Adli Tıp Analizlerinde lc-ms/ms aplikasyonları

Adli Tıp Analizlerinde LC-MS/MS Aplikasyonları
İdrar matrisinde LC-MS/MS ile Seçilmiş 15 adet Psiko-aktif maddenin izotop dilüsyon tekniği ile miktarlandırma analizi, aplikasyon Çalışması.

(Varian 320 MS Tandem Gold Triple Quadrupole LC-MS/MS Sistemi Kullanılmıştır.)
İçerik:

Psikoaktif İlaçlar beyin fonksiyonlarını, bilinç ve davranışları etkiliyen kimyasal maddelerdir.
Bu ilaçlar fiziksel ve ruhsal hastalıkların tedavisinde kullanılabilirler. Psikoaktif ilaçlar tedavi amaçlı kullanılıyor ise konsantrasyonlarının belirlenmesi çok önemlidir. Bu ilaçların belirlenmesi ve miktar tayinleri için UV ya da floresans spektrofotometre, immünolojik ve radyo-reseptör analizleri kullanılabilir.
Kütle spektrometresinin LC-MS, LC-MS/ MS, GC-MS gibi kromotografik sistemlerle birleştirilmesiyle sağlanan hassas ve seçici özelliklerinden dolayı daha uygundurlar.
Amfetamin, metafetamin, MDA, MDMA,MDEA, diazepem, morfin, kodein, kokain, alprozolam, unitrazepam, delta-9-THC, klonazepam, 6-MAM ve eroin gibi seçili 15 Psikoaktif ilaç organik bir ektraksiyon karışımı kullanılarak idrardan ekstrakte edilir .
Analizin kesinlik ve güvenilirliği için internal standart – izotop dilüsyon yöntemi tercih edilmiştir ve bunun için de her analitin döteryum işaretlisi olan iç-standart kullanılmış olup, her analit için belirlenen ve miktar tayini yapılan iyonlar ve iç standartlar ESI(+) iyonizasyon modu ile belirlenmiştir.

BEKLENEN DEĞERLER :
Psiko-aktif ilaç konsantrasyonu <50 ng/mL
HPLC Parametreleri :

Enjeksiyon Hacmi : 30 ul

Analiz Süresi: 13 dakika

Kolon Frını : Oda Sıcaklığı

Analitik Kolon: Dikma C18 İnspire, 150*2,1 , 3um
LC Gradient şartları :

Zaman (dk.)	% A	% B	Akış (ml/dk)
00:00	95	5	0.35
07:00	0	100	0.35
10:00	0	100	0.35
10:01	95	5	0.35
13:00	95	5	0.35

MS/MS Parametreleri:

Detector Voltage	+ 1600 V
Needle Positive Voltage	5000V
Needle Negative Voltage	(-)5000V
Spray Shield Voltage Positive	600
Spray Shield Voltage Negative	(-)600V
Spray Chamber Temperature	60 °C
Drying Gas Temperature	350°C
C.I.D Gas Pressure	2.35 mTorr
Nebulising Gas Presuure	55 psi
Drying Gas Pressure	35 psi

Numune Hazırlık Prosedürü:

Seçilmiş toplam 15 adet Psiko-aktif madde organik solvent yardımı ile idrar matrislerinden bazik ortamda ekstrakte edilir. (Çalışılacak hassasiyet seviyesine göre metotta uçurmalı yada uçurmasız yöntemler uygulanabilir.)

• 
  350 uL idrar örneği (veya standart) eppendorf tüpe alınır. İdrar numunesi berrak değilse, numune hazırlığından önce santrifüj edilir.
  
• 
  70 uL Reaktif 1 eklenir ve 10 sn boyunca vortekslenir.
  
• 
  150 uL Reaktif 2 eklenir ve 10 sn boyunca vortekslenir.
  
• 
  1,2 mL Reaktif 3 eklenir ve 10 sn boyunca vortekslenir
  
• 
  4000 x rpm’de 5 dakika boyunca santrifüj edilir.
  
• 
  1 mL üst faz bir viale alınıp cam uçurma tüplerine aktarılır.
  
• 
  Cam uçurma tüpleri 10 psi basınç altında N2 uçurma sistemine yerleştirilir.
  
• 
  Uçurma işlemi bittikten sonra 500 uL Reaktif 4 eklenir ve 20 sn boyunca vortekslenir.
  
• 
  1 dk ultrasonic banyoda bekletilir ve 20 sn boyunca vortekslenir.
  
• 
  30 μL numune LC-MS/MS sistemine enjekte edilir.
  

Psikoaktif maddelerin tespiti için kullanılan MRM geçiş değerleri :

Listede her bir psiko-aktif madde, döteryum işaretli iç standardı ve konfirmasyon iyonları ile birlikte belirtilmiştir.

Analit	ESI (Polarite)	Q1			Q3			Capillary (eV)			CE (eV)
	+
Amfetamin-1	+		136			91			50			16
Amfetamin-2	+		136			119			50			8
Metamfetamin-1	+		150			91			50			18
Metamfetamin-2	+		150			119			50			10
MDA-1	+		180			135			50			15
MDA-2	+		180			163			50			8
MDMA-1	+		194			135			50			18
MDMA-2	+		194			163			50			10
MDEA-1	+		208			135			50			20
MDEA-2	+		208			163			50			12
Diazepam-1	+		285			154			50			24
Diazepam-2	+		285			194			50			28
Morfin-1	+		286			165			50			36
Morfin-2	+		286			201			50			24
Kodein-1	+		300			165			50			38
Kodein-2	+		300			215			50			24
Kokain-1	+		304			150			50			22
KoKain-2	+		304			182			50			16
Flunitrazepam-1	+		314			239			50			32
Flunitrazepam-2	+		314			268			50			24
Delta-9-THC-1	+		315			123			50			30
Delta-9-THC-2	+		315			193			50			20
Klonazepam-1	+		316			214			50			34
Klonazepam-2	+		316			270			50			24
6-Acetilmorfin-1	+		328			165			50			34
6-Acetilmorfin-2	+		328			211			50			24
Eroin-1	+		370			165			50			40
Eroin-2	+		370			268			50			26
Amfetamin D6	+		142			128			50			8
Metamfetamin D5	+		155			121			50			10
MDA D5	+		185			138			50			16
MDMA D5	+		199			135			50			18
MDEA D6	+		214			166			50			12
Diazepam D5	+		290			198			50			28
Morfin D6	+		292			165			50			36
Morfin D6	+		292			201			50			24
Kodein D6	+		306			218			50			24
Kokain D3	+		307			153			50			22
Alprazolam D5	+		314			210			50			38
Delta-9-THC D3	+		318			123			50			30

Validasyon Sonuçları :

Analit		Doğrusallık (R2: 0-100 μg/L)		Geri Kazanım: (%)		LOQ (μg/L)	Kesinlik (%RSD; Intraassay):
Amfetamin		0,9993		99,24		0,90	2,5
Metamfetamin		0,9998		100,52		1,02	4,3
MDA		0,9975		96,32		0,26	2,6
MDMA		0,9991		98,52		0,39	2,2
MDEA		0,9998		98,74		0,23	3,4
Diazepam		0,9999		95,86		0,33	2,4
Morfin		0,9997		100,48		0,26	6,7
Kodein		0,9969		92,10		1,02	4,1
Kokain		0,9986		96,84		0,30	2,8
Alprazolam		0,9996		96,96		0,30	2,5
Delta-9-THC		0,9995		98,80		1,65	4,1
Klonazepam		0,9998		97,42		0,53	2,9
Flunitrazepam		0,9993		98,76		0,43	4,4
6-acetilmorfin		0,9986		99,12		0,26	2,3
Eroin		0,9987		98,10		0,40	6,3

Spike Yapılmış idrar numunesinde seçilmiş 15 adet Psiko-aktif bileşenin analizine ait Kromatogram Örneği :

(Spike Miktarı : 25 ppb (ug/L) her bir analit düzeyinde)