Taqsimlanish xromatografiyasi adsorbsion xromatografiyani turi bo‘lib, adsorbent sifatida xromatografiya qog‘ozi, kraxmal, silikagel va boshqalar ishlatiladi. d) Gel xromatografiyasi. Bu usulda har xil gellar ishlatiladi, masalan: dekstrandan tayyorlangan, turli markadagi sefadekslar, dekstran – yuqori molekulali glyukoza qoldiqlaridan tarkib topgan polimer moddadir, uni ishqoriy muhitda epixloridgidrin bilan reaksiyaga kiritilsa, gel hosil bo‘ladi. Poliakrilamid gelini hosil qilish uchun suvda yaxshi eriydigan monomer akrilamid olib bu funksional reagentlar ishtirokida polimerlashtiriladi. Oqsillarni molekulalari katta yoki kichikligiga qarab gelxromatografiya kolonkasiga gel to‘ldirilib undan oqsillar aralashmasi o‘tkazilsa avvalo, kichik molekulali oqsillar gel g‘ovaklari orqali, gel zarrachasining ichiga kirib diffuziyalanadi. Yirik molekulali oqsillar bu g‘ovakchadan o‘tolmaydi, ular zarrachaning tashqarisida qoladi va eritma bilan kolonkadan oqib chiqadi. e) Afin xromatografiya. Bu xromatografiya usulli quyidagi prinsiplarga asoslangan bo‘ladi: ajratib olinishi lozim bo‘lgan oqsilga spetsifik bo‘lgan modda Zligandda erimaydigan M moddasiga mustahkam qilib biriktiriladi. Shunday qilib, tayyorlangan MZ-adsorbenti xromatografiya kolonkasiga solinadi va u orqali oqsil aralashmasi o‘tkaziladi. Bunda P oqsili spetsifik adsorbent bilan birikadi. MZ+P=MZP. So‘ngra kolonka yaxshilab yuviladi va birikkan P-oqsilining birikmasini dissotsiatsiya qiluvchi eritma bilan ajratib kolonkadan chiqariladi.