A. A. Ibragimov, V. U. Xo’jayev, O. M. Nazarov bioorganik kimyo
Yüklə 162,73 Kb. Pdf görüntüsü
|
|
parchalanadi
, so’ngra maxsus usullar bilan monomerlar aniqlanib,undan foydalanib butun zanjir ketma-ketligi tuziladi. Tarkibi aniqlangan birinchi nuklein kislota hamirturushdan olingan alanin bulib, uni 1965 yilda R.Xolli aniqlagan. va ni parchalovchi fermentlar nukleazalar deb ataladi. Restriksion endonukleazalar mikroorganizmlardan olinib, prokariot hujayralarni yot dan himoya qiladilar. Dezoksiribonukleaza I va II qora ( va ) molni oshqozon bezi ostidan olinadi. va bir va ikki zanjirli ni parchalaydilar. Shu bilan bir qatorda Ye. Coli dan olingan ekzonukleaza va ham ni parchalashda qo’llaniladi. ni parchalovchi fermentlar ribonukleazalarga ( ) ribonukleaza va ribonukleaza lar kiradi. Polinukleotid tarkibini aniqlash. Nuklein kislotalarni birlamchi tuzilishini aniqlashning barcha zamonaviy usullarida va oxirgi qismlariga radioaktiv nishonlarni kiritish birlamchi vazifadir. Asosan oxirgi nishon sifatida 32 P tutuvchi fosfat guruhi qqllanadi. Nishonlangan fosfat guruhlarini -oxirgi nukleotidga kiritish uchun polinukleotidkinaza fermenti va radioaktiv reagent sifatida holatda nishonlangan fosforga ega ) ishlatiladi: 114 Birlamchi tuzilishini aniqlashni eng samarali usullaridan biri Maksam - Gilbert usuli bo’lib, 1977 yilda W.Gilbert va A.Maxam tomonidan taklif etilgan. Bu usul to’liqsiz o’ziga xos kimyoviy parchalash usuli deb atalib, nishonlangan oxirgi mahsulotlar polinukleotidni bitta monomeri bo’yicha o’ziga xos parchalash natijasida hosil qilinadilar. Parchalash to’liqsiz modifitsirlash sharoitlarida amalga oshiriladi va turli mahsulotlar bilan bir qatorda nishonlangan oxirgi oligo- va polinukleotidlar ham hosil bo’ladi. Ular o’z navbatida radioavtogrammalarda aniqlanadilar. Bu usulni turli variantlari bo’lib, ulardan biri bilan tanishib chiqamiz. Misol tariqasida quyidagi oligonukleotidni olamiz: - C A. ni guanozin bo’yicha parchalash bilan amalga oshiriladi. So’ngra yuqori haroratda piperidin bilan ishlov beriladi. Model tariqasida olingan oligonukleotiddan reaksiya natijasida G bo’yicha parchalangan quyidagi nishonlangan oligonukleotidlar hosil bo’ladi: - - - - - va - - - - - - B. adenin bo’yicha parchalash usuli yo’qligi sababli zanjir purin halqalari bo’yicha parchalanadi. Buning uchun qisqa muddat ichida bilan, so’ngra piperidin bilan ishlov beriladi va namuna dezoksiriboza qoldiqlari bo’yicha parchalanadi. Model oligonukleotiddan quyidagi nishonlangan mahsulotlar hosil bo’ladi: C. Tsitozin bo’yicha parchalash ni yuqori konsentrasiyatsili eritmasi va gidrazin bilan amalga oshiriladi, so’ngra modifikatsiya 115 mahsulotlari piperidin bilan ishlanadi. Quyidagi oligonukleotidlar hosil bo’ladi: D. Timidinni holatini aniqlash uchun pirimidin halqalar bo’yicha parchalanadi. Bu dastlab ni quyi konsentrasiyali eritmasi va gidrazin bilan so’ngra mahsulotni piperidin bilan ishlov berish natijasida amalga oshiriladi. Quyidagi birikmalar(yuqoridagi C holatdagi mahsulotlar bilan birgalikda) hosil bo’ladi. Barcha 4 reaksiya mahsulotlari poliakrilamid geldagi yonma-yon chuqurlarga solindi va elektroforez yordamida bo’linib, radioavtografirlanadi. Natijalarni tekshirish quyidagi ma’lum otlarga olib keladi: eng qisqa fragment va A+ G kolonkalarda bo’ladi; T + C kolonkada chizig’ni borligi va uni C da yo’qligi timidin bo’yicha parchalanishni ko’rsatadi; shunday tahlilni davom ettirib dastlabki oligonukleotid tuzilishi aniqlanadi. Bu usul yordamida bitta gelda 200 dan ortiq nukleotid ketma-ketligini aniqlash mumkin. G A+G T+C C 3 I + + C + + C + A + T + A |